胶质源性神经营养因子在正常和炎症牙髓组织中的变化
作者：陆群 郭敬俊 吴补领 宋俊峰
单位：陆群(第四军医大学口腔医学院)；郭敬俊(第四军医大学口腔医学院)；吴补领(第四军医大学口腔医学院)；宋俊峰(神经生物教研室 陕西 西安 710032)
关键词：胶质源性神经营养因子；神经生长；免疫组化
牙体牙髓牙周病学杂志000404 [摘 要]目的：探讨胶质源性神经营养因子(GDNF)在牙髓炎症中的表达变化及意义。方法：应用免疫组织化学方法比较正常和炎症状态下，GDNF在牙髓组织中的变化。结果：正常牙髓组织GDNF染色呈阴性，炎性牙髓组织染色GDNF呈阳性，其主要分布在牙髓组织成牙本质细胞和成牙本质细胞深层细胞，而牙髓神经雪旺氏细胞染色为阴性。结论：GDNF参与牙髓炎性反应，与炎性牙髓组织再生发芽有关。
[中图号]R780.2 [文献标识码]A
, http://www.100md.com
[文章编号]1005-2593(20 00)04-0201-03
Changes of glial cell line derived neurotrophic factor in normal and inflamed dental pulp
LU Qun，GUO Jing-jun，WU Bu-ling，et al
(School of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
[Abstract]AIM:To investigate effects of glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) on dental nerve regression during inflamed restoration stages of dental pulp.METHODS:To observe changes of GDNF in inflamed dental pulp,compared with that in normal dental pulp by immunohistochemistry.RESULTS:Expression of GDNF was mainly found in odontoblast layer and subodontoblast zone of inflamed dental pulp,while was not observed at Schwann cell and normal dental pulp.CONCLUSION:These results indicate that GDNF may take part in inflamed response of dental pulp,and have an essential role in nerve sprouting reactions.
, 百拇医药
[Key words]GDNF;nerve regression;immunohistochemistry
胶质源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)，是一种新发现的神经营养因子，为TGF-β家族成员之一。其促神经再生作 用较NGF强[1]，对牙胚神经组织的发育形成起促生长作用，在牙髓神经发育形成过 程中起重要的促生长作用[2]。本实验旨在观察大鼠牙髓炎症状态下和正常状态下G DNF在牙髓组织中的变化，并作对比性研究，利用免疫组织化学染色直观再现GDNF在参与牙 髓炎症时的表达部位，探讨其对牙神经再生修复的作用和意义。
1 材料和方法
1.1 牙髓炎动物模型建立
SD大鼠24只，雌性，体重200～240g，其中4只做正常对照，余20只用846药 液(解放军农牧大学军事长春兽医研究所)0.5ml/kg注射鼠股外侧肌群，待10min后鼠完全麻 醉，于右侧上、下颌第一磨牙牙 合面穿髓，用5g/L 浓度的γ-内毒素(sigma，USA)作用于穿髓点15min后，玻璃离子水门汀封闭，建立牙髓 炎动物模型，实验分5组，炎症3、6、9、12、15d组[3]。
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1.2 样本制备
用30g/L戊巴比妥钠腹腔深度麻醉后开胸，经升主动脉灌注生理盐水100～150ml ，换含40g/L多聚甲醛液的0.1mol/L磷酸缓冲液350～450ml灌注固定1h,取带有完整牙齿 的上、下颌骨。标本浸入40g/L多聚甲醛液后固定2～4h，放入Krinstensen's脱钙液脱钙7d ，浸蜡包埋，石蜡切片，片厚15μm。
1.3 免疫组织化学染色
标本切片经脱蜡至水，PBS(pH=7.4)振洗， 30ml/L过氧化氢液封闭内源性过氧化物酶10min ， 室温。加入GDNF抗体1：25(北京中山生物技术公司，)，4℃孵育24 h；加入生物素化二 抗,37℃,孵育 1h；加入复合物；DAB 镜下控制显色，自来水终止反应。系列乙醇脱水， 二甲苯透明，DPX胶封片。显微镜下观察并照相。本实验中用生理盐水代替一抗作为空白对 照组。
, 百拇医药
2 结果
空白对照组、正常对照组标本染色为阴性。炎症3d组切片组化染色为弱阳性(图1)。炎症6 、9、12、15d各组GDNF在成牙本质上染色呈不同程度的阳性反应，显微镜 下观察，炎症坏死区残留的成牙本质细胞和成牙本质深层细胞胞浆着色，为黄褐色，牙 髓成纤维细胞染色阴性，牙髓神经雪旺氏细胞染色也为阴性(图2)。除3d组外，各组GDNF在 成牙本质细胞上阳性染色深浅差异不显著。
图1 牙髓炎症3d组GDNF于成牙本质细胞(OD)染色阳性，成纤维细胞(FB) 染色阴性 (×100)
图2 牙髓炎症12d组GDNF于成牙本质细胞(OD)染色阳性，成牙本质深层(SB)染色阳性，神经 雪旺氏细胞(SC)染色阴性 (×100)
, 百拇医药
3 讨论
GDNF是从胶质细胞瘤(B49)中发现并克隆成功的，故称之为胶质源性神经营养因子。研究发 现GDNF不仅存在于中枢神经系统纹状体黑质，也存在于外周神经系统靶器官，如发育中的 牙齿、 内耳、眼、舌乳头、嗅上皮，对感觉神经有营养活性[4，5]。目前普遍认 为GDNF是通过与G DNF-α和C-Ret两种受体结合形成GDNF-GFRα-cRet复合体，激活 C- Ret酪氨酸蛋白激 酶 活性，导致一系列底物蛋白的磷酸化反应，而发挥GDNF的生物活性效应[6，7]。
牙齿发育过程包括了上皮与间充质细胞间的作用，及细胞外基质成分之间的相互作用， 有多种生长因子参与此复杂过程，神经营养因子在其中发挥不可忽视的作用。大部分牙髓细 胞来源于神经嵴，并与神经细胞有共同特性：相同的膜电位，有对神经营养因子、生 长相关蛋白GAP-43、胶质酸纤维蛋白(glial acidic fibrillary protein)等与神经细胞 类似的应答反应。神经营养因子家族成员NGF被确认为积极参与牙髓神经发育和牙齿硬组织 形成过程。而GNDF是一种新发现的神经营养因子。
, 百拇医药
当釉质牙本质基质矿化完全，牙冠外形基本形成时，三叉神经组织分化生长并伸入 至髓腔[8]，神经纤维伴随血管进入髓腔。原位杂交技术研究表明，大鼠牙髓神经 发育在胚胎15d至生后7d(E15-P7)，GDNF于三叉神经节处有一过性高表达[9]， 在 牙胚发育E12-P7期于牙蕾(tooth germ)周边间充质有表达，牙蕾是诱导牙髓神经发育形成的 重要细胞凝聚区。提示GDNF参与牙髓神经的发育及分化，对牙髓神经生长起重要的促生长作 用[10]。 随着神经组织发育成熟，GDNF在三叉神经节及牙髓组织表达量锐减，使 用 原位杂交技术难以检测出阳性信号。但也有报道成年鼠纹状体和尾侧亚核中枢神经存在低水 平表达，提示其基因表达在神经发育的某一特定阶段开放，对神经发育与分化起调控作用， 在神经发育成熟后，只有在靶细胞区才表达，以便维持支配神经末稍的生存[11]。
本实验以γ-内毒素刺激牙髓组织所建立的大鼠慢性牙髓炎模型，有牙髓存活时间长、牙髓 组织有足够时间展示炎症渗出期、坏死期、修复期的不同反应阶段的特点。运用免疫组化技 术观察到GDNF在炎性牙髓组织的成牙本质细胞及成牙本质深层细胞表达，其意义可能使炎症 坏死区残存的神经纤维向成牙本质和牙髓组织方向延伸。目前有研究表明，牙髓炎症后期神 经末稍增多、增长[12，9]，神经末稍发芽可能与牙髓炎症损伤时GDNF在成牙本质 细胞及成牙本 质深层细胞表达增多有关。增生神经末稍大多为SP、CGRP阳性纤维，SP、CGRP一方面为血管 扩 张剂，使牙髓腔内压力持续升高，加重牙齿疼痛，同时又为疼痛传导递质，也可引起炎 性牙痛。
, 百拇医药
炎症组织的修复过程在很大程度上可看作是组织发育过程的重复[13]。本实验以正 常牙 髓组织为对照，观察GDNF在成牙本质细胞及深层成牙本质细胞染色阳性，正常对照组成牙本 质 细胞染色呈阴性，此结果与GDNF在牙胚中表达强而成熟牙齿中表达变弱的现象一致。
GDNF在牙髓纤维细胞和牙髓神经末稍雪旺氏细胞染色阴性，提示炎症导致GDNF 在成牙本 质细胞处变化可能先于牙髓神经末稍。炎症损伤时GDNF首先在牙髓组织的成牙本质细胞及成 牙本质深层细胞表达，并促进炎症坏死区残存的神经纤维向成牙本质和牙髓组织方向生长 ，之后出现炎症后期神经末稍发芽，其相互作用机制尚需进一步研究。
参考文献：
[1]Nosrat CA,Hoffer BJ.Cellular and developmental patterns of expression of Ret and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha mRNAs[J].Exp Brain Res.1997,115:410
, 百拇医药
[2]Buj BA,Buchnan VL.GDNF in an age-specific survival factor for sensory and autonomic neurons[J].Neuron,1995,15:821
[3]侯本祥，史俊南，丰泽浯,等.内毒素脂多糖刺激大鼠牙髓组织病理学反应[J].牙体牙髓牙周病学杂志,1997,7(1)：12
[4]宋俊峰，鞠躬.GDNF在大鼠神经系统发育分化中的基因表达分布与变化及人GDNF基因克隆与表达：[学位论文][D].西安：第四军医大学,1997
[5]Lin LF,Doherty DH,Lile JD.GDNF:a glial cell line-derived neuro trophic factor for midbrain dopaminergic neurons[J].Science,1993,260(5111):1130
, 百拇医药
[6]Lindsay RM,Yancopoulos GD.GDNF in bind with know orphan:accens sory implicated in new twist[J].Neuron,1996,17:572
[7]Mason I.The GDNF receptor:recent progress and unanswered questions[J].Mol Cell Neurosci,1996,8:112
[8]吴奇光，杨连甲.口腔组织病理学[M].北京:人民卫生出版社,1993
[9]Luukko K,Suvanto P,Saarma M.Expression of GDNF and its receptor in developing tooth is developmentally regulated and suggests multiple roles in innervation and organogenesis[J].Dev Dyn,1997,210:463
, 百拇医药
[10]Nosrat CA,Fried K,Ebendal T.NGF,BDNF,NT3,NT4 and GDNF in tooth development[J].Eur J Oral Sci,1998,106:94
[11]Stroberg I,Bjorklund L,Johansson M,et al.Glial cell line-de rived neurotrophic factor is expressed in the developing but not adult stratam and stimulates developing dopamine neurons in vivo[J].Exp Neurol,1993,12 4:402
[12]Byer MR,Swift ML,Wheeler EF.Reactions of sensory nerves to dental restorative procedures[J].Pro Finn Dent Soc,1992,88(suppl):73
[13]DSouza RN,Bachman T,Baumgorder K,et al.Characterization of cellular responses involved in reparative dentinogenesis in rat molars[J].J Dent Res,1995,74:702
收稿日期：1998-12-31
修回日期：1999-12-01, 百拇医药
单位：陆群(第四军医大学口腔医学院)；郭敬俊(第四军医大学口腔医学院)；吴补领(第四军医大学口腔医学院)；宋俊峰(神经生物教研室 陕西 西安 710032)
关键词：胶质源性神经营养因子；神经生长；免疫组化
牙体牙髓牙周病学杂志000404 [摘 要]目的：探讨胶质源性神经营养因子(GDNF)在牙髓炎症中的表达变化及意义。方法：应用免疫组织化学方法比较正常和炎症状态下，GDNF在牙髓组织中的变化。结果：正常牙髓组织GDNF染色呈阴性，炎性牙髓组织染色GDNF呈阳性，其主要分布在牙髓组织成牙本质细胞和成牙本质细胞深层细胞，而牙髓神经雪旺氏细胞染色为阴性。结论：GDNF参与牙髓炎性反应，与炎性牙髓组织再生发芽有关。
[中图号]R780.2 [文献标识码]A
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[文章编号]1005-2593(20 00)04-0201-03
Changes of glial cell line derived neurotrophic factor in normal and inflamed dental pulp
LU Qun，GUO Jing-jun，WU Bu-ling，et al
(School of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)
[Abstract]AIM:To investigate effects of glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) on dental nerve regression during inflamed restoration stages of dental pulp.METHODS:To observe changes of GDNF in inflamed dental pulp,compared with that in normal dental pulp by immunohistochemistry.RESULTS:Expression of GDNF was mainly found in odontoblast layer and subodontoblast zone of inflamed dental pulp,while was not observed at Schwann cell and normal dental pulp.CONCLUSION:These results indicate that GDNF may take part in inflamed response of dental pulp,and have an essential role in nerve sprouting reactions.
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[Key words]GDNF;nerve regression;immunohistochemistry
胶质源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF)，是一种新发现的神经营养因子，为TGF-β家族成员之一。其促神经再生作 用较NGF强[1]，对牙胚神经组织的发育形成起促生长作用，在牙髓神经发育形成过 程中起重要的促生长作用[2]。本实验旨在观察大鼠牙髓炎症状态下和正常状态下G DNF在牙髓组织中的变化，并作对比性研究，利用免疫组织化学染色直观再现GDNF在参与牙 髓炎症时的表达部位，探讨其对牙神经再生修复的作用和意义。
1 材料和方法
1.1 牙髓炎动物模型建立
SD大鼠24只，雌性，体重200～240g，其中4只做正常对照，余20只用846药 液(解放军农牧大学军事长春兽医研究所)0.5ml/kg注射鼠股外侧肌群，待10min后鼠完全麻 醉，于右侧上、下颌第一磨牙牙 合面穿髓，用5g/L 浓度的γ-内毒素(sigma，USA)作用于穿髓点15min后，玻璃离子水门汀封闭，建立牙髓 炎动物模型，实验分5组，炎症3、6、9、12、15d组[3]。
, http://www.100md.com
1.2 样本制备
用30g/L戊巴比妥钠腹腔深度麻醉后开胸，经升主动脉灌注生理盐水100～150ml ，换含40g/L多聚甲醛液的0.1mol/L磷酸缓冲液350～450ml灌注固定1h,取带有完整牙齿 的上、下颌骨。标本浸入40g/L多聚甲醛液后固定2～4h，放入Krinstensen's脱钙液脱钙7d ，浸蜡包埋，石蜡切片，片厚15μm。
1.3 免疫组织化学染色
标本切片经脱蜡至水，PBS(pH=7.4)振洗， 30ml/L过氧化氢液封闭内源性过氧化物酶10min ， 室温。加入GDNF抗体1：25(北京中山生物技术公司，)，4℃孵育24 h；加入生物素化二 抗,37℃,孵育 1h；加入复合物；DAB 镜下控制显色，自来水终止反应。系列乙醇脱水， 二甲苯透明，DPX胶封片。显微镜下观察并照相。本实验中用生理盐水代替一抗作为空白对 照组。
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2 结果
空白对照组、正常对照组标本染色为阴性。炎症3d组切片组化染色为弱阳性(图1)。炎症6 、9、12、15d各组GDNF在成牙本质上染色呈不同程度的阳性反应，显微镜 下观察，炎症坏死区残留的成牙本质细胞和成牙本质深层细胞胞浆着色，为黄褐色，牙 髓成纤维细胞染色阴性，牙髓神经雪旺氏细胞染色也为阴性(图2)。除3d组外，各组GDNF在 成牙本质细胞上阳性染色深浅差异不显著。
图1 牙髓炎症3d组GDNF于成牙本质细胞(OD)染色阳性，成纤维细胞(FB) 染色阴性 (×100)
图2 牙髓炎症12d组GDNF于成牙本质细胞(OD)染色阳性，成牙本质深层(SB)染色阳性，神经 雪旺氏细胞(SC)染色阴性 (×100)
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3 讨论
GDNF是从胶质细胞瘤(B49)中发现并克隆成功的，故称之为胶质源性神经营养因子。研究发 现GDNF不仅存在于中枢神经系统纹状体黑质，也存在于外周神经系统靶器官，如发育中的 牙齿、 内耳、眼、舌乳头、嗅上皮，对感觉神经有营养活性[4，5]。目前普遍认 为GDNF是通过与G DNF-α和C-Ret两种受体结合形成GDNF-GFRα-cRet复合体，激活 C- Ret酪氨酸蛋白激 酶 活性，导致一系列底物蛋白的磷酸化反应，而发挥GDNF的生物活性效应[6，7]。
牙齿发育过程包括了上皮与间充质细胞间的作用，及细胞外基质成分之间的相互作用， 有多种生长因子参与此复杂过程，神经营养因子在其中发挥不可忽视的作用。大部分牙髓细 胞来源于神经嵴，并与神经细胞有共同特性：相同的膜电位，有对神经营养因子、生 长相关蛋白GAP-43、胶质酸纤维蛋白(glial acidic fibrillary protein)等与神经细胞 类似的应答反应。神经营养因子家族成员NGF被确认为积极参与牙髓神经发育和牙齿硬组织 形成过程。而GNDF是一种新发现的神经营养因子。
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当釉质牙本质基质矿化完全，牙冠外形基本形成时，三叉神经组织分化生长并伸入 至髓腔[8]，神经纤维伴随血管进入髓腔。原位杂交技术研究表明，大鼠牙髓神经 发育在胚胎15d至生后7d(E15-P7)，GDNF于三叉神经节处有一过性高表达[9]， 在 牙胚发育E12-P7期于牙蕾(tooth germ)周边间充质有表达，牙蕾是诱导牙髓神经发育形成的 重要细胞凝聚区。提示GDNF参与牙髓神经的发育及分化，对牙髓神经生长起重要的促生长作 用[10]。 随着神经组织发育成熟，GDNF在三叉神经节及牙髓组织表达量锐减，使 用 原位杂交技术难以检测出阳性信号。但也有报道成年鼠纹状体和尾侧亚核中枢神经存在低水 平表达，提示其基因表达在神经发育的某一特定阶段开放，对神经发育与分化起调控作用， 在神经发育成熟后，只有在靶细胞区才表达，以便维持支配神经末稍的生存[11]。
本实验以γ-内毒素刺激牙髓组织所建立的大鼠慢性牙髓炎模型，有牙髓存活时间长、牙髓 组织有足够时间展示炎症渗出期、坏死期、修复期的不同反应阶段的特点。运用免疫组化技 术观察到GDNF在炎性牙髓组织的成牙本质细胞及成牙本质深层细胞表达，其意义可能使炎症 坏死区残存的神经纤维向成牙本质和牙髓组织方向延伸。目前有研究表明，牙髓炎症后期神 经末稍增多、增长[12，9]，神经末稍发芽可能与牙髓炎症损伤时GDNF在成牙本质 细胞及成牙本 质深层细胞表达增多有关。增生神经末稍大多为SP、CGRP阳性纤维，SP、CGRP一方面为血管 扩 张剂，使牙髓腔内压力持续升高，加重牙齿疼痛，同时又为疼痛传导递质，也可引起炎 性牙痛。
, 百拇医药
炎症组织的修复过程在很大程度上可看作是组织发育过程的重复[13]。本实验以正 常牙 髓组织为对照，观察GDNF在成牙本质细胞及深层成牙本质细胞染色阳性，正常对照组成牙本 质 细胞染色呈阴性，此结果与GDNF在牙胚中表达强而成熟牙齿中表达变弱的现象一致。
GDNF在牙髓纤维细胞和牙髓神经末稍雪旺氏细胞染色阴性，提示炎症导致GDNF 在成牙本 质细胞处变化可能先于牙髓神经末稍。炎症损伤时GDNF首先在牙髓组织的成牙本质细胞及成 牙本质深层细胞表达，并促进炎症坏死区残存的神经纤维向成牙本质和牙髓组织方向生长 ，之后出现炎症后期神经末稍发芽，其相互作用机制尚需进一步研究。
参考文献：
[1]Nosrat CA,Hoffer BJ.Cellular and developmental patterns of expression of Ret and glial cell line-derived neurotrophic factor receptor alpha mRNAs[J].Exp Brain Res.1997,115:410
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[2]Buj BA,Buchnan VL.GDNF in an age-specific survival factor for sensory and autonomic neurons[J].Neuron,1995,15:821
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[4]宋俊峰，鞠躬.GDNF在大鼠神经系统发育分化中的基因表达分布与变化及人GDNF基因克隆与表达：[学位论文][D].西安：第四军医大学,1997
[5]Lin LF,Doherty DH,Lile JD.GDNF:a glial cell line-derived neuro trophic factor for midbrain dopaminergic neurons[J].Science,1993,260(5111):1130
, 百拇医药
[6]Lindsay RM,Yancopoulos GD.GDNF in bind with know orphan:accens sory implicated in new twist[J].Neuron,1996,17:572
[7]Mason I.The GDNF receptor:recent progress and unanswered questions[J].Mol Cell Neurosci,1996,8:112
[8]吴奇光，杨连甲.口腔组织病理学[M].北京:人民卫生出版社,1993
[9]Luukko K,Suvanto P,Saarma M.Expression of GDNF and its receptor in developing tooth is developmentally regulated and suggests multiple roles in innervation and organogenesis[J].Dev Dyn,1997,210:463
, 百拇医药
[10]Nosrat CA,Fried K,Ebendal T.NGF,BDNF,NT3,NT4 and GDNF in tooth development[J].Eur J Oral Sci,1998,106:94
[11]Stroberg I,Bjorklund L,Johansson M,et al.Glial cell line-de rived neurotrophic factor is expressed in the developing but not adult stratam and stimulates developing dopamine neurons in vivo[J].Exp Neurol,1993,12 4:402
[12]Byer MR,Swift ML,Wheeler EF.Reactions of sensory nerves to dental restorative procedures[J].Pro Finn Dent Soc,1992,88(suppl):73
[13]DSouza RN,Bachman T,Baumgorder K,et al.Characterization of cellular responses involved in reparative dentinogenesis in rat molars[J].J Dent Res,1995,74:702
收稿日期：1998-12-31
修回日期：1999-12-01, 百拇医药