薏苡仁注射液对血管生成的影响
作者：姜晓玲 张良 徐卓玉 郭成浩
单位：姜晓玲 郭成浩(青岛大学医学院病理教研室 青岛 266021)；张良 徐卓玉(青岛市松山医院)
关键词：薏苡仁；新生血管化
肿瘤000428 中图分类号：R73.36； 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0313-02
肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，有效预防、治疗肿瘤是现今的研究热点。抗肿瘤研究途径之一是抑制血管生成。至今已分离、纯化了多种血管生成抑制因子，抗肿瘤药物薏苡仁注射液(康莱特注射液，KLT)可提高机体免疫力、控制肿瘤细胞生长，但其与血管生成之间的关系仍不清楚。本实验采用主动脉无血清培养模型检测KLT对血管生成的作用，为临床肿瘤治疗提供实验基础，开拓药物应用范围。
, 百拇医药 材料与方法
1.试剂与方法
薏苡仁注射液由浙江康莱特药业有限公司(商品名：康莱特注射液批号 9008191-2)提供，DMEM Medium、HAM F-12Nutrient Mixture均为GIBCO产品，VitE购自上海试剂二厂。
倒置显微镜：OLYMPUS产品；250ml培养瓶：Greiner Labortechnik产品；YJ-875医用净化工作台；苏州净化设备公司；低温高速离心机：SIGMA 3K30 B.Braun Biotech International产品。
2.组织培养
取2～3周龄健康雄性大鼠的胸主动脉及腹主动脉，切成1 mm长的主动脉环。用改良的Elsdale和Bard[1]的胶原配制方法提纯胶原溶液，按7∶2∶1的比例混合胶原溶液、11.7 mg/ml的NaHCO3及10×MEM。在琼脂糖池(内、外直径分别为10 mm、17 mm)底部滴4滴胶原混合液，胶化后滴满胶原混合液，将主动脉环放入池内。充分凝固后培养瓶内加入培养基及药物，庆大霉素200 μg/ml，35.5℃培养，隔日更换培养液。
, 百拇医药
3.实验分组
A组 对照组；B组：0.1 mg/ml Vit E;C组：10 μl/ml KLT。
4.血管生成的定量
每日计数新形成的微血管数量，以获得血管生长曲线。通过在纸上绘出主动脉环的轮廓，辨别同一培养瓶中的各个培养物。在倒置显微镜下计数微血管的标准如下：
(1)根据微血管芽的独特形态(较大的厚度、一致的内聚性、持续延伸的生长方式)可将其与成纤维细胞相鉴别。
(2)一个血管芽二叉分枝，产生2个新的芽，计为2个。
(3)每个血管襻当作2个芽计数，因为它常由2个会聚的微血管吻合而成。
用SPSS分析软件及Student-Newman-Keuls检验分析实验各组之间的统计差别。
, 百拇医药
结果
1.血管生长特征
DMEM/HAM F12中微血管生长的特点是：迟滞期→生长期→衰退期。实心的内皮细胞血管芽于培养48 h后，从主动脉切割末端及其侧面长出，于第2周末开始快速生长，持续至第3周迅速衰退(见图1)。
图1 A组(对照组)血管生长曲线
2.Vit E对血管生成的影响
图2显示0.1 mg/ml Vit E处理主动脉环得到的生长曲线。生长后期新生血管数目少于对照组，生长曲线低于后者，有显著性差异(P<0.01)。
, 百拇医药
图2 B组(0.1 mg/ml Vit E组血管生长曲线
3.KLT对血管生成的影响
10 μl/ml KLT处理的主动脉环少有新血管生成，于第1周末即进入衰退期，生长曲线低平，抑制血管生成作用明显，与A、B组之间均有显著性差异，C组vsA组(P<0.01)，C组vsB组：(P<0.01)(见图3)。
图3 C组(10 μl/ml KLT组)对血管生成的影响
讨论
本研究采用无血清培养基中的三维胶原凝胶培养大鼠主动脉，是在没有能限制、灭活或刺激被测底物的血清因子条件下，研究血管生成抑制剂的作用，具有灵敏性、可靠性高的优点，是研究血管生成的先进方法之一。除设立空白对照组，本实验又设立0.1 mg/ml Vit E对照组，以比较KLT与其它血管生成抑制剂的作用。1994年Kelloff等人提出，Vit E通过清除氧自由基及恢复免疫反应而抑制增生活性，从而具有对肿瘤的化学预防作用。1996年，Shklar与Schwartz[2]利用动物实验发现，应用Vit E治疗二甲苯蒽(DMBA)所致肿瘤，肿瘤体积明显小于对照组，血管内皮细胞受到抑制，TGF-α的表达也受到阻抑。说明Vit E与肿瘤及血管生成之间存在一定的关系。在本研究组所进行的前期实验中，发现0.2 mg/ml、0.1 mg/ml Vit E均有抑制血管生成作用，其中0.1 mg/ml Vit E处理组血管生成数目更少，故在此实验中采用0.1 mg/ml Vit E作为对照组之一。
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本实验采用10 μl/ml KLT(此浓度抑制肿瘤作用最强[3])处理主动脉，发现极少有新生血管，血管生长亦很快进入衰退期(见图3)，对血管生成的抑制作用显著(P<0.01)，效果优于0.1 mg/ml Vit E组(P<0.01)。说明KLT抗肿瘤的途径之一是通过抑制血管生成，但其作用机制至今仍不清楚。
KLT是从中药薏苡仁中经现代科学方法提制的注射制剂，属国家二类新药。KLT作为一种双相广谱抗癌药物，既能够杀伤肿瘤细胞，又能提高机体的免疫功能，同时可为机体提供能量，减轻放化疗的毒副作用，提高生活质量[4]。本实验是首次研究KLT对血管生成的抑制作用，发现其抗肿瘤的另一重要途径。考虑KLT抑制血管生成从而抗肿瘤的可能机制有：(1)抑制血管内皮分裂和迁移，细胞周期研究发现KLT具有使细胞周期阻滞于G2+M期，DNA合成期(S期)比例减少的作用；(2)抑制肿瘤细胞释放血管生成正向调控因子；(3)以抗体的形式阻断血管生成正向调控因子或它的受体；(4)干扰内皮细胞分化成为完整毛细血管、防止新生血管与宿主血管之间的吻合形成。具体通过何种途径达到抑制血管生成、抗肿瘤的作用，还需进一步研究证实。
, 百拇医药
总之，KLT在控制肿瘤生长、抗癌细胞转移、提高机体免疫功能、提供高能量营养、控制癌性积液的同时，具有显著的抑制血管生成作用，且无明显毒副作用，证明KLT在目前抗肿瘤药物中是一种较理想的治疗药物，值得在临床推广应用。
作者简介：姜晓玲，女，硕士生。
参考文献
[1]Elsdale T,Bard J.Collagen substrate for studies in cell behavior〔J〕.J Cell Biol,1972,54:626
[2]Shklar G,Schwartz JL.Vitamin E inhibits experimental carcinogenesis and tumor angiogenesis〔J〕.Eur J Cancer B Oral Oncol,1996,32B(2):114
[3]王俊杰，孙新臣，申文江，等.康莱特注射液诱发肾癌细胞凋亡及p53、bcl-2表达的研究〔J〕.中国肿瘤临床，1999，6：439
[4]冉江华，张家骅，王曦，等.康莱特对大肠癌患者术后免疫功能的影响〔J〕.中国肿瘤临床与康复，1999，2：20
(收稿日期：2000-01-1), 百拇医药
单位：姜晓玲 郭成浩(青岛大学医学院病理教研室 青岛 266021)；张良 徐卓玉(青岛市松山医院)
关键词：薏苡仁；新生血管化
肿瘤000428 中图分类号：R73.36； 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)04-0313-02
肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，有效预防、治疗肿瘤是现今的研究热点。抗肿瘤研究途径之一是抑制血管生成。至今已分离、纯化了多种血管生成抑制因子，抗肿瘤药物薏苡仁注射液(康莱特注射液，KLT)可提高机体免疫力、控制肿瘤细胞生长，但其与血管生成之间的关系仍不清楚。本实验采用主动脉无血清培养模型检测KLT对血管生成的作用，为临床肿瘤治疗提供实验基础，开拓药物应用范围。
, 百拇医药 材料与方法
1.试剂与方法
薏苡仁注射液由浙江康莱特药业有限公司(商品名：康莱特注射液批号 9008191-2)提供，DMEM Medium、HAM F-12Nutrient Mixture均为GIBCO产品，VitE购自上海试剂二厂。
倒置显微镜：OLYMPUS产品；250ml培养瓶：Greiner Labortechnik产品；YJ-875医用净化工作台；苏州净化设备公司；低温高速离心机：SIGMA 3K30 B.Braun Biotech International产品。
2.组织培养
取2～3周龄健康雄性大鼠的胸主动脉及腹主动脉，切成1 mm长的主动脉环。用改良的Elsdale和Bard[1]的胶原配制方法提纯胶原溶液，按7∶2∶1的比例混合胶原溶液、11.7 mg/ml的NaHCO3及10×MEM。在琼脂糖池(内、外直径分别为10 mm、17 mm)底部滴4滴胶原混合液，胶化后滴满胶原混合液，将主动脉环放入池内。充分凝固后培养瓶内加入培养基及药物，庆大霉素200 μg/ml，35.5℃培养，隔日更换培养液。
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3.实验分组
A组 对照组；B组：0.1 mg/ml Vit E;C组：10 μl/ml KLT。
4.血管生成的定量
每日计数新形成的微血管数量，以获得血管生长曲线。通过在纸上绘出主动脉环的轮廓，辨别同一培养瓶中的各个培养物。在倒置显微镜下计数微血管的标准如下：
(1)根据微血管芽的独特形态(较大的厚度、一致的内聚性、持续延伸的生长方式)可将其与成纤维细胞相鉴别。
(2)一个血管芽二叉分枝，产生2个新的芽，计为2个。
(3)每个血管襻当作2个芽计数，因为它常由2个会聚的微血管吻合而成。
用SPSS分析软件及Student-Newman-Keuls检验分析实验各组之间的统计差别。
, 百拇医药
结果
1.血管生长特征
DMEM/HAM F12中微血管生长的特点是：迟滞期→生长期→衰退期。实心的内皮细胞血管芽于培养48 h后，从主动脉切割末端及其侧面长出，于第2周末开始快速生长，持续至第3周迅速衰退(见图1)。
图1 A组(对照组)血管生长曲线
2.Vit E对血管生成的影响
图2显示0.1 mg/ml Vit E处理主动脉环得到的生长曲线。生长后期新生血管数目少于对照组，生长曲线低于后者，有显著性差异(P<0.01)。
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图2 B组(0.1 mg/ml Vit E组血管生长曲线
3.KLT对血管生成的影响
10 μl/ml KLT处理的主动脉环少有新血管生成，于第1周末即进入衰退期，生长曲线低平，抑制血管生成作用明显，与A、B组之间均有显著性差异，C组vsA组(P<0.01)，C组vsB组：(P<0.01)(见图3)。
图3 C组(10 μl/ml KLT组)对血管生成的影响
讨论
本研究采用无血清培养基中的三维胶原凝胶培养大鼠主动脉，是在没有能限制、灭活或刺激被测底物的血清因子条件下，研究血管生成抑制剂的作用，具有灵敏性、可靠性高的优点，是研究血管生成的先进方法之一。除设立空白对照组，本实验又设立0.1 mg/ml Vit E对照组，以比较KLT与其它血管生成抑制剂的作用。1994年Kelloff等人提出，Vit E通过清除氧自由基及恢复免疫反应而抑制增生活性，从而具有对肿瘤的化学预防作用。1996年，Shklar与Schwartz[2]利用动物实验发现，应用Vit E治疗二甲苯蒽(DMBA)所致肿瘤，肿瘤体积明显小于对照组，血管内皮细胞受到抑制，TGF-α的表达也受到阻抑。说明Vit E与肿瘤及血管生成之间存在一定的关系。在本研究组所进行的前期实验中，发现0.2 mg/ml、0.1 mg/ml Vit E均有抑制血管生成作用，其中0.1 mg/ml Vit E处理组血管生成数目更少，故在此实验中采用0.1 mg/ml Vit E作为对照组之一。
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本实验采用10 μl/ml KLT(此浓度抑制肿瘤作用最强[3])处理主动脉，发现极少有新生血管，血管生长亦很快进入衰退期(见图3)，对血管生成的抑制作用显著(P<0.01)，效果优于0.1 mg/ml Vit E组(P<0.01)。说明KLT抗肿瘤的途径之一是通过抑制血管生成，但其作用机制至今仍不清楚。
KLT是从中药薏苡仁中经现代科学方法提制的注射制剂，属国家二类新药。KLT作为一种双相广谱抗癌药物，既能够杀伤肿瘤细胞，又能提高机体的免疫功能，同时可为机体提供能量，减轻放化疗的毒副作用，提高生活质量[4]。本实验是首次研究KLT对血管生成的抑制作用，发现其抗肿瘤的另一重要途径。考虑KLT抑制血管生成从而抗肿瘤的可能机制有：(1)抑制血管内皮分裂和迁移，细胞周期研究发现KLT具有使细胞周期阻滞于G2+M期，DNA合成期(S期)比例减少的作用；(2)抑制肿瘤细胞释放血管生成正向调控因子；(3)以抗体的形式阻断血管生成正向调控因子或它的受体；(4)干扰内皮细胞分化成为完整毛细血管、防止新生血管与宿主血管之间的吻合形成。具体通过何种途径达到抑制血管生成、抗肿瘤的作用，还需进一步研究证实。
, 百拇医药
总之，KLT在控制肿瘤生长、抗癌细胞转移、提高机体免疫功能、提供高能量营养、控制癌性积液的同时，具有显著的抑制血管生成作用，且无明显毒副作用，证明KLT在目前抗肿瘤药物中是一种较理想的治疗药物，值得在临床推广应用。
作者简介：姜晓玲，女，硕士生。
参考文献
[1]Elsdale T,Bard J.Collagen substrate for studies in cell behavior〔J〕.J Cell Biol,1972,54:626
[2]Shklar G,Schwartz JL.Vitamin E inhibits experimental carcinogenesis and tumor angiogenesis〔J〕.Eur J Cancer B Oral Oncol,1996,32B(2):114
[3]王俊杰，孙新臣，申文江，等.康莱特注射液诱发肾癌细胞凋亡及p53、bcl-2表达的研究〔J〕.中国肿瘤临床，1999，6：439
[4]冉江华，张家骅，王曦，等.康莱特对大肠癌患者术后免疫功能的影响〔J〕.中国肿瘤临床与康复，1999，2：20
(收稿日期：2000-01-1), 百拇医药