牙本质涎磷蛋白在小鼠牙齿发育中的表达
作者：张蓉 肖明振 谢欣梅 赵守亮 江卫民
单位：张蓉(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；肖明振(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；谢欣梅(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；赵守亮(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；江卫民(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：牙本质涎磷蛋白；小鼠；牙齿发育；蛋白表达
牙体牙髓牙周病学杂志000401 [摘 要]目的：通过检测牙胚发育不同阶段牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达情况，探讨其在牙齿发育过程中的作用。方法：采用免疫组织化学染色技术，观测小鼠牙齿发育各阶段标本中DSPP的表达。结果：DSPP的蛋白表达始于钟状中期，在内釉细胞和正在极化的成牙本质细胞中表达，牙体组织形成开始，则转至成牙本质细胞，直至牙冠硬组织完全形成。此阶段在成釉细胞有反复表达。牙齿萌出时，该蛋白无论在成牙本质细胞还是在成釉细胞表达均为阴性。结论：DSPP在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性；它可能在牙冠硬组织的形成，牙齿萌出时间点的确定方面具有重要作用。
, http://www.100md.com
[中图号]R780.2 [文献标识码]A
[文章编号]1005-2593(2000)04-0191-03
The expression of dentin sialophosphoprotein during mouse teeth development
ZHANG Rong,XIAO Ming-zhen,XIE Xin-mei,et al
(School of Stomatology,The Fourth Militory Medical University,Xi'an 710032,China)
[Abstract]AIM:To evaluate the function of DSPP during mouse teeth development.METHODS:Examine the expression of DSPP in mice at different stages by immunohistochemical technique.RESULTS:Immunohistochemistry showed that DSPP was deposi ted at odontoblasts from middle bell stages to formation of dental crowns.Durin g these stages,DSPP was detected in ameloblasts repeatedly and the expression in ameloblasts turned to be negative when teeth started to erupt.CONCLUSION:The expression of DSPP has temprospacial characters.It may play an important role during tooth morphogenesis and eruption.
, 百拇医药
[Key words]dentin sialophosphoprotein;mouse;teeth development;protein expression
牙本质涎磷蛋白(DSPP)是牙本质磷蛋白(DPP)和牙本质涎蛋白( DS P)基因复合体[1，2]。该基因的发现为更好的了解牙本质特异蛋白提供了物质和 理论基础。最近，江卫民等通过蛋白印迹实验(Western blot)证实小鼠牙齿组织中存在DSPP 蛋白，但对DSPP在牙齿整个发育中的表达特性未做进一步的研究[3]。本研究首次 采用免疫组化技术，通过观察DSPP在小鼠牙齿发育不同阶段的表达状况，探讨DSPP在牙齿整 个发育中的作用。
1 材料和方法
1.1 标本制备
取BALB/c小鼠孕16～19d(雌雄同笼，出现阴栓为0天)胎鼠及生后1～6、8d子鼠各3只，断 颈处死后分离并切取含磨牙的上颌骨，置4℃?40g/L多聚甲醛中固定24h，系列乙醇脱水， 石蜡定向包埋，行冠状4μm切片。
, 百拇医药
1.2 免疫组化染色(SP法)
石蜡切片脱蜡至水，3ml/L?H2O2-甲醇室温孵育30min 以消除内源性过氧化物酶活性， 1g /L胰酶37℃消化30min，100ml/L正常山羊血清室温封闭30min，倾去血清，滴加1:50稀 释的 兔抗小鼠DSPP多克隆抗体，4℃过夜。37℃复温1h，滴加1:100稀释的生物素标记二抗(Zyme d)，37℃孵育30min，最后滴加1:100辣根酶标记链霉卵白素(Zymed)，37℃孵育30min。 以上每一步骤后用0.01mol/L PBS缓冲液振洗3次，每次5min。滴加新鲜配置的DAB显色液， 镜下控制显色,苏木精复染，二甲苯透明、封片。阴性对照由正常兔血清替代一抗。
2 结果
DSPP在帽状期及钟状早期牙胚(孕16～17d)中呈阴性表达(图1)，钟状中期(孕18～19d )在内釉细胞表达。此时，内釉细胞所对应的分泌期前成牙本质细胞(presecrator y odontoblast)呈弱阳性表达。钟状中晚期(生后1～2d)，釉-牙本质界，正在极化的成 牙本质细胞(polorizing odontoblast，PolO)、功能型成牙本质细胞(functional odont oblast FO)、成熟型成牙本质细胞(mature odontoblast，MO)及它们所对应的前成釉细 胞(对 应PolO ，FO)表达均为强阳性；靠近牙尖的部分成釉细胞呈弱阳性；而牙尖处成熟的成釉 细胞表达为阴性(图2、3)；硬组织形成、矿化期(生后3～6d)，成牙本质细胞表达 较强 ，直至牙冠硬组织完全形成；牙冠形成后期(6d)，当牙尖处的成釉细胞开始与外釉细胞、 星网层细胞结合时，此处成釉细胞再次表达DSPP(图4)；缩余釉上皮细胞已形成，牙齿萌 出时，该蛋白在成牙本质细胞弱表达而在成釉细胞中的表达又转为阴性。
, 百拇医药
图1 钟状早期牙胚，免疫组化染色法 (×20 SP法)
图2 钟状中晚期牙胚，免疫组化染色法 (×10 SP法)
图3 钟状中晚期牙胚，免疫组化染色法 (×40 SP法)
图4 硬组织形成后期，免疫组化染色法 (×20 SP法)
3 讨论
DSPP基因是DPP及DSP的联合体，它的发现使得对于牙本质形成机理的研究进入了一个新 的领域。本研究结果显示：DSPP的表达有一定的时空特异性。它在小鼠磨牙帽状期及钟状早 期无表达(与在大鼠牙胚进行的原位杂交结果一致[4，5])，而在细胞分化早期( 分 泌期前成牙本质细胞和前成釉细胞)和成牙本质细胞其他各期(PolO 、FO及MO)的表达说 明，无论成牙本质细胞分化的阶段如何，DSPP的表达具有相同的调控途径。
, http://www.100md.com
牙齿的发育是上皮-间充质之间交互持续作用的结果。阶段特异的牙齿内层上皮可加速前成 牙本质细胞极性倒转，细胞分化为成熟的成牙本质细胞；而成牙本质细胞分泌的基质又进一 步触发前成釉细胞向成釉细胞分化[6]。DSPP在前成釉细胞的表达，提示这一蛋白 可能在诱导细胞分化中参与了某些信号分子的作用过程。有学者[4]曾在对孕18.5d 及生后2d大鼠的切牙和磨牙的原位杂交中发现，DSPP在前成釉细胞中有一过性表达，该表达 随着前期牙本质、牙本质的沉积突然消失。由此推测，成牙本质细胞可能通过分泌某种未知 的 信号分子，直接或间接的调控DSPP在前成釉细胞的表达；前期牙本质、牙本质在上皮-间充 质界的沉积、矿化切断了信号分子的通路，从而阻止了DSPP在成釉细胞的表达。本实验在对 生后1d小鼠牙胚切片的检测中得到了与原位杂交一致的结果。有趣的是，作者在对生后3～8 d小鼠牙胚的进一步观察中发现，该蛋白在分化成熟的成釉细胞、开始与外釉细胞、星网层 细胞结合的成釉细胞中再次出现一过性表达。而当缩余釉上皮细胞已形成，牙齿开始萌出时 ，该 蛋白在成釉细胞中的表达又转为阴性。这一结果证实：①成牙本质细胞和成釉细胞间确实 存在某种(或某些)分子，它(或它们)对DSPP在成釉细胞的表达起调控作用。这一作用并 未因为牙本质的沉积、矿化而消失，而是贯穿牙齿发育的各个时期(钟状早期前除外)。② 上皮-间充质间的相互作用是持续的，成牙本质细胞不但在牙齿发育早期分泌基质，触发 前成釉细胞向成釉细胞分化。本实验结果还提示：它通过分泌信号分子和DSPP，在牙冠硬组 织的形成、牙齿萌出时间点的确定方面具有重要作用。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]MacDougall M，Simmons T，Luan X，et al.Dentin phosphoprotein and dentin sialoproprein are cleavage products expressed from a singale transcript codededby a gene on humen chromosome 4[J].J Biol Chem,1997，272:835
[2]Ritchie HH，Ritchie DG，Wang LH，et al.Six decades of dentin ogenesis research:Historical and prospective views on phosphoprotein and dentin sialoprotein[J].Eur J Oral Sci,1998，106:211
, 百拇医药
[3]江卫民.小鼠牙本质涎磷蛋白cDNA克隆、表达、纯化、抗体制备及组织表达特异性研究:[学位论文][D].西安：第四军医大学口腔医学院,1999
[4]Bleicher F,Couble ML,Farges JC,et al.Senquential expression of matrix protein genes in developing rat teeth[J].Matix Biol,1999，18(2):133
[5]Bigue-Kirn C,Krebsbach PH,Bartlett JD,et al.Dentin sialoprotein,dentin phosphoprotein,enamelysin and ameloblastin:tooth-specific molecules that are distinctively expressed during murine dental differentiation[J].Eur J Oral Sci,1998，106:963
[6]Ruch JV,Lesot H,Begue-kirn C.Odontoblast differentiation[J].Int J Dev Biol,1995，39:51
收稿日期：1999-10-27, http://www.100md.com
单位：张蓉(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；肖明振(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；谢欣梅(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；赵守亮(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)；江卫民(第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032)
关键词：牙本质涎磷蛋白；小鼠；牙齿发育；蛋白表达
牙体牙髓牙周病学杂志000401 [摘 要]目的：通过检测牙胚发育不同阶段牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)的表达情况，探讨其在牙齿发育过程中的作用。方法：采用免疫组织化学染色技术，观测小鼠牙齿发育各阶段标本中DSPP的表达。结果：DSPP的蛋白表达始于钟状中期，在内釉细胞和正在极化的成牙本质细胞中表达，牙体组织形成开始，则转至成牙本质细胞，直至牙冠硬组织完全形成。此阶段在成釉细胞有反复表达。牙齿萌出时，该蛋白无论在成牙本质细胞还是在成釉细胞表达均为阴性。结论：DSPP在牙胚发育过程中的表达具有时空特异性；它可能在牙冠硬组织的形成，牙齿萌出时间点的确定方面具有重要作用。
, http://www.100md.com
[中图号]R780.2 [文献标识码]A
[文章编号]1005-2593(2000)04-0191-03
The expression of dentin sialophosphoprotein during mouse teeth development
ZHANG Rong,XIAO Ming-zhen,XIE Xin-mei,et al
(School of Stomatology,The Fourth Militory Medical University,Xi'an 710032,China)
[Abstract]AIM:To evaluate the function of DSPP during mouse teeth development.METHODS:Examine the expression of DSPP in mice at different stages by immunohistochemical technique.RESULTS:Immunohistochemistry showed that DSPP was deposi ted at odontoblasts from middle bell stages to formation of dental crowns.Durin g these stages,DSPP was detected in ameloblasts repeatedly and the expression in ameloblasts turned to be negative when teeth started to erupt.CONCLUSION:The expression of DSPP has temprospacial characters.It may play an important role during tooth morphogenesis and eruption.
, 百拇医药
[Key words]dentin sialophosphoprotein;mouse;teeth development;protein expression
牙本质涎磷蛋白(DSPP)是牙本质磷蛋白(DPP)和牙本质涎蛋白( DS P)基因复合体[1，2]。该基因的发现为更好的了解牙本质特异蛋白提供了物质和 理论基础。最近，江卫民等通过蛋白印迹实验(Western blot)证实小鼠牙齿组织中存在DSPP 蛋白，但对DSPP在牙齿整个发育中的表达特性未做进一步的研究[3]。本研究首次 采用免疫组化技术，通过观察DSPP在小鼠牙齿发育不同阶段的表达状况，探讨DSPP在牙齿整 个发育中的作用。
1 材料和方法
1.1 标本制备
取BALB/c小鼠孕16～19d(雌雄同笼，出现阴栓为0天)胎鼠及生后1～6、8d子鼠各3只，断 颈处死后分离并切取含磨牙的上颌骨，置4℃?40g/L多聚甲醛中固定24h，系列乙醇脱水， 石蜡定向包埋，行冠状4μm切片。
, 百拇医药
1.2 免疫组化染色(SP法)
石蜡切片脱蜡至水，3ml/L?H2O2-甲醇室温孵育30min 以消除内源性过氧化物酶活性， 1g /L胰酶37℃消化30min，100ml/L正常山羊血清室温封闭30min，倾去血清，滴加1:50稀 释的 兔抗小鼠DSPP多克隆抗体，4℃过夜。37℃复温1h，滴加1:100稀释的生物素标记二抗(Zyme d)，37℃孵育30min，最后滴加1:100辣根酶标记链霉卵白素(Zymed)，37℃孵育30min。 以上每一步骤后用0.01mol/L PBS缓冲液振洗3次，每次5min。滴加新鲜配置的DAB显色液， 镜下控制显色,苏木精复染，二甲苯透明、封片。阴性对照由正常兔血清替代一抗。
2 结果
DSPP在帽状期及钟状早期牙胚(孕16～17d)中呈阴性表达(图1)，钟状中期(孕18～19d )在内釉细胞表达。此时，内釉细胞所对应的分泌期前成牙本质细胞(presecrator y odontoblast)呈弱阳性表达。钟状中晚期(生后1～2d)，釉-牙本质界，正在极化的成 牙本质细胞(polorizing odontoblast，PolO)、功能型成牙本质细胞(functional odont oblast FO)、成熟型成牙本质细胞(mature odontoblast，MO)及它们所对应的前成釉细 胞(对 应PolO ，FO)表达均为强阳性；靠近牙尖的部分成釉细胞呈弱阳性；而牙尖处成熟的成釉 细胞表达为阴性(图2、3)；硬组织形成、矿化期(生后3～6d)，成牙本质细胞表达 较强 ，直至牙冠硬组织完全形成；牙冠形成后期(6d)，当牙尖处的成釉细胞开始与外釉细胞、 星网层细胞结合时，此处成釉细胞再次表达DSPP(图4)；缩余釉上皮细胞已形成，牙齿萌 出时，该蛋白在成牙本质细胞弱表达而在成釉细胞中的表达又转为阴性。
, 百拇医药
图1 钟状早期牙胚，免疫组化染色法 (×20 SP法)
图2 钟状中晚期牙胚，免疫组化染色法 (×10 SP法)
图3 钟状中晚期牙胚，免疫组化染色法 (×40 SP法)
图4 硬组织形成后期，免疫组化染色法 (×20 SP法)
3 讨论
DSPP基因是DPP及DSP的联合体，它的发现使得对于牙本质形成机理的研究进入了一个新 的领域。本研究结果显示：DSPP的表达有一定的时空特异性。它在小鼠磨牙帽状期及钟状早 期无表达(与在大鼠牙胚进行的原位杂交结果一致[4，5])，而在细胞分化早期( 分 泌期前成牙本质细胞和前成釉细胞)和成牙本质细胞其他各期(PolO 、FO及MO)的表达说 明，无论成牙本质细胞分化的阶段如何，DSPP的表达具有相同的调控途径。
, http://www.100md.com
牙齿的发育是上皮-间充质之间交互持续作用的结果。阶段特异的牙齿内层上皮可加速前成 牙本质细胞极性倒转，细胞分化为成熟的成牙本质细胞；而成牙本质细胞分泌的基质又进一 步触发前成釉细胞向成釉细胞分化[6]。DSPP在前成釉细胞的表达，提示这一蛋白 可能在诱导细胞分化中参与了某些信号分子的作用过程。有学者[4]曾在对孕18.5d 及生后2d大鼠的切牙和磨牙的原位杂交中发现，DSPP在前成釉细胞中有一过性表达，该表达 随着前期牙本质、牙本质的沉积突然消失。由此推测，成牙本质细胞可能通过分泌某种未知 的 信号分子，直接或间接的调控DSPP在前成釉细胞的表达；前期牙本质、牙本质在上皮-间充 质界的沉积、矿化切断了信号分子的通路，从而阻止了DSPP在成釉细胞的表达。本实验在对 生后1d小鼠牙胚切片的检测中得到了与原位杂交一致的结果。有趣的是，作者在对生后3～8 d小鼠牙胚的进一步观察中发现，该蛋白在分化成熟的成釉细胞、开始与外釉细胞、星网层 细胞结合的成釉细胞中再次出现一过性表达。而当缩余釉上皮细胞已形成，牙齿开始萌出时 ，该 蛋白在成釉细胞中的表达又转为阴性。这一结果证实：①成牙本质细胞和成釉细胞间确实 存在某种(或某些)分子，它(或它们)对DSPP在成釉细胞的表达起调控作用。这一作用并 未因为牙本质的沉积、矿化而消失，而是贯穿牙齿发育的各个时期(钟状早期前除外)。② 上皮-间充质间的相互作用是持续的，成牙本质细胞不但在牙齿发育早期分泌基质，触发 前成釉细胞向成釉细胞分化。本实验结果还提示：它通过分泌信号分子和DSPP，在牙冠硬组 织的形成、牙齿萌出时间点的确定方面具有重要作用。
, http://www.100md.com
参考文献：
[1]MacDougall M，Simmons T，Luan X，et al.Dentin phosphoprotein and dentin sialoproprein are cleavage products expressed from a singale transcript codededby a gene on humen chromosome 4[J].J Biol Chem,1997，272:835
[2]Ritchie HH，Ritchie DG，Wang LH，et al.Six decades of dentin ogenesis research:Historical and prospective views on phosphoprotein and dentin sialoprotein[J].Eur J Oral Sci,1998，106:211
, 百拇医药
[3]江卫民.小鼠牙本质涎磷蛋白cDNA克隆、表达、纯化、抗体制备及组织表达特异性研究:[学位论文][D].西安：第四军医大学口腔医学院,1999
[4]Bleicher F,Couble ML,Farges JC,et al.Senquential expression of matrix protein genes in developing rat teeth[J].Matix Biol,1999，18(2):133
[5]Bigue-Kirn C,Krebsbach PH,Bartlett JD,et al.Dentin sialoprotein,dentin phosphoprotein,enamelysin and ameloblastin:tooth-specific molecules that are distinctively expressed during murine dental differentiation[J].Eur J Oral Sci,1998，106:963
[6]Ruch JV,Lesot H,Begue-kirn C.Odontoblast differentiation[J].Int J Dev Biol,1995，39:51
收稿日期：1999-10-27, http://www.100md.com