口腔粘膜鳞癌中端粒酶活性的检测及意义
作者：姚华 吴葆萱 吴求亮 张行
单位：姚华(310003 杭州， 浙江大学医学院附属第一医院口腔科)；吴求亮(310003 杭州， 浙江大学医学院附属第一医院口腔科)；吴葆萱(附属第二医院口腔科)；张行(附属第二医院口腔科)
关键词：癌，鳞状细胞；端粒酶
中华口腔医学杂志000410 【摘要】 目的 探讨端粒酶活化在口腔鳞癌发生、发展中的作用。方法 采用端粒重复扩增酶标法对20例口腔鳞癌及10例正常口腔粘膜，9例口腔鳞癌及其癌旁组织中的端粒酶活性定量检测。结果 口腔鳞癌中的端粒酶活性值明显高于正常口腔粘膜，9例自身对照癌组织的端粒酶活性值高于癌旁组织。结论 端粒酶的激活对口腔鳞癌的发生、发展有重要意义。
Detection and effect of telomerase activity in oral mucosal squamous cell carcinoma
, 百拇医药
YAO Hua，WU Baoxuan，WU Qiuliang
(Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Medical College, Zhejiang University,Hangzhou 310003，China)
【Abstract】 Objective To study telomerase activity in 20 oral squamous cell carcinoma(SCC), and 10 normal oral tissues and 9 oral SCC and 9 adjacent normal tissue. Methods A modified PCR-based telomeric repeat amplification protocal assay(TRAP) was used. Results The telomerase activity was significantly higher in SCC than that of normal mucosa ,and than that of adjacent tissue as well. Conclusions These findings indicated that telomerase activation might be a critical step in the formation and development of cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Carcinoma，squamous cell； Telomerase
端粒是真核细胞染色体复制、细胞生长、成熟、衰亡的必需装置。它的合成有赖于端粒酶的活化。端粒酶是目前临床用于诊断肿瘤发生、判断预后的最具敏感和特异性的指标[1]。我们采用端粒重复扩增(telomeric repeat amplification protocol， TRAP)酶标法对口腔鳞癌、癌旁组织及正常口腔粘膜的端粒活性定量检测，发现其在口腔鳞癌早期诊断、制定治疗方案、预后估计等方面的作用。
材料和方法
1.材料：20例口腔粘膜鳞癌组织标本均来自手术切除或切取活检的组织，9例癌旁组织取自其中9例鳞癌患者切缘正常侧粘膜，10例正常组织为健康口腔粘膜，取下后立即液氮-80℃保存备用，全部病例均经病理证实。
, 百拇医药
主要试剂：端粒酶测定试剂盒(德国宝灵曼公司)。仪器：低温离心机、PCR扩增仪、酶联免疫吸附测定仪。
2. 方法：采用端粒重复扩增酶标法。
(1) 模板制备：取液氮冻存组织标本3 mm×3 mm×3 mm，用剪刀迅速剪至糊状，加入80～100 μl裂解液，混匀，冰上存放2 h，4 ℃ 12 000 r/ min离心 20 min，吸取上清液，保存于-30℃冰箱备用。
(2) PCR扩增：取上清液5 μl加25 μl反应混合液、DEPC水20 μl、石蜡油50 μl，置PCR扩增仪25℃底物延长30 min，端粒酶变性94℃ 5 min，再经94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 90 s，退火延伸，循环30次，最后，72℃延伸10 min。
(3) 杂交及ELISA：将变性液20 μl、PCR产物5 μl，室温下放10 min，加入225 μl杂交液混匀。取混匀后杂交液100 μl置条孔板中，室温下平放2 h，端粒酶缓冲液洗3次，每孔加入抗DIG-过氧化物酶2 μl和酶连接稀释液98～100 μl，室温存放30 min，端粒酶缓冲液洗5次×30 s。加入TMB底物100 μl/孔，37℃ 30 min，终止反应液100 μl/孔，室温存放30 min，450?波长测A值。
, 百拇医药
结果
结果显示，口腔鳞癌端粒酶活性值明显高于正常粘膜，在9例自身对照标本中，口腔鳞癌比癌旁组织的端粒酶A值高，阳性对照为试剂盒提供的癌细胞株(A 0.135)。20例口腔鳞癌端粒酶A值均值±标准差为0.105 5 ± 0.136 7 ；9例正常粘膜 端粒酶A值均值±标准差为0.002 6±0.002 0；两组比较P值=0.003。9例口腔鳞癌端粒酶A值均值±标准差为0.105 5±0.136 7；9例癌旁组织 端粒酶A值均值±标准差为0.002 6±0.002 0；两组比较P值=0.005。
讨论
端粒酶是由RNA和蛋白质构成的复合体，自身携带模板，通过底物识别、碱基配对、核肽附加、转位4个步骤将重复碱基序列加到端粒上，使之保持一定长度[2]。Kim等[3]率先建立端粒重复扩增法测得细胞抽提液中的端粒酶活性。国外已有研究表明[2,4]，除精原细胞和少数造血细胞外，高等生物正常体细胞分化过程中端粒酶无活性。大多数原发性肿瘤标本或肿瘤细胞中端粒活化，约有85%的早期癌表达了端粒酶。Shay和Gazdar[5]用端粒重复扩增法测定了101个代表各种癌标本，90份含端粒酶活性，98/100独立永生细胞系含有端粒酶活性，而良性肿瘤、体细胞和致死细胞系都未发现端粒酶活性，这种显著相关性表明，肿瘤细胞的恶性进展过程中，端粒酶可能起到关键的作用。Mao等[6]端粒重复扩增法定性测得93%头颈部鳞癌表达了端粒酶，认为端粒酶是早期反映恶性化的可靠手段。Califano等[7]通过定性研究发现，所有漱口液中测到端粒酶活性的病例均是鳞癌患者。我们采用端粒重复扩增酶标法定量对新鲜口腔鳞癌组织、癌旁组织、正常粘膜中的端粒酶活性进行检测。鳞癌组织端粒酶A值极显著高于正常组织和癌旁组织。由于正常组织、癌旁组织例数少，我们未对两者进行差别统计。以上结果提示：口腔粘膜正常情况下，端粒酶无活性，端粒酶活性与细胞恶性化程度相关。口腔鳞癌组织端粒酶呈高表达。其致癌途径可能是：在某些因素作用下，如HPV-16E6蛋白的刺激，p53、Rb蛋白等调控因子的失活，端粒缩短，端粒酶激活等致使端粒维持一定长度，细胞得以持续分裂、逃避死亡、获得永生，从而导致肿瘤发生[8]。本组中，1例上颌鳞癌患者癌组织端粒酶A值为0.449，阳性对照0.135，而其癌旁组织A值0.051，该患者2个月后术区鳞癌复发，病理证实为同一类型鳞癌。由此可以推测端粒酶活性与患者预后密切相关，A值越高，预后越差。鉴于肿瘤细胞间粘接性较差、细胞易脱落的特点，采用肿瘤表面搔刮法，刮取的微量组织行端粒酶A值检测，结果与手术标本值相似，也能良好地反映组织的端粒酶活性，这将为日后无创伤性活检监测细胞恶性情况提供新思路。
, 百拇医药
虽然Kim建立的端粒重复扩增法高效，但由于有放射污染，也显露了一些不足。端粒重复扩增酶标法无同位素污染，并可定量检测，真正实现量化要求。本实验因例数少，鳞癌组A值标准差虽较大，但经校正检验鳞癌组织A均值与正常粘膜的差异有显著性。癌旁组织也有一定的A值，由此推测，细胞组织学阴性但端粒酶活性高的切缘细胞也可能是癌前细胞，对其应严密随访，甚至扩大切除。
端粒酶活性与细胞增殖分化程度呈正相关，对于口腔鳞癌恶性程度的临床诊断和预后判断有显著意义，值得进一步深入研究。
参考文献
1，Greider CW, Blackburn EH. Telomeres, telomerase and cancer. Sci Am, 1996,274:92-97.
2，Dahse R, Fiedler W, Ernst G. Telomeres and telomerase: biological and clinical importance. Clin Chemistry, 1997,43:708-714.
, 百拇医药
3，Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266:2 011-2 015.
4，Harle-Bachor C, Boukamp P. Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis inhuman skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci U S A， 1996,93:6 476-6 481.
5，Shay JW, Gazdar AF. Telomerase in the early detection of cancer. J Clin Pathol,1997,50:106-109.
, 百拇医药
6，Mao L, Adel KE, Fan YH, et al. Telomerase activity in head and neck squamous cell carcinoma and adjacent tissues. Cancer Res, 1996,56:5 600-5 604.
7，Califano J, Ahrendt SA, Meininger G, et al. Detection of telomerase activity in oral rinses from head and neck squamous cell carcinoma patients. Cancer Res, 1996,56:5 720-5 722.
8，Holt SE, Wright WE, Shay JW. Regulation of telomerase activity in immortal cell lines. Mol Cell Biol, 1996,16:2 932-2 939.
(收稿日期：1999-02-26), 百拇医药
单位：姚华(310003 杭州， 浙江大学医学院附属第一医院口腔科)；吴求亮(310003 杭州， 浙江大学医学院附属第一医院口腔科)；吴葆萱(附属第二医院口腔科)；张行(附属第二医院口腔科)
关键词：癌，鳞状细胞；端粒酶
中华口腔医学杂志000410 【摘要】 目的 探讨端粒酶活化在口腔鳞癌发生、发展中的作用。方法 采用端粒重复扩增酶标法对20例口腔鳞癌及10例正常口腔粘膜，9例口腔鳞癌及其癌旁组织中的端粒酶活性定量检测。结果 口腔鳞癌中的端粒酶活性值明显高于正常口腔粘膜，9例自身对照癌组织的端粒酶活性值高于癌旁组织。结论 端粒酶的激活对口腔鳞癌的发生、发展有重要意义。
Detection and effect of telomerase activity in oral mucosal squamous cell carcinoma
, 百拇医药
YAO Hua，WU Baoxuan，WU Qiuliang
(Department of Stomatology, The First Affiliated Hospital of Medical College, Zhejiang University,Hangzhou 310003，China)
【Abstract】 Objective To study telomerase activity in 20 oral squamous cell carcinoma(SCC), and 10 normal oral tissues and 9 oral SCC and 9 adjacent normal tissue. Methods A modified PCR-based telomeric repeat amplification protocal assay(TRAP) was used. Results The telomerase activity was significantly higher in SCC than that of normal mucosa ,and than that of adjacent tissue as well. Conclusions These findings indicated that telomerase activation might be a critical step in the formation and development of cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Carcinoma，squamous cell； Telomerase
端粒是真核细胞染色体复制、细胞生长、成熟、衰亡的必需装置。它的合成有赖于端粒酶的活化。端粒酶是目前临床用于诊断肿瘤发生、判断预后的最具敏感和特异性的指标[1]。我们采用端粒重复扩增(telomeric repeat amplification protocol， TRAP)酶标法对口腔鳞癌、癌旁组织及正常口腔粘膜的端粒活性定量检测，发现其在口腔鳞癌早期诊断、制定治疗方案、预后估计等方面的作用。
材料和方法
1.材料：20例口腔粘膜鳞癌组织标本均来自手术切除或切取活检的组织，9例癌旁组织取自其中9例鳞癌患者切缘正常侧粘膜，10例正常组织为健康口腔粘膜，取下后立即液氮-80℃保存备用，全部病例均经病理证实。
, 百拇医药
主要试剂：端粒酶测定试剂盒(德国宝灵曼公司)。仪器：低温离心机、PCR扩增仪、酶联免疫吸附测定仪。
2. 方法：采用端粒重复扩增酶标法。
(1) 模板制备：取液氮冻存组织标本3 mm×3 mm×3 mm，用剪刀迅速剪至糊状，加入80～100 μl裂解液，混匀，冰上存放2 h，4 ℃ 12 000 r/ min离心 20 min，吸取上清液，保存于-30℃冰箱备用。
(2) PCR扩增：取上清液5 μl加25 μl反应混合液、DEPC水20 μl、石蜡油50 μl，置PCR扩增仪25℃底物延长30 min，端粒酶变性94℃ 5 min，再经94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 90 s，退火延伸，循环30次，最后，72℃延伸10 min。
(3) 杂交及ELISA：将变性液20 μl、PCR产物5 μl，室温下放10 min，加入225 μl杂交液混匀。取混匀后杂交液100 μl置条孔板中，室温下平放2 h，端粒酶缓冲液洗3次，每孔加入抗DIG-过氧化物酶2 μl和酶连接稀释液98～100 μl，室温存放30 min，端粒酶缓冲液洗5次×30 s。加入TMB底物100 μl/孔，37℃ 30 min，终止反应液100 μl/孔，室温存放30 min，450?波长测A值。
, 百拇医药
结果
结果显示，口腔鳞癌端粒酶活性值明显高于正常粘膜，在9例自身对照标本中，口腔鳞癌比癌旁组织的端粒酶A值高，阳性对照为试剂盒提供的癌细胞株(A 0.135)。20例口腔鳞癌端粒酶A值均值±标准差为0.105 5 ± 0.136 7 ；9例正常粘膜 端粒酶A值均值±标准差为0.002 6±0.002 0；两组比较P值=0.003。9例口腔鳞癌端粒酶A值均值±标准差为0.105 5±0.136 7；9例癌旁组织 端粒酶A值均值±标准差为0.002 6±0.002 0；两组比较P值=0.005。
讨论
端粒酶是由RNA和蛋白质构成的复合体，自身携带模板，通过底物识别、碱基配对、核肽附加、转位4个步骤将重复碱基序列加到端粒上，使之保持一定长度[2]。Kim等[3]率先建立端粒重复扩增法测得细胞抽提液中的端粒酶活性。国外已有研究表明[2,4]，除精原细胞和少数造血细胞外，高等生物正常体细胞分化过程中端粒酶无活性。大多数原发性肿瘤标本或肿瘤细胞中端粒活化，约有85%的早期癌表达了端粒酶。Shay和Gazdar[5]用端粒重复扩增法测定了101个代表各种癌标本，90份含端粒酶活性，98/100独立永生细胞系含有端粒酶活性，而良性肿瘤、体细胞和致死细胞系都未发现端粒酶活性，这种显著相关性表明，肿瘤细胞的恶性进展过程中，端粒酶可能起到关键的作用。Mao等[6]端粒重复扩增法定性测得93%头颈部鳞癌表达了端粒酶，认为端粒酶是早期反映恶性化的可靠手段。Califano等[7]通过定性研究发现，所有漱口液中测到端粒酶活性的病例均是鳞癌患者。我们采用端粒重复扩增酶标法定量对新鲜口腔鳞癌组织、癌旁组织、正常粘膜中的端粒酶活性进行检测。鳞癌组织端粒酶A值极显著高于正常组织和癌旁组织。由于正常组织、癌旁组织例数少，我们未对两者进行差别统计。以上结果提示：口腔粘膜正常情况下，端粒酶无活性，端粒酶活性与细胞恶性化程度相关。口腔鳞癌组织端粒酶呈高表达。其致癌途径可能是：在某些因素作用下，如HPV-16E6蛋白的刺激，p53、Rb蛋白等调控因子的失活，端粒缩短，端粒酶激活等致使端粒维持一定长度，细胞得以持续分裂、逃避死亡、获得永生，从而导致肿瘤发生[8]。本组中，1例上颌鳞癌患者癌组织端粒酶A值为0.449，阳性对照0.135，而其癌旁组织A值0.051，该患者2个月后术区鳞癌复发，病理证实为同一类型鳞癌。由此可以推测端粒酶活性与患者预后密切相关，A值越高，预后越差。鉴于肿瘤细胞间粘接性较差、细胞易脱落的特点，采用肿瘤表面搔刮法，刮取的微量组织行端粒酶A值检测，结果与手术标本值相似，也能良好地反映组织的端粒酶活性，这将为日后无创伤性活检监测细胞恶性情况提供新思路。
, 百拇医药
虽然Kim建立的端粒重复扩增法高效，但由于有放射污染，也显露了一些不足。端粒重复扩增酶标法无同位素污染，并可定量检测，真正实现量化要求。本实验因例数少，鳞癌组A值标准差虽较大，但经校正检验鳞癌组织A均值与正常粘膜的差异有显著性。癌旁组织也有一定的A值，由此推测，细胞组织学阴性但端粒酶活性高的切缘细胞也可能是癌前细胞，对其应严密随访，甚至扩大切除。
端粒酶活性与细胞增殖分化程度呈正相关，对于口腔鳞癌恶性程度的临床诊断和预后判断有显著意义，值得进一步深入研究。
参考文献
1，Greider CW, Blackburn EH. Telomeres, telomerase and cancer. Sci Am, 1996,274:92-97.
2，Dahse R, Fiedler W, Ernst G. Telomeres and telomerase: biological and clinical importance. Clin Chemistry, 1997,43:708-714.
, 百拇医药
3，Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266:2 011-2 015.
4，Harle-Bachor C, Boukamp P. Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis inhuman skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci U S A， 1996,93:6 476-6 481.
5，Shay JW, Gazdar AF. Telomerase in the early detection of cancer. J Clin Pathol,1997,50:106-109.
, 百拇医药
6，Mao L, Adel KE, Fan YH, et al. Telomerase activity in head and neck squamous cell carcinoma and adjacent tissues. Cancer Res, 1996,56:5 600-5 604.
7，Califano J, Ahrendt SA, Meininger G, et al. Detection of telomerase activity in oral rinses from head and neck squamous cell carcinoma patients. Cancer Res, 1996,56:5 720-5 722.
8，Holt SE, Wright WE, Shay JW. Regulation of telomerase activity in immortal cell lines. Mol Cell Biol, 1996,16:2 932-2 939.
(收稿日期：1999-02-26), 百拇医药