血管抑素、内皮抑素与肺癌关系的研究进展
作者：刘颖 周清华
单位：刘颖 周清华(610041 成都，华西医科大学附属第一医院胸心外科)
关键词：
中国肺癌杂志000425 【中图分类号】 R73-3
为了解癌症发生和转移的机理，近一个世纪以来，人们进行了多方面的研究。早在1945年，Algire就提出了肿瘤血管形成的概念，实体肿瘤形成后即进入无血管的浸润前期，此时肿瘤结节很少能长到2～3mm3，细胞数亦在107以内。但一旦肿瘤出现血管形成，即迅速生长[1]。在70年代早期，Folkman又提出一种假说，即肿瘤生长和转移依赖于肿瘤血管形成，抑制其血管形成能够控制其生长和转移。但这一假说直到90年代才由许多实验研究所证实[2]。长时间以来，晚期恶性肿瘤患者的治疗主要依靠传统的化学药物治疗方法，并主要针对的是异常增殖的恶性细胞。但因其毒副作用大，易产生耐药性等缺点，化疗的疗效并不理想。因此，人们一直试图寻找抗肿瘤治疗的新途径和新方法，抗肿瘤血管生成就是近年来出现的倍受关注的一种肿瘤治疗新方法，并得到了较为广泛和深入的研究。目前已发现了多种血管生成抑制剂，如血小板因子-4(PF-4)、γ-干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、TSP-1、TNP-470、GM-1474、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、可溶性FGF受体以及血管抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)等[3]。其中尤以1994年发现的血管抑素和1997年发现的内皮抑素更为引人注意。虽然两种因子的研究尚处于实验室阶段，但由于它们在抗肿瘤血管生成方面所表现出的显著效果，及其提供的治疗恶性肿瘤的新途径，现已成为全世界医药界和肿瘤界关注的焦点。本文拟就血管抑素和内皮抑素的研究进展及其与肺癌的关系作一介绍。
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1 血管抑素及内皮抑素的发现
在临床上和一些实验中，不断观察到一些原发肿瘤的切除可能导致远处转移瘤的加速生长。这种加速生长独立于特异性免疫反应而存在，被称为“伴发的肿瘤抵抗”。O'Reilly等研究发现某些肿瘤如Lewis肺癌，能够抑制其远处转移癌的生长，只有在原发肿瘤切除后，转移瘤才开始生长。这一发现使O'Reilly等提出一种新的假说，即原发性肿瘤分泌两种相拮抗的因子，分别抑制和刺激血管生成。原发瘤产生血管生成刺激因子超过血管生成抑制因子，因而能够在自身血管床上刺激血管生成。而在转移瘤或继发瘤中，经循环到达的血管抑制因子超过原发瘤和转移灶自身产生的血管生成刺激因子，从而在转移瘤或继发肿瘤的血管床上抑制血管生成，进而抑制其生长[4]。目前已发现了多种血管生成刺激因子，主要有血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维生成因子(bFGF)，血管生长素(angiogenin)，白介素-8(IL-8)，粒系-集落刺激因子(G-CSF)，转化生长因子(TGF)等。
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1.1 血管抑素的发现 1994年O'Reilly等发现移植了Lewis肺癌小鼠的血浆和尿液能够在体外特异性抑制血管内皮细胞的增生，而对照组动物则无此作用。他们从Lewis肺癌小鼠血浆中提纯出一个38×103u的纤溶酶原片段，经测序后命名为血管抑素。相应的人纤溶酶原的片段具有相似的作用。经全身给予血管抑素而不是完整的纤溶酶原，便能有效地抑制转移瘤的血管形成和生长[4]。
1.2 内皮抑素的发现 1997年O'Reilly和Folkman等发现体外培养的鼠血管内皮细胞瘤(EOMA)的细胞培养液能够抑制体外牛毛细血管内皮细胞增殖。他们从培养液中提纯出一种新的蛋白质，命名为内皮抑素。它与早先发现的38×103u的血管抑素不同，分子量仅为20×103u，序列分析显示其为胶原蛋白18(collagen XVIII)C末端片段。而人的内皮抑素分子量为18×103u。内皮抑素能抑制血管内皮细胞生长，进而抑制新生血管生长，以及肿瘤生长和转移[5]。
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2 血管抑素和内皮抑素的结构与来源
2.1 血管抑素的结构和来源 血管抑素的分子量为38×103u，它属于内生性蛋白质，为纤溶酶原的裂解片断，能特异性抑制血管内皮细胞的生长。纤溶酶原是一种单链糖蛋白，分子量为92×103u，含有791个氨基酸。特异性裂解Arg561-Val562肽键位点，可产生双链纤溶酶分子(分子量分别为65×103u、25×103u)，两条链由两条二硫键连接。位于25×103u链上的COOH-末端蛋白酶结构域上的活性位点包括His603、Asp646和Ser741，而NH2-末端结构域包括5个kringle 结构(即含有3对二硫键的区域)，血管抑素则来源于这5个kringle区的前4个。这4个kringle区有很高的同源性，共有两处糖基化位点。其中位于kringle 1～3区的赖氨酸结合位点，在纤维溶解调控中起关键作用[6]。Kringle 1、2、3区有抗血管内皮细胞增生功能，kringle 4区无此功能[7]。经氨基酸序列分析，血管抑素N-末端起始于纤溶酶原的第98位氨基酸(缬氨酸)，C-末端终止于第440位氨基酸，共有342个氨基酸，而重组鼠血管抑素的氨基酸序列是天门冬氨酸20……丝氨酸32—丝氨酸—精氨酸97—缬氨酸98……甘氨酸458。
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血管抑素和纤溶酶原内部一个片段的同源性超过98%。使用抗纤溶酶原kringle1、2、3区的抗体，可使血管抑素的作用丧失。用金属弹性蛋白酶(MME)酶解人纤溶酶原产生的裂解片段可在体外抑制牛血管内皮细胞的增殖，而完整的纤溶酶原则无此作用，这些证据都说明了血管抑素是纤溶酶原的裂解片段[1～4]。
2.2 内皮抑素的结构和来源 内皮抑素的分子量为20×103 u，序列分析证实为胶原蛋白18C-末端片断。内皮抑素位于其C-端的315个氨基酸组成的非胶原蛋白特征结构域中，这一结构域内有4个保守的半胱氨酸。
胶原蛋白18在体内分布很广，存在于胚胎和成年鼠各种组织的基底膜上。它与很多含血管的基底膜和一些不含血管的基底膜相联系。内皮抑素共有184个氨基酸，其中酸性氨基酸6个，碱性氨基酸29个，疏水性氨基酸占42%，共有4个半胱氨酸。Ludger等从人的循环系统中提取出的人内皮抑素与鼠内皮抑素有86%的序列完全相同，都包含了4个保守的半胱氨酸，说明它们的结构可能非常相似。
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Standker等分离出人内皮抑素在血循环中的形式，即在其N-末端缺少了12个氨基酸的序列[8]。它不表现对内皮细胞的抑制作用，故很可能是内皮抑素代谢的副产物[9]。Boehm和O'Reilly等最近发现，锌是内皮抑素的组成成分。内皮抑素从前体激活到发挥抗血管生成作用都有赖于锌的存在。内皮抑素以1：1的容积克分子比与锌(Zn)结合。内皮抑素的锌的配基共有4个，分别位于N-末端1、3、11位组氨酸和76位天冬氨酸上，而且前两位组氨酸对于锌的结合是必须的。如果锌的配体发生突变使锌不能结合于内皮抑素或用EDTA去除Zn2+，则严重影响内皮抑素的生物学活性。内皮抑素结合锌的能力主要作用于两个方面：一是锌的结合保护了内皮抑素的N-末端不被蛋白酶分解，从而防止其失活；二是锌结合后内皮抑素的结构对于其和假定的内皮细胞受体的相互作用是至关重要的[10，11]。
3 血管抑素和内皮抑素的产生机制、作用机制和生物学功能
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3.1 血管抑素的产生机制、作用机制和生物学功能
3.1.1 血管抑素的产生机制 肿瘤细胞中测不到表达纤溶酶原的mRNA或血管抑素蛋白，说明肿瘤细胞不能直接产生血管抑素。在体外，血管抑素的产生有两种途径，一种途径是由弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶家族(MMP-3，MMP-7，MMP-9，MMP-12)对人纤溶酶原的限制性酶酶解作用产生[6，12，13]，另一种途径是由人前列腺癌细胞系(PC-3，DU-145，LN-Cap)产生的丝氨酸蛋白酶的酶解作用[12]。而在体内，其产生机制尚不十分清楚，研究表明主要有三种途径。一是最近研究发现的在Lewis肺癌小鼠中，血管抑素的产生与肿瘤内浸润巨噬细胞中MME的功能上调有关。肿瘤细胞产生的粒细胞、巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)使肿瘤内浸润巨噬细胞中MME功能上调(诱导肿瘤内浸润巨噬细胞中MME基因的表达)，而MME又在体内裂解纤溶酶原产生血管抑素[3，14]。二是直接酶解途径，即某些肿瘤如PC-3前列腺癌分泌尿激酶(uPA)和硫巯基供体酶(FSDs)，直接裂解纤溶酶原产生血管抑素[7]。三是肿瘤细胞本身产生的MMP增加，使正常存在于血循环中的纤维酶原裂解生成血管抑素，以对抗其自身产生的促血管生成因子，如VEGF、bFGF等，以达到平衡[6]。
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3.1.2 血管抑素的作用机制 血管抑素对毛细血管内皮细胞生长的抑制作用可能通过位于内皮细胞膜上的受体介导。1999年，Moser等发现血管抑素可与内皮细胞表面ATP合成酶的α/β亚单位结合，从而产生抗血管生成作用及下调内皮细胞的增生和移行作用。阻断它们的结合可极大削弱血管抑素的抗肿瘤生长效益[15]。此外，血管抑素可能阻断整合素等粘附分子介导的增殖信号，从而阻断了VEGF、bFGF的信号通路。血管抑素还可显著抑制内皮细胞的移行和血管化，虽然对生长因子的信号传导无影响，但可激活局灶性粘附激酶，使内皮细胞粘附团块不能形成[16]。
1998年Luo等[17]用重组的血管抑素处理牛内皮细胞，检查E-选择素的表达和功能，结果发现E-选择素在增殖期内皮细胞中增加了4～5倍，而在静止期内皮细胞中则变化很小。同时还发现，E-选择素阳性的细胞多处于细胞周期中的G2和M期。但进一步研究却证实血管抑素虽然选择性增高E-选择素在增殖期细胞中的表达，但对于内皮细胞的G0/G1、S和G2/M的细胞周期分布却无明显影响。这项研究证实了血管抑素可影响增殖期内皮细胞的基因表达，同时提出了血管抑素在体内抑制肿瘤生长，而对静止期内皮细胞却无明显影响的可能机制[17]。
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3.1.3 血管抑素的生物学功能 血管抑素在体外可强烈抑制牛血管内皮细胞的增殖，在体内则可抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖，从而抑制肿瘤及转移瘤的生长。最近发现在抑制毛细血管内皮细胞增生方面，kringle 5的作用甚至比血管抑素更强。有人巳开始研究用纤维酶介导蛋白裂解产生的kringle 1～5来抑制血管生成和肿瘤生长[18]。
3.2 内皮抑素的产生机制、作用机制和生物学功能
3.2.1 内皮抑素的产生机制和作用机制 内皮抑素产生和调控的机制尚不清楚，究竟是何种蛋白酶酶解胶原蛋白18产生内皮抑素有待进一步研究。内皮抑素介导的肿瘤生长抑制作用的机制亦不完全清楚，可能是通过大大提高肿瘤细胞程序化死亡的速率来抑制肿瘤的生长。现有研究表明，其可能的机制有：①内皮抑素可阻碍增生内皮细胞与基质蛋白的相互作用，从而诱导内皮细胞凋亡。同时还可减少Bcl-2、Bcl-X1抗凋亡蛋白的量[19，20]。②引起内皮细胞G1期停滞，从而抑制内皮细胞增殖[21]。③与VEGF和bFGF等血管生成刺激因子竞争性结合生长因子信号传导系统中的硫酸肝素蛋白聚糖受体，从而抑制血管生成[20]。
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3.2.2 内皮抑素的生物学功能 内皮抑素对体外内皮细胞具有明显的增殖抑制活性，在体内亦可特异性抑制内皮细胞增生和新生血管生成，从而抑制肿瘤的生长。其抑制血管形成的作用大约是血管抑素的30倍。
4 血管抑素和内皮抑素与肺癌的关系
在治疗癌症过程中，获得性抗药性是一个很重要的问题，它在所有肿瘤患者中的比例高达30%。在美国，每年都有超过50万人死于癌症，其中很多死于对化疗药物的耐药。获得性耐药性的产生在部分程度上是基于肿瘤细胞基因组的不稳定性和高突变率。相比之下，内皮细胞遗传稳定，突变率低，所以从理论说针对肿瘤内皮细胞的抗血管生成因子不会或只会引起很弱的抗药性。各型肺癌对化疗药物都会产生一定程度的耐药性，其中尤以小细胞肺癌为著。所以，血管抑素和内皮抑素的研究对肺癌的治疗亦有重要指导意义[22]。在实验中，长期直接应用血管抑素或内皮抑素蛋白会带来一系列药理学和理论上的困难，且对局部侵袭性肿瘤的疗效不理想。研究发现，使用逆转录病毒和腺病毒载体转导血管抑素cDNA，可在体外抑制内皮细胞的生长，在体内抑制血管生长。这项研究提供了一个有效的治疗恶性肿瘤的新方法[23]。
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4.1 血管抑素与肺癌的关系 1994年，O'Reilly等用纯化的人血管抑素腹膜内注射入Lewis肺癌(LLC)小鼠体内。第1天用24μg/20g小鼠，接下来用12μg/d，连用13天。观察到此疗法显著抑制了转移瘤的生长，使可见转移瘤的数量减少了18倍(P<0.001)，其疗效与原发瘤存在时对转移瘤的抑制效果相同甚至更强[4]。
4.1.1 重组的人血管抑素对Lewis肺癌低转移表型(LLC-LM)小鼠原发瘤和继发瘤的抑制 把编码人纤溶酶原kringle1～4的基因克隆进入pichia pastories，从中得到人纤溶酶原的前4个kringle区，此即重组的人血管抑素。它是由分子量分别为49×103u和51×103u的两条链构成的双联体。
在LLC-LM小鼠体内注射重组人血管抑素蛋白100mg/(kg.d)，连用3天，可明显抑制LLC-LM小鼠原发瘤的生长。
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在每只LLC-LM小鼠体内注射重组人血管抑素蛋白30μg/d[相当于1.5mg/(kg.d)]，可抑制肺转移瘤的生长，表现在肺表面转移瘤的数量和肺的总重量上。实验组LLC-LM小鼠切除原发瘤后，注射重组人血管抑素蛋白，测量肺重量(n＝4，260±24mg)，或注射天然人血管抑素蛋白，测量肺重量(n＝4，200±10mg)，两者与未切除原发瘤小鼠的肺重量(202±32mg)的差别无统计学意义(P>0.05)，而与对照组(切除原发瘤，只注射盐水)小鼠的肺重量(760±30mg)的差别有统计学意义(P<0.005)。同样，测量肺表面转移瘤的数量，重组血管抑素组(10±1)与只用盐水的对照组(77±15)的数量差别有统计学意义(P<0.005)[24]。
4.1.2 重组鼠血管抑素对Lewis肺癌小鼠原发瘤的抑制 把包括纤溶酶原一个信号肽的基因序列(编码蛋氨酸1-甘氨酸19)置于鼠血管抑素基因前，并将其导入杆状病毒属。然后从此杆状病毒感染的昆虫细胞培养介质中提纯出重组的鼠血管抑素。采用的方法是赖氨酸——琼脂糖凝胶的单步层析法。此重组的鼠血管抑素分子量为52×103u，表达血管抑素的全部生物学活性，且活性是血管抑素活性的10倍。在体外，鼠重组血管抑素对牛毛细血管内皮细胞增生的半量抑制剂量大约是50ng/ml，而人血管抑素的半量抑制量>500ng/ml。
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用雄性6～8周C57B16/J小鼠作为实验动物，把LLC-LM肿瘤细胞(1×106个细胞+0.1ml盐水)植入小鼠背侧中线远端皮下，4～6天内肿瘤生长至大约150mm3(约占小鼠体重的0.75%)。这时以1mg/(kg.d)剂量注射重组鼠血管抑素，对照组仅注射赋形剂，此时肿瘤抑制大约为80%。血管抑素剂量增加，疗效亦随之提高。当以6mg/(kg.d)给药时，肿瘤生长抑制达92%，而且无明显毒性和抗药性证据[4]。
4.1.3 鼠纤维肉瘤中血管抑素cDNA的表达抑制Lewis肺癌小鼠原发瘤的生长并使转移瘤处于长期休眠状态 把鼠血管抑素的cDNA密码转移到鼠T241纤维肉瘤细胞中，再把其中表达鼠血管抑素的稳定的克隆移植到C57B16/J小鼠体内，这时该克隆表达的重组鼠血管抑素的分子量为58×103u。此重组鼠血管抑素可抑制Lewis肺癌小鼠原发瘤和转移瘤的生长。它使原发瘤的生长抑制率平均达到77%，切除原发瘤后，70%小鼠的肺微小转移瘤仍停留在实验期间的无血管状态和显微镜下才见的休眠状态[25]。
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4.1.4 射线照射(IR)同时加用血管抑素对Lewis肺癌小鼠原发瘤的抑制 血管形成抑制因子尽管对缩小瘤体有效，但无肿瘤细胞毒作用，一旦停用，肿瘤可再次生长。克服此疗法缺陷的一个策略即是把血管形成抑制物治疗同细胞毒治疗结合起来。此研究选用IR方法加用血管抑素治疗。选用8周龄雄性C57BL/6系LLC小鼠。研究发现IR同时加用血管抑素可明显抑制原发瘤的生长，且两者有短暂的协同作用。两者对于杀伤肿瘤细胞无相互作用，而主要作用于肿瘤的微血管，即不是靶向肿瘤细胞，而是靶向肿瘤血管。同时还发现与IR同时应用的血管抑素的剂量大小和时间长短对肿瘤的抑制作用无显著性影响，该抑制作用与IR是否和血管抑素同时应用有关，如在IR后再使用血管抑素，则对肿瘤的缩小无作用[26]。
4.2 内皮抑素与肺癌的关系 O'Reilly等采用了大肠杆菌表达的内皮抑素，在移植Lewis肺癌的实验小鼠瘤体达200m3时用药，15天后与对照组相比，2.5mg/kg用药组对瘤体抑制率达50%，当剂量达10mg/kg和20mg/kg时，用药组瘤体完全被抑制，同时发现采用内皮抑素治疗的Lewis肺癌、T241纤维肉瘤及B16F10黑色素瘤的小鼠，其瘤体均明显缩小。停止用药，让肿瘤重新生长至小鼠重量的3%，再次治疗，这样分别经过6、4、2个周期后，肿瘤长久处于休眠状态，不再生长(140天仍不复发)。Lewis肺癌小鼠肺部非原发肿瘤部位未见转移灶[22，27，28]。
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4.2.1 肌肉注射内皮抑素基因对Lewis肺癌小鼠原发瘤和转移瘤的抑制 用PCR技术克隆出编码鼠胶原蛋白18C-末端184个位点的基因序列，同样可构建出人内皮抑素基因，然后将其置入质粒中。在体外，由人脐静脉内皮或LLC肿瘤细胞中检测出该重组质粒表达的内皮抑素分子量为22×103u。
实验采用两种不同的皮下肿瘤模型：鼠BALB/C肾细胞癌和鼠C58BL LLC。治疗开始前一周在鼠腹侧皮下分别种植两种癌细胞，几天后，给小鼠肌肉注射240μg精确表达内皮抑素的质粒或对照质粒，每周1次，共2周。注射对照质粒的小鼠肿瘤生长未受抑制，而注射精确表达内皮抑素质粒的两组实验小鼠的种植肿瘤生长都受到了明显抑制。且在治疗后13天时肿瘤生长的抑制达40%，具有统计学意义(P<0.05)。同时还发现对照组小鼠的每侧肺表面转移瘤平均>300个，而实验组小鼠肺表面转移瘤的数量较对照组减少了6倍，肺总重量减少了32%。对照组未显示出对肺转移瘤的明显抑制。以上资料表明在单纯肌肉注射精确表达内皮抑素的质粒后，鼠肌肉组织可产生内皮抑素蛋白，并分泌入循环系统，显示其生物活性。内皮抑素产生和分泌入血过程可持续2周。内皮抑素的表达水平和持久性足以抑制原发瘤和转移灶的生长。此外，内皮抑素的表达可使肿瘤血管形成减少并增加肿瘤细胞的凋亡。
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与重组内皮抑素治疗方法相比，此基因治疗方法有其明显优越性。重组内皮抑素在注射时浓度水平较高，但很快就开始下降，但注射重组质粒则可使分泌的内皮抑素保持稳定的水平。此外，大量反复注射重组内皮抑素可能产生耐受，而注射重组质粒不会诱发免疫反应。因此，此基因治疗方法为治疗癌症又提供了一个新途径[29]。
5 问题和展望
1998年期间，各种媒体大量报道了两种新的抗血管生成因子，血管抑素和内皮抑素。它们给全世界癌症患者带来了新的希望，并引起了医学科学工作者极大的兴趣。两种因子的发现和研究使我们对血管形成的调控机理有了进一步的认识，同时也为肿瘤的抗血管生成治疗开辟了新途径。但目前的研究主要是在动物肿瘤模型上，虽然美国FDA已批准Folkman开始这两种药物的人体实验，但尚未正式进入临床应用。有关它们在人体的有效治疗剂量，在体内是否会被某种不知晓的酶所降解而失活，长期治疗有何副作用，且是否会产生耐药性等尚不完全清楚。但不可否认的是，它们的发现毕竟为恶性肿瘤的治疗提供了一条可靠和充满希望的途径。将来，采用血管抑素、内皮抑素等细胞因子的抗血管生成疗法配合常规的外科手术、化疗、放疗和免疫疗法，必定会大大提高实体瘤的疗效。
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(收稿：2000-01-28，修回：2000-03-06), 百拇医药
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中国肺癌杂志000425 【中图分类号】 R73-3
为了解癌症发生和转移的机理，近一个世纪以来，人们进行了多方面的研究。早在1945年，Algire就提出了肿瘤血管形成的概念，实体肿瘤形成后即进入无血管的浸润前期，此时肿瘤结节很少能长到2～3mm3，细胞数亦在107以内。但一旦肿瘤出现血管形成，即迅速生长[1]。在70年代早期，Folkman又提出一种假说，即肿瘤生长和转移依赖于肿瘤血管形成，抑制其血管形成能够控制其生长和转移。但这一假说直到90年代才由许多实验研究所证实[2]。长时间以来，晚期恶性肿瘤患者的治疗主要依靠传统的化学药物治疗方法，并主要针对的是异常增殖的恶性细胞。但因其毒副作用大，易产生耐药性等缺点，化疗的疗效并不理想。因此，人们一直试图寻找抗肿瘤治疗的新途径和新方法，抗肿瘤血管生成就是近年来出现的倍受关注的一种肿瘤治疗新方法，并得到了较为广泛和深入的研究。目前已发现了多种血管生成抑制剂，如血小板因子-4(PF-4)、γ-干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、TSP-1、TNP-470、GM-1474、组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、可溶性FGF受体以及血管抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)等[3]。其中尤以1994年发现的血管抑素和1997年发现的内皮抑素更为引人注意。虽然两种因子的研究尚处于实验室阶段，但由于它们在抗肿瘤血管生成方面所表现出的显著效果，及其提供的治疗恶性肿瘤的新途径，现已成为全世界医药界和肿瘤界关注的焦点。本文拟就血管抑素和内皮抑素的研究进展及其与肺癌的关系作一介绍。
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1 血管抑素及内皮抑素的发现
在临床上和一些实验中，不断观察到一些原发肿瘤的切除可能导致远处转移瘤的加速生长。这种加速生长独立于特异性免疫反应而存在，被称为“伴发的肿瘤抵抗”。O'Reilly等研究发现某些肿瘤如Lewis肺癌，能够抑制其远处转移癌的生长，只有在原发肿瘤切除后，转移瘤才开始生长。这一发现使O'Reilly等提出一种新的假说，即原发性肿瘤分泌两种相拮抗的因子，分别抑制和刺激血管生成。原发瘤产生血管生成刺激因子超过血管生成抑制因子，因而能够在自身血管床上刺激血管生成。而在转移瘤或继发瘤中，经循环到达的血管抑制因子超过原发瘤和转移灶自身产生的血管生成刺激因子，从而在转移瘤或继发肿瘤的血管床上抑制血管生成，进而抑制其生长[4]。目前已发现了多种血管生成刺激因子，主要有血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维生成因子(bFGF)，血管生长素(angiogenin)，白介素-8(IL-8)，粒系-集落刺激因子(G-CSF)，转化生长因子(TGF)等。
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1.1 血管抑素的发现 1994年O'Reilly等发现移植了Lewis肺癌小鼠的血浆和尿液能够在体外特异性抑制血管内皮细胞的增生，而对照组动物则无此作用。他们从Lewis肺癌小鼠血浆中提纯出一个38×103u的纤溶酶原片段，经测序后命名为血管抑素。相应的人纤溶酶原的片段具有相似的作用。经全身给予血管抑素而不是完整的纤溶酶原，便能有效地抑制转移瘤的血管形成和生长[4]。
1.2 内皮抑素的发现 1997年O'Reilly和Folkman等发现体外培养的鼠血管内皮细胞瘤(EOMA)的细胞培养液能够抑制体外牛毛细血管内皮细胞增殖。他们从培养液中提纯出一种新的蛋白质，命名为内皮抑素。它与早先发现的38×103u的血管抑素不同，分子量仅为20×103u，序列分析显示其为胶原蛋白18(collagen XVIII)C末端片段。而人的内皮抑素分子量为18×103u。内皮抑素能抑制血管内皮细胞生长，进而抑制新生血管生长，以及肿瘤生长和转移[5]。
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2 血管抑素和内皮抑素的结构与来源
2.1 血管抑素的结构和来源 血管抑素的分子量为38×103u，它属于内生性蛋白质，为纤溶酶原的裂解片断，能特异性抑制血管内皮细胞的生长。纤溶酶原是一种单链糖蛋白，分子量为92×103u，含有791个氨基酸。特异性裂解Arg561-Val562肽键位点，可产生双链纤溶酶分子(分子量分别为65×103u、25×103u)，两条链由两条二硫键连接。位于25×103u链上的COOH-末端蛋白酶结构域上的活性位点包括His603、Asp646和Ser741，而NH2-末端结构域包括5个kringle 结构(即含有3对二硫键的区域)，血管抑素则来源于这5个kringle区的前4个。这4个kringle区有很高的同源性，共有两处糖基化位点。其中位于kringle 1～3区的赖氨酸结合位点，在纤维溶解调控中起关键作用[6]。Kringle 1、2、3区有抗血管内皮细胞增生功能，kringle 4区无此功能[7]。经氨基酸序列分析，血管抑素N-末端起始于纤溶酶原的第98位氨基酸(缬氨酸)，C-末端终止于第440位氨基酸，共有342个氨基酸，而重组鼠血管抑素的氨基酸序列是天门冬氨酸20……丝氨酸32—丝氨酸—精氨酸97—缬氨酸98……甘氨酸458。
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血管抑素和纤溶酶原内部一个片段的同源性超过98%。使用抗纤溶酶原kringle1、2、3区的抗体，可使血管抑素的作用丧失。用金属弹性蛋白酶(MME)酶解人纤溶酶原产生的裂解片段可在体外抑制牛血管内皮细胞的增殖，而完整的纤溶酶原则无此作用，这些证据都说明了血管抑素是纤溶酶原的裂解片段[1～4]。
2.2 内皮抑素的结构和来源 内皮抑素的分子量为20×103 u，序列分析证实为胶原蛋白18C-末端片断。内皮抑素位于其C-端的315个氨基酸组成的非胶原蛋白特征结构域中，这一结构域内有4个保守的半胱氨酸。
胶原蛋白18在体内分布很广，存在于胚胎和成年鼠各种组织的基底膜上。它与很多含血管的基底膜和一些不含血管的基底膜相联系。内皮抑素共有184个氨基酸，其中酸性氨基酸6个，碱性氨基酸29个，疏水性氨基酸占42%，共有4个半胱氨酸。Ludger等从人的循环系统中提取出的人内皮抑素与鼠内皮抑素有86%的序列完全相同，都包含了4个保守的半胱氨酸，说明它们的结构可能非常相似。
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Standker等分离出人内皮抑素在血循环中的形式，即在其N-末端缺少了12个氨基酸的序列[8]。它不表现对内皮细胞的抑制作用，故很可能是内皮抑素代谢的副产物[9]。Boehm和O'Reilly等最近发现，锌是内皮抑素的组成成分。内皮抑素从前体激活到发挥抗血管生成作用都有赖于锌的存在。内皮抑素以1：1的容积克分子比与锌(Zn)结合。内皮抑素的锌的配基共有4个，分别位于N-末端1、3、11位组氨酸和76位天冬氨酸上，而且前两位组氨酸对于锌的结合是必须的。如果锌的配体发生突变使锌不能结合于内皮抑素或用EDTA去除Zn2+，则严重影响内皮抑素的生物学活性。内皮抑素结合锌的能力主要作用于两个方面：一是锌的结合保护了内皮抑素的N-末端不被蛋白酶分解，从而防止其失活；二是锌结合后内皮抑素的结构对于其和假定的内皮细胞受体的相互作用是至关重要的[10，11]。
3 血管抑素和内皮抑素的产生机制、作用机制和生物学功能
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3.1 血管抑素的产生机制、作用机制和生物学功能
3.1.1 血管抑素的产生机制 肿瘤细胞中测不到表达纤溶酶原的mRNA或血管抑素蛋白，说明肿瘤细胞不能直接产生血管抑素。在体外，血管抑素的产生有两种途径，一种途径是由弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶家族(MMP-3，MMP-7，MMP-9，MMP-12)对人纤溶酶原的限制性酶酶解作用产生[6，12，13]，另一种途径是由人前列腺癌细胞系(PC-3，DU-145，LN-Cap)产生的丝氨酸蛋白酶的酶解作用[12]。而在体内，其产生机制尚不十分清楚，研究表明主要有三种途径。一是最近研究发现的在Lewis肺癌小鼠中，血管抑素的产生与肿瘤内浸润巨噬细胞中MME的功能上调有关。肿瘤细胞产生的粒细胞、巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)使肿瘤内浸润巨噬细胞中MME功能上调(诱导肿瘤内浸润巨噬细胞中MME基因的表达)，而MME又在体内裂解纤溶酶原产生血管抑素[3，14]。二是直接酶解途径，即某些肿瘤如PC-3前列腺癌分泌尿激酶(uPA)和硫巯基供体酶(FSDs)，直接裂解纤溶酶原产生血管抑素[7]。三是肿瘤细胞本身产生的MMP增加，使正常存在于血循环中的纤维酶原裂解生成血管抑素，以对抗其自身产生的促血管生成因子，如VEGF、bFGF等，以达到平衡[6]。
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3.1.2 血管抑素的作用机制 血管抑素对毛细血管内皮细胞生长的抑制作用可能通过位于内皮细胞膜上的受体介导。1999年，Moser等发现血管抑素可与内皮细胞表面ATP合成酶的α/β亚单位结合，从而产生抗血管生成作用及下调内皮细胞的增生和移行作用。阻断它们的结合可极大削弱血管抑素的抗肿瘤生长效益[15]。此外，血管抑素可能阻断整合素等粘附分子介导的增殖信号，从而阻断了VEGF、bFGF的信号通路。血管抑素还可显著抑制内皮细胞的移行和血管化，虽然对生长因子的信号传导无影响，但可激活局灶性粘附激酶，使内皮细胞粘附团块不能形成[16]。
1998年Luo等[17]用重组的血管抑素处理牛内皮细胞，检查E-选择素的表达和功能，结果发现E-选择素在增殖期内皮细胞中增加了4～5倍，而在静止期内皮细胞中则变化很小。同时还发现，E-选择素阳性的细胞多处于细胞周期中的G2和M期。但进一步研究却证实血管抑素虽然选择性增高E-选择素在增殖期细胞中的表达，但对于内皮细胞的G0/G1、S和G2/M的细胞周期分布却无明显影响。这项研究证实了血管抑素可影响增殖期内皮细胞的基因表达，同时提出了血管抑素在体内抑制肿瘤生长，而对静止期内皮细胞却无明显影响的可能机制[17]。
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3.1.3 血管抑素的生物学功能 血管抑素在体外可强烈抑制牛血管内皮细胞的增殖，在体内则可抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖，从而抑制肿瘤及转移瘤的生长。最近发现在抑制毛细血管内皮细胞增生方面，kringle 5的作用甚至比血管抑素更强。有人巳开始研究用纤维酶介导蛋白裂解产生的kringle 1～5来抑制血管生成和肿瘤生长[18]。
3.2 内皮抑素的产生机制、作用机制和生物学功能
3.2.1 内皮抑素的产生机制和作用机制 内皮抑素产生和调控的机制尚不清楚，究竟是何种蛋白酶酶解胶原蛋白18产生内皮抑素有待进一步研究。内皮抑素介导的肿瘤生长抑制作用的机制亦不完全清楚，可能是通过大大提高肿瘤细胞程序化死亡的速率来抑制肿瘤的生长。现有研究表明，其可能的机制有：①内皮抑素可阻碍增生内皮细胞与基质蛋白的相互作用，从而诱导内皮细胞凋亡。同时还可减少Bcl-2、Bcl-X1抗凋亡蛋白的量[19，20]。②引起内皮细胞G1期停滞，从而抑制内皮细胞增殖[21]。③与VEGF和bFGF等血管生成刺激因子竞争性结合生长因子信号传导系统中的硫酸肝素蛋白聚糖受体，从而抑制血管生成[20]。
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3.2.2 内皮抑素的生物学功能 内皮抑素对体外内皮细胞具有明显的增殖抑制活性，在体内亦可特异性抑制内皮细胞增生和新生血管生成，从而抑制肿瘤的生长。其抑制血管形成的作用大约是血管抑素的30倍。
4 血管抑素和内皮抑素与肺癌的关系
在治疗癌症过程中，获得性抗药性是一个很重要的问题，它在所有肿瘤患者中的比例高达30%。在美国，每年都有超过50万人死于癌症，其中很多死于对化疗药物的耐药。获得性耐药性的产生在部分程度上是基于肿瘤细胞基因组的不稳定性和高突变率。相比之下，内皮细胞遗传稳定，突变率低，所以从理论说针对肿瘤内皮细胞的抗血管生成因子不会或只会引起很弱的抗药性。各型肺癌对化疗药物都会产生一定程度的耐药性，其中尤以小细胞肺癌为著。所以，血管抑素和内皮抑素的研究对肺癌的治疗亦有重要指导意义[22]。在实验中，长期直接应用血管抑素或内皮抑素蛋白会带来一系列药理学和理论上的困难，且对局部侵袭性肿瘤的疗效不理想。研究发现，使用逆转录病毒和腺病毒载体转导血管抑素cDNA，可在体外抑制内皮细胞的生长，在体内抑制血管生长。这项研究提供了一个有效的治疗恶性肿瘤的新方法[23]。
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4.1 血管抑素与肺癌的关系 1994年，O'Reilly等用纯化的人血管抑素腹膜内注射入Lewis肺癌(LLC)小鼠体内。第1天用24μg/20g小鼠，接下来用12μg/d，连用13天。观察到此疗法显著抑制了转移瘤的生长，使可见转移瘤的数量减少了18倍(P<0.001)，其疗效与原发瘤存在时对转移瘤的抑制效果相同甚至更强[4]。
4.1.1 重组的人血管抑素对Lewis肺癌低转移表型(LLC-LM)小鼠原发瘤和继发瘤的抑制 把编码人纤溶酶原kringle1～4的基因克隆进入pichia pastories，从中得到人纤溶酶原的前4个kringle区，此即重组的人血管抑素。它是由分子量分别为49×103u和51×103u的两条链构成的双联体。
在LLC-LM小鼠体内注射重组人血管抑素蛋白100mg/(kg.d)，连用3天，可明显抑制LLC-LM小鼠原发瘤的生长。
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在每只LLC-LM小鼠体内注射重组人血管抑素蛋白30μg/d[相当于1.5mg/(kg.d)]，可抑制肺转移瘤的生长，表现在肺表面转移瘤的数量和肺的总重量上。实验组LLC-LM小鼠切除原发瘤后，注射重组人血管抑素蛋白，测量肺重量(n＝4，260±24mg)，或注射天然人血管抑素蛋白，测量肺重量(n＝4，200±10mg)，两者与未切除原发瘤小鼠的肺重量(202±32mg)的差别无统计学意义(P>0.05)，而与对照组(切除原发瘤，只注射盐水)小鼠的肺重量(760±30mg)的差别有统计学意义(P<0.005)。同样，测量肺表面转移瘤的数量，重组血管抑素组(10±1)与只用盐水的对照组(77±15)的数量差别有统计学意义(P<0.005)[24]。
4.1.2 重组鼠血管抑素对Lewis肺癌小鼠原发瘤的抑制 把包括纤溶酶原一个信号肽的基因序列(编码蛋氨酸1-甘氨酸19)置于鼠血管抑素基因前，并将其导入杆状病毒属。然后从此杆状病毒感染的昆虫细胞培养介质中提纯出重组的鼠血管抑素。采用的方法是赖氨酸——琼脂糖凝胶的单步层析法。此重组的鼠血管抑素分子量为52×103u，表达血管抑素的全部生物学活性，且活性是血管抑素活性的10倍。在体外，鼠重组血管抑素对牛毛细血管内皮细胞增生的半量抑制剂量大约是50ng/ml，而人血管抑素的半量抑制量>500ng/ml。
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用雄性6～8周C57B16/J小鼠作为实验动物，把LLC-LM肿瘤细胞(1×106个细胞+0.1ml盐水)植入小鼠背侧中线远端皮下，4～6天内肿瘤生长至大约150mm3(约占小鼠体重的0.75%)。这时以1mg/(kg.d)剂量注射重组鼠血管抑素，对照组仅注射赋形剂，此时肿瘤抑制大约为80%。血管抑素剂量增加，疗效亦随之提高。当以6mg/(kg.d)给药时，肿瘤生长抑制达92%，而且无明显毒性和抗药性证据[4]。
4.1.3 鼠纤维肉瘤中血管抑素cDNA的表达抑制Lewis肺癌小鼠原发瘤的生长并使转移瘤处于长期休眠状态 把鼠血管抑素的cDNA密码转移到鼠T241纤维肉瘤细胞中，再把其中表达鼠血管抑素的稳定的克隆移植到C57B16/J小鼠体内，这时该克隆表达的重组鼠血管抑素的分子量为58×103u。此重组鼠血管抑素可抑制Lewis肺癌小鼠原发瘤和转移瘤的生长。它使原发瘤的生长抑制率平均达到77%，切除原发瘤后，70%小鼠的肺微小转移瘤仍停留在实验期间的无血管状态和显微镜下才见的休眠状态[25]。
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4.1.4 射线照射(IR)同时加用血管抑素对Lewis肺癌小鼠原发瘤的抑制 血管形成抑制因子尽管对缩小瘤体有效，但无肿瘤细胞毒作用，一旦停用，肿瘤可再次生长。克服此疗法缺陷的一个策略即是把血管形成抑制物治疗同细胞毒治疗结合起来。此研究选用IR方法加用血管抑素治疗。选用8周龄雄性C57BL/6系LLC小鼠。研究发现IR同时加用血管抑素可明显抑制原发瘤的生长，且两者有短暂的协同作用。两者对于杀伤肿瘤细胞无相互作用，而主要作用于肿瘤的微血管，即不是靶向肿瘤细胞，而是靶向肿瘤血管。同时还发现与IR同时应用的血管抑素的剂量大小和时间长短对肿瘤的抑制作用无显著性影响，该抑制作用与IR是否和血管抑素同时应用有关，如在IR后再使用血管抑素，则对肿瘤的缩小无作用[26]。
4.2 内皮抑素与肺癌的关系 O'Reilly等采用了大肠杆菌表达的内皮抑素，在移植Lewis肺癌的实验小鼠瘤体达200m3时用药，15天后与对照组相比，2.5mg/kg用药组对瘤体抑制率达50%，当剂量达10mg/kg和20mg/kg时，用药组瘤体完全被抑制，同时发现采用内皮抑素治疗的Lewis肺癌、T241纤维肉瘤及B16F10黑色素瘤的小鼠，其瘤体均明显缩小。停止用药，让肿瘤重新生长至小鼠重量的3%，再次治疗，这样分别经过6、4、2个周期后，肿瘤长久处于休眠状态，不再生长(140天仍不复发)。Lewis肺癌小鼠肺部非原发肿瘤部位未见转移灶[22，27，28]。
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4.2.1 肌肉注射内皮抑素基因对Lewis肺癌小鼠原发瘤和转移瘤的抑制 用PCR技术克隆出编码鼠胶原蛋白18C-末端184个位点的基因序列，同样可构建出人内皮抑素基因，然后将其置入质粒中。在体外，由人脐静脉内皮或LLC肿瘤细胞中检测出该重组质粒表达的内皮抑素分子量为22×103u。
实验采用两种不同的皮下肿瘤模型：鼠BALB/C肾细胞癌和鼠C58BL LLC。治疗开始前一周在鼠腹侧皮下分别种植两种癌细胞，几天后，给小鼠肌肉注射240μg精确表达内皮抑素的质粒或对照质粒，每周1次，共2周。注射对照质粒的小鼠肿瘤生长未受抑制，而注射精确表达内皮抑素质粒的两组实验小鼠的种植肿瘤生长都受到了明显抑制。且在治疗后13天时肿瘤生长的抑制达40%，具有统计学意义(P<0.05)。同时还发现对照组小鼠的每侧肺表面转移瘤平均>300个，而实验组小鼠肺表面转移瘤的数量较对照组减少了6倍，肺总重量减少了32%。对照组未显示出对肺转移瘤的明显抑制。以上资料表明在单纯肌肉注射精确表达内皮抑素的质粒后，鼠肌肉组织可产生内皮抑素蛋白，并分泌入循环系统，显示其生物活性。内皮抑素产生和分泌入血过程可持续2周。内皮抑素的表达水平和持久性足以抑制原发瘤和转移灶的生长。此外，内皮抑素的表达可使肿瘤血管形成减少并增加肿瘤细胞的凋亡。
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与重组内皮抑素治疗方法相比，此基因治疗方法有其明显优越性。重组内皮抑素在注射时浓度水平较高，但很快就开始下降，但注射重组质粒则可使分泌的内皮抑素保持稳定的水平。此外，大量反复注射重组内皮抑素可能产生耐受，而注射重组质粒不会诱发免疫反应。因此，此基因治疗方法为治疗癌症又提供了一个新途径[29]。
5 问题和展望
1998年期间，各种媒体大量报道了两种新的抗血管生成因子，血管抑素和内皮抑素。它们给全世界癌症患者带来了新的希望，并引起了医学科学工作者极大的兴趣。两种因子的发现和研究使我们对血管形成的调控机理有了进一步的认识，同时也为肿瘤的抗血管生成治疗开辟了新途径。但目前的研究主要是在动物肿瘤模型上，虽然美国FDA已批准Folkman开始这两种药物的人体实验，但尚未正式进入临床应用。有关它们在人体的有效治疗剂量，在体内是否会被某种不知晓的酶所降解而失活，长期治疗有何副作用，且是否会产生耐药性等尚不完全清楚。但不可否认的是，它们的发现毕竟为恶性肿瘤的治疗提供了一条可靠和充满希望的途径。将来，采用血管抑素、内皮抑素等细胞因子的抗血管生成疗法配合常规的外科手术、化疗、放疗和免疫疗法，必定会大大提高实体瘤的疗效。
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