乙型肝炎表面抗原室内质控系统的建立
作者：谷娟娟 刘云霞 周小林 郭剑平 张伟
单位：中国辐射防护研究院生物技术研究所二室 太原 030000
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志000423 乙型肝炎是我国发病率较高的传染病之一，乙型肝炎的准确诊断和防治与所用诊断试剂质量密切相关。研制生产出高灵敏度、高特异性、质量稳定的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)诊断试剂，对乙型肝炎的早期诊治和阻断血液传播具有重要意义，我们参照国家质控标准品，标定并建立了室内HBsAg酶免试剂参考品，对进一步监测和提高诊断试剂的质量起到重要作用。
1 材料和方法
1.1 材料及来源 购自中国药品生物制品检定所的HBsAg阳性血清1份(80 ng/ml)，灵敏度血清4份(0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml)，特异性血清20份，精密性血清1份，不同亚型阳性参比品3份。所有血清均采自献血员，经放射免疫测定法(Radio-immunoassay RIA)检测筛选出HBsAg阳性血清8份，阴性血清58份。全部血清经56℃ 10 h灭活，3 000 r/min离心15 min，-20℃保存备用。HBsAg试剂盒分别为本实验室、上海科华和厦门新创公司生产。检测仪器为奥地利SLT-Ⅰ型酶标仪。
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1.2 灵敏度系列参比品的制备 将中检所80 ng/ml HBsAg阳性标准品和5份HBsAg阳性混合血清分别倍比稀释至最低检测限浓度，用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测，找出被标定血清与标准品相对应的吸光度A值，经3次重复实验后，反推标定血清的HBsAg含量，并以标定过的移液管、容量瓶及含保护剂的稀释液，将其准确稀释到与国家标准品相应的含量0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、100 ng/ml，经再次ELISA重复检测，确定其含量，经t检验，差异无显著性后分装，-20℃冻存备用，为本室HBsAg灵敏度质控参考品。
1.3 特异性标准血清的筛选 收集58份正常献血员血清，同时用三个不同厂家HBsAg试剂经ELISA法检测，选出平均A值在0.05～0.09之间的阴性血清，再经RIA试剂(北京生物制品研究所)检测HBsAg为阴性的20份血清，经中和试验确证为HBsAg阴性，分装-20℃冻存备用，作为本室HBsAg阴性特异性质控参考品。
, 百拇医药
1.4 阳性参比标准血清的筛选 选出3份阳性稀释终点在10～14万倍之间的HBsAg阳性高值血清，分装后-20℃冻存，作为本室HBsAg阳性质控参考品。
1.5 精密性标准血清的制备 将HBsAg阳性血清稀释到HBsAg含量接近临界值3 ng/ml，测定A值在0.2～0.3之间，并连续测定10孔，计算变异系数(CV值)，作为本室HBsAg精密性质控参考品。
1.6 HBsAg室内参考品的核验 以三个不同厂家HBsAg ELISA试剂，分别检测HBsAg国家标准品和标定的室内参考品，分析重复性、准确性和稳定性。
2 结果
2.1 室内参考品与国家标准品灵敏度的对比结果 见表1。标定后计算出5份HBsAg阳性混合血清HBsAg含量为70 μg/ml，将此混合血清稀释为灵敏度系列参比品，灵敏度以参比品HBsAg最小检出量表示，国家HBsAg灵敏度标准品有四个浓度，分别为0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml，对试剂灵敏度要求达到1 ng/ml为合格产品，从表1可看出，本室标定的参考品与国家标准品A值相近，经t检验，t值为2.604，小于t0.01(3)＝5.841，P>0.01，两者之间差异无显著性。
, 百拇医药
2.2 室内参考品与国家标准品线性相关性的比较 将中检所80 ng/ml标准品倍比稀释7孔至最低浓度0.313 ng/ml，本室标定的100 ng/ml参考品倍比稀释8孔至最低浓度0.39 ng/ml，做ELISA检测，根据HBsAg含量及测定的A值绘制曲线，观其拟合程度。结果，在低含量段即0.313～5 ng/ml之间拟合最佳，而后一段5～100 ng/ml本室参考品的A值比中检所的A值略高一些。因此在低含量段的灵敏度参考品标定比较准确。见图1。
2.3 三种国产试剂对特异性参考品的核验结果 经国家批批检定的三个厂家试剂对20份室内特异性参考品检测A值范围分别为：本实验室0.04～0.09，科华0.05～0.09，新创0.04～0.09，其中4份阴性高值血清，三个厂家检测结果A值均为0.08～0.09；比其他阴性血清A值略高，三种试剂对室内特异性参考品的检测结果无一例假阳性出现。
表1 不同浓度国家标准品与本室参考品ELISA测定结果(A值)
, 百拇医药
Tab.1 ELISA results of the National standard HBsAg reference sera and the
laboratory reference HBsAg sera (A value) 标准品
Reference sera
HBsAg含量(ng/ml)
HBsAg content(ng/ml)
0.2
0.5
1
2
国家标准品
, 百拇医药
National standard HBsAg reference sera
0.13
0.14
0.17
0.25
本室参考品
Laboratory HBsAg reference sera
0.11
0.16
0.18
0.27
, 百拇医药 P>0.01
2.4 不同厂家试剂对室内参考品的检测结果 用三种市售经“国家批批检定”合格试剂，同时检测本室建立的HBsAg参考品，检测结果与“国家批批检定”结果一致，结果见表2。
2.5 室内参考品在生产中的应用 室内HBsAg参考品建立以来，用HBsAg ELISA试剂常规生产的质量控制和监测，对控制和提高试剂质量起到至关重要的作用。1995年以来本室生产的11批HBsAg酶免试剂经“国家批批检定”，结果合格率100%，见表3。
3 讨论
诊断试剂质量好坏，直接影响临床检测结果的准确与否，因此建立一套室内参考品监测产品质量非常重要，其中灵敏度直接反映试剂盒的检测下限、灵敏度过低可造成HBsAg阳性病人的漏检；特异性标准品共20份，数量较多，目的是控制检测中真阴性检测结果，防止假阳性造成误诊给病人和家属带来不必要的思想负担；阳性参比品是防止一步法ELISA检测中高滴度HBsAg阳性标本漏检的重要参比标准；精密性则是检验诊断试剂重复性的重要指标，以评价试剂的批内精密性或重现性。
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在室内参考品标定制备过程中，对几个重要指标本着使用方便、准确的原则，采用严谨的实验方法，将室内参考的浓度直接稀释为工作浓度，使用时不再稀释以减少实验误差。
本室自建立室内参考品以来，始终用于日常室内质量控制工作，及时纠正生产和实验中各种因素造成的质量偏差，保证并提高了试剂的质量。1995年以来本室HBsAg酶免试剂连续11批参加批批国家检定，各项技术指标均达到或超过国家标准。其中9批产品灵敏度低于1 ng/ml的国家标准，达0.5～0.2 ng/ml；精密性符合<15%的国家标准；20份特异性血清未出现假阳性结果；3份不同亚型强阳性血清从未出现后带漏检现象，检定合格率达100%。
图1 室内参考品与国家标准品线性相关图
Fig.1 Linear correlation between laboratory reference HBsAg sera and
, http://www.100md.com
National standard HBsAg reference sera
表2 不同厂家试剂对室内参考品的检测结果
Tab.2 The laboratory HBsAg reference sera tested with HBsAg reagents of different factories 厂家
Factory
灵敏度(ng/ml)
Senstivity(ng/ml)
特异性(+/-)
Specificity(+/-)
阳性参比
, 百拇医药
Reference(-/+)
精密性(CV%)
Accuracy
本室
Laboratory
0.5
0/20
0/3
7.8
科华
Kehua
0.2
0/20
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0/3
8.2
新创
Xinchuang
0.5
0/20
0/3
9.6
表3 连续11批HBsAg酶免诊断试剂的检定结果
Tab.3 Identification of 11 batches of HBsAg enzyme immunodiagnostic reagents 批号
Batch
, 百拇医药
质量检定技术指标
Technical indexes for quality control
灵敏度(ng/ml)
Sensitivity(ng/ml)
特异性(+/-)
Specificity(+/-)
阳性参比
Reference(-/+)
精密性(CV%)
Accuracy
950016
, 百拇医药
0.5
0/20
0/3
11
960002
0.5
0/20
0/3
7
960918-1
05
0/20
0/3
, 百拇医药
9
960918-2
1.0
0/20
0/3
11
970211
0.5
0/20
0/3
13
970718
0.2
, 百拇医药
0/20
0/3
8
971208
0.2
0/20
0/3
7.4
980511
0.2
0/20
0/3
6
, 百拇医药
981003
0.2
0/20
0/3
4
990118
1.0
0/20
0/3
10
990616
0.5
0/20
, 百拇医药
0/3
8
国家标准
National standard
1.0
0/20
0/3
<15%
本室制备的参考品用国内三个不同厂家试剂反复进行核验比较，无一例假阳性和假阴性，灵敏度均在1 ng/ml以下，CV值均<15%，与用国家标准品测定的结果一致。结果表明本室参考品标定和制备是成功的，含量及其使用性能稳定，做为企业质量评价尺度，在产品质控中起到决定性作用，提高了产品质量。几年来本中心生产的HBsAg ELISA试剂检测卫生部临床检验中心质控血清参加全国质控评比，均取得优异成绩。 (收稿日期：2000-06-26)
, 百拇医药
单位：中国辐射防护研究院生物技术研究所二室 太原 030000
关键词：
中华实验和临床病毒学杂志000423 乙型肝炎是我国发病率较高的传染病之一，乙型肝炎的准确诊断和防治与所用诊断试剂质量密切相关。研制生产出高灵敏度、高特异性、质量稳定的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)诊断试剂，对乙型肝炎的早期诊治和阻断血液传播具有重要意义，我们参照国家质控标准品，标定并建立了室内HBsAg酶免试剂参考品，对进一步监测和提高诊断试剂的质量起到重要作用。
1 材料和方法
1.1 材料及来源 购自中国药品生物制品检定所的HBsAg阳性血清1份(80 ng/ml)，灵敏度血清4份(0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml)，特异性血清20份，精密性血清1份，不同亚型阳性参比品3份。所有血清均采自献血员，经放射免疫测定法(Radio-immunoassay RIA)检测筛选出HBsAg阳性血清8份，阴性血清58份。全部血清经56℃ 10 h灭活，3 000 r/min离心15 min，-20℃保存备用。HBsAg试剂盒分别为本实验室、上海科华和厦门新创公司生产。检测仪器为奥地利SLT-Ⅰ型酶标仪。
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1.2 灵敏度系列参比品的制备 将中检所80 ng/ml HBsAg阳性标准品和5份HBsAg阳性混合血清分别倍比稀释至最低检测限浓度，用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测，找出被标定血清与标准品相对应的吸光度A值，经3次重复实验后，反推标定血清的HBsAg含量，并以标定过的移液管、容量瓶及含保护剂的稀释液，将其准确稀释到与国家标准品相应的含量0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、100 ng/ml，经再次ELISA重复检测，确定其含量，经t检验，差异无显著性后分装，-20℃冻存备用，为本室HBsAg灵敏度质控参考品。
1.3 特异性标准血清的筛选 收集58份正常献血员血清，同时用三个不同厂家HBsAg试剂经ELISA法检测，选出平均A值在0.05～0.09之间的阴性血清，再经RIA试剂(北京生物制品研究所)检测HBsAg为阴性的20份血清，经中和试验确证为HBsAg阴性，分装-20℃冻存备用，作为本室HBsAg阴性特异性质控参考品。
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1.4 阳性参比标准血清的筛选 选出3份阳性稀释终点在10～14万倍之间的HBsAg阳性高值血清，分装后-20℃冻存，作为本室HBsAg阳性质控参考品。
1.5 精密性标准血清的制备 将HBsAg阳性血清稀释到HBsAg含量接近临界值3 ng/ml，测定A值在0.2～0.3之间，并连续测定10孔，计算变异系数(CV值)，作为本室HBsAg精密性质控参考品。
1.6 HBsAg室内参考品的核验 以三个不同厂家HBsAg ELISA试剂，分别检测HBsAg国家标准品和标定的室内参考品，分析重复性、准确性和稳定性。
2 结果
2.1 室内参考品与国家标准品灵敏度的对比结果 见表1。标定后计算出5份HBsAg阳性混合血清HBsAg含量为70 μg/ml，将此混合血清稀释为灵敏度系列参比品，灵敏度以参比品HBsAg最小检出量表示，国家HBsAg灵敏度标准品有四个浓度，分别为0.2 ng/ml、0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml，对试剂灵敏度要求达到1 ng/ml为合格产品，从表1可看出，本室标定的参考品与国家标准品A值相近，经t检验，t值为2.604，小于t0.01(3)＝5.841，P>0.01，两者之间差异无显著性。
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2.2 室内参考品与国家标准品线性相关性的比较 将中检所80 ng/ml标准品倍比稀释7孔至最低浓度0.313 ng/ml，本室标定的100 ng/ml参考品倍比稀释8孔至最低浓度0.39 ng/ml，做ELISA检测，根据HBsAg含量及测定的A值绘制曲线，观其拟合程度。结果，在低含量段即0.313～5 ng/ml之间拟合最佳，而后一段5～100 ng/ml本室参考品的A值比中检所的A值略高一些。因此在低含量段的灵敏度参考品标定比较准确。见图1。
2.3 三种国产试剂对特异性参考品的核验结果 经国家批批检定的三个厂家试剂对20份室内特异性参考品检测A值范围分别为：本实验室0.04～0.09，科华0.05～0.09，新创0.04～0.09，其中4份阴性高值血清，三个厂家检测结果A值均为0.08～0.09；比其他阴性血清A值略高，三种试剂对室内特异性参考品的检测结果无一例假阳性出现。
表1 不同浓度国家标准品与本室参考品ELISA测定结果(A值)
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Tab.1 ELISA results of the National standard HBsAg reference sera and the
laboratory reference HBsAg sera (A value) 标准品
Reference sera
HBsAg含量(ng/ml)
HBsAg content(ng/ml)
0.2
0.5
1
2
国家标准品
, 百拇医药
National standard HBsAg reference sera
0.13
0.14
0.17
0.25
本室参考品
Laboratory HBsAg reference sera
0.11
0.16
0.18
0.27
, 百拇医药 P>0.01
2.4 不同厂家试剂对室内参考品的检测结果 用三种市售经“国家批批检定”合格试剂，同时检测本室建立的HBsAg参考品，检测结果与“国家批批检定”结果一致，结果见表2。
2.5 室内参考品在生产中的应用 室内HBsAg参考品建立以来，用HBsAg ELISA试剂常规生产的质量控制和监测，对控制和提高试剂质量起到至关重要的作用。1995年以来本室生产的11批HBsAg酶免试剂经“国家批批检定”，结果合格率100%，见表3。
3 讨论
诊断试剂质量好坏，直接影响临床检测结果的准确与否，因此建立一套室内参考品监测产品质量非常重要，其中灵敏度直接反映试剂盒的检测下限、灵敏度过低可造成HBsAg阳性病人的漏检；特异性标准品共20份，数量较多，目的是控制检测中真阴性检测结果，防止假阳性造成误诊给病人和家属带来不必要的思想负担；阳性参比品是防止一步法ELISA检测中高滴度HBsAg阳性标本漏检的重要参比标准；精密性则是检验诊断试剂重复性的重要指标，以评价试剂的批内精密性或重现性。
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在室内参考品标定制备过程中，对几个重要指标本着使用方便、准确的原则，采用严谨的实验方法，将室内参考的浓度直接稀释为工作浓度，使用时不再稀释以减少实验误差。
本室自建立室内参考品以来，始终用于日常室内质量控制工作，及时纠正生产和实验中各种因素造成的质量偏差，保证并提高了试剂的质量。1995年以来本室HBsAg酶免试剂连续11批参加批批国家检定，各项技术指标均达到或超过国家标准。其中9批产品灵敏度低于1 ng/ml的国家标准，达0.5～0.2 ng/ml；精密性符合<15%的国家标准；20份特异性血清未出现假阳性结果；3份不同亚型强阳性血清从未出现后带漏检现象，检定合格率达100%。
图1 室内参考品与国家标准品线性相关图
Fig.1 Linear correlation between laboratory reference HBsAg sera and
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National standard HBsAg reference sera
表2 不同厂家试剂对室内参考品的检测结果
Tab.2 The laboratory HBsAg reference sera tested with HBsAg reagents of different factories 厂家
Factory
灵敏度(ng/ml)
Senstivity(ng/ml)
特异性(+/-)
Specificity(+/-)
阳性参比
, 百拇医药
Reference(-/+)
精密性(CV%)
Accuracy
本室
Laboratory
0.5
0/20
0/3
7.8
科华
Kehua
0.2
0/20
, http://www.100md.com
0/3
8.2
新创
Xinchuang
0.5
0/20
0/3
9.6
表3 连续11批HBsAg酶免诊断试剂的检定结果
Tab.3 Identification of 11 batches of HBsAg enzyme immunodiagnostic reagents 批号
Batch
, 百拇医药
质量检定技术指标
Technical indexes for quality control
灵敏度(ng/ml)
Sensitivity(ng/ml)
特异性(+/-)
Specificity(+/-)
阳性参比
Reference(-/+)
精密性(CV%)
Accuracy
950016
, 百拇医药
0.5
0/20
0/3
11
960002
0.5
0/20
0/3
7
960918-1
05
0/20
0/3
, 百拇医药
9
960918-2
1.0
0/20
0/3
11
970211
0.5
0/20
0/3
13
970718
0.2
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0/20
0/3
8
971208
0.2
0/20
0/3
7.4
980511
0.2
0/20
0/3
6
, 百拇医药
981003
0.2
0/20
0/3
4
990118
1.0
0/20
0/3
10
990616
0.5
0/20
, 百拇医药
0/3
8
国家标准
National standard
1.0
0/20
0/3
<15%
本室制备的参考品用国内三个不同厂家试剂反复进行核验比较，无一例假阳性和假阴性，灵敏度均在1 ng/ml以下，CV值均<15%，与用国家标准品测定的结果一致。结果表明本室参考品标定和制备是成功的，含量及其使用性能稳定，做为企业质量评价尺度，在产品质控中起到决定性作用，提高了产品质量。几年来本中心生产的HBsAg ELISA试剂检测卫生部临床检验中心质控血清参加全国质控评比，均取得优异成绩。 (收稿日期：2000-06-26)
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