EBV感染、p53、Bcl-2、C-myc基因表达与肺癌关系研究
作者：夏和顺 吴建平 陈春梅 毛永荣 朱剑 常青 糜克永 赵军理 张明和
单位：夏和顺 吴建平 陈春梅 毛永荣 朱剑 常青(430079 武汉，湖北省肿瘤医院病理科)；糜克永 赵军理(中国科学院武汉病毒所)；张明和(湖北省肿瘤研究所)
关键词：肺肿瘤；EB病毒；EBV DNA；病因；癌基因
中国肺癌杂志000407
【摘要】 目的 研究肺癌组织中EBV感染率以及p53、Bcl-2和C-myc基因的表达，分析EBV和p53、Bcl-2、C-myc基因表达的关系。方法 检测48例手术切除肺癌标本，18例癌旁支气管粘膜组织，2例肺转移平滑肌肉瘤，1例结核瘤，14例正常肺组织中EBV DNA及p53、Bcl-2、C-myc基因表达。用PCR法检测新鲜组织的EBV DNA，间接原位PCR法观察EBV阳性信号在细胞中的反应部位，免疫组化(SABC)法检测p53、Bcl-2、C-myc在肺癌中的表达。结果 25例(52.08%)肺癌标本呈EBV DNA阳性，其中鳞癌的阳性率(75%)最高。EBV DNA阳性和肺癌组织学分型有关(P<0.01)。癌旁支气管粘膜组织和肺组织EBV DNA阳性率分别为61.11%和28.57%(P<0.01)。免疫组化分析表明p53、Bcl-2和C-myc在肺癌组织中表达率分别为54.17%、37.5%和75%，其中p53和Bcl-2表达与组织学分型有关(P<0.05)。肺癌组织中EBV DNA阳性者的p53、Bcl-2、C-myc表达阳性率较阴性者明显增高(P<0.05)。结论 肺癌中有较高的EBV感染率。EBV感染可能在肺癌的发生中起重要作用，这种作用可能是通过激活某些癌基因实现的。
, 百拇医药
【中图分类号】 R734.202；R734.204
The relationship between Epstein-Barr-virus infection and expression of p53, Bcl-2 and C-myc gene in lung cancer
XIA Heshun WU Jianping CHEN Chunmei MAO Yongrong ZHU Jian CHANG Qing MI Keyong, ZHAO Junli ZHANG Minghe
(Pathology Department of Hubei Cancer Hospital, Wuhan, Hubei 430079, P.R.China)
【Abstract】 Objective To investigate the infection rate of EBV and the expression of p53, Bcl-2 and C-myc gene in lung cancer, to explore the relation between EBV and oncogenesis of lung cancer, and the relation between EBV and expression of p53, Bcl-2 and C-myc. Methods Forty-eight cases of excised specimen of lung cancer, 2 of lung metastatic leiomyosarcoma, 1 of tuberculoma, 18 of paraneoplastic bronchial mucosa tissue, and 14 of normal lung tissue were analyzed. EBV DNA of the fresh tissue was detected with PCR, and indirect in situ PCR was used to observe the reaction site of EBV DNA, and immunohistochemistry (SABC) was used to detect the expression of p53, Bcl-2, and C-myc gene. Results Twenty-five cases of the 48 lung cancer had positive staining of EBV DNA and 75% of squamous cell carcinoma showed positive staining of EBV DNA. The positive staining of EBV DNA was closely related to histological classfication of lung cancer (P<0.01). The positive rate of EBV DNA in paraneoplastic bronchial mucosa tissues and normal pulmonary tissues was 61.11%(11/18) and 28.5%(4/14) respectively (P<0.01). The positive rate of p53, Bcl-2 and C-myc expression in lung cancer tissues was 54.17%, 37.5% and 75% respectively. The expression of p53 and Bcl-2 was closely related to histological classification (P<0.05). The positive rate of p53, Bcl-2 and C-myc expression in patients with positive EBV DNA was significantly higher than that in patients with negative EBV DNA (P<0.05). Conclusion Lung cancer has high EBV infection. EBV infection may play an important role in the oncogenesis of lung cancer, which might bring about through activating some oncogenes.
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【Key words】 Lung neoplasms EBV EBV DNA Pathogenesis Oncogene
爱波司坦-巴尔病毒(EBV)是一种癌基因DNA病毒，研究认为它与某些肿瘤发生有关[1，2]，在肺癌中它主要和肺淋巴上皮样癌有关[3，4]。肺癌的发生、演变及恶性程度与某些癌基因激活、抑癌基因的丢失导致凋亡缺陷和受阻有密切关系，这些基因中研究较多且具重要作用的有p53、Bcl-2和C-myc等基因。本研究用分子生物学的方法对48例肺癌患者癌组织及其相关组织中EBV感染及p53、Bcl-2及C-myc基因表达及它们在肺癌发生中的作用进行了探讨。
1 材料和方法
1.1 组织标本 收集48例肺癌患者的癌组织，同时收集18例癌旁支气管粘膜组织及14例癌旁肺组织。患者中男性31例，女性17例，年龄34～63岁，平均47岁。其中鳞癌20例，腺癌22例(包括3例细支气管肺泡癌)，非典型性类癌3例，小细胞肺癌2例，大细胞肺癌1例。原发瘤直径<3cm者4例，>3cm者44例。Ⅰ期26例，Ⅱ期18例，Ⅲ期4例。另选2例肺转移性平滑肌肉瘤，1例肺结核瘤及其支气管粘膜组织作为对照组织。
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1.2 EBV DNA的普通PCR检测 取新鲜组织裂解后，常规酚/氯仿提取DNA。EBV DNA引物参照文献5的序列设计，两对引物分别为：
①gp220(BamHI L region) 5′-GGCTGGTGTCACCGGTGTTA-3′，5′-CCTTAGGAGGAACAAGTCCC-3′，扩增片段长度239bp；
②EBNA1(BamHI W Region) 5′-GTCATCATCATCCGGGTCTC-3′，5′-TTCGGGTTGGAACCTCCTTG-3′，扩增片段长度269bp。
30μlPCR反应液中，含1× PCR buffer，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs，1U Taq DNA聚合酶，上、下游引物各0.5μmol/L，模板5μl，上覆30μl无菌矿物油。扩增程序为94℃预变性5分钟，94℃60秒，55℃60秒，72℃60秒，共35个循环，最后72℃延伸3分钟。反应结束后取5μl PCR反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，透射紫外仪上观察结果，在Marker的237bp及269bp附近处有DNA条带者为阳性。阳性对照为B95-8转化细胞。
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1.3 间接原位PCR检测 用间接原位PCR法对普通PCR法检测出的12例EBV阳性和2例阴性肺癌病例的石蜡切片进行检测，分析EBV DNA在癌组织中的反应部位。将原位载玻片在0.1NHCl中浸泡过夜，蒸馏水清洗，晾干，用1%APES-丙酮溶液处理30秒，丙酮中5分钟，晾干。组织切片厚4μm，经预处理后，进行PCR原位扩增。100μl原位PCR反应液中，含1×PCR buffer，1.5mmol/L MgCl2，300μmol/L dNTPs，10U Taq DNA聚合酶，上、下游引物各1μmol/L。每张切片加80～100μl反应液，使组织切片被完全覆盖。扩增程序同普通PCR，经20个循环，最后72℃延伸10分钟。将1.2中常规PCR扩增的特异性EBV DNA片段用长臂光敏生物素标记成探针，杂交探针浓度为1μg/ml，AV-VP亲合，NBT和BCIP显色，核固红套染。胞核中出现黄棕色到兰黑色颗粒者为阳性。
1.4 免疫组织化学方法分析 免疫组织化学方法使用SABC法。p53阳性着色为胞核呈棕黄色，Bcl-2阳性为胞浆呈棕黄色，C-myc阳性为细胞核或胞浆染色呈棕黄色。
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1.5 统计学处理 统计方法采用χ2检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 EBV DNA普通PCR检测结果 48例肺癌组织中，有25例(52.08%)EBV DNA阳性(图1、2)，其中鳞癌的阳性率为75% (15/20)，腺癌为36.36%(8/22)，非典型性类癌为33.33%(1/3)，大细胞肺癌为100%(1/1)，小细胞肺癌为0(0/2)。EBV DNA阳性率在鳞癌中较高，与其它组织类型之间(大细胞肺癌除外)的差异有显著性(χ2＝6.31，P<0.06)。EBV DNA阳性者中临床分期属Ⅰ期者有18例(18/26，69.23%)，Ⅱ期者6例(6/18，33.33%)，Ⅲ期者1例(1/4，25%)，不同期别间阳性率差异有显著性(P<0.05)。
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图1 EBV P1P2 DNA引物(BamHI L region)扩增产物电泳图
1：PCR marker；2：阳性对照；3：阴性对照；4、5、8：阳性；6、7：阴性。
Fig 1 The electrophoresis photograph of amplification product of EBV DNA P1P2 polymer(BamHI L region)
1: PCR marker; 2: positive control; 3: negative control; 4,5 and 8: EBV DNA positive; 6 and 7: EBV DNA negative.
图2 EBV P3P4 DNA引物(BamHI W region)扩增产物电泳图
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1：PCR marker；2：阳性对照；3：阴性对照；4、7、8：阳性；5、6：阴性。
Fig 2 The electrophoresis photograph of amplification product of EBV DNA P3P4 polymer(BamHI W region)
1: PCR marker; 2: positive control; 3: negative control; 4,7 and 8: EBV DNA positive; 5 and 6: EBV DNA negative.
18例癌旁支气管粘膜组织中，11例(61.11%)EBV DNA阳性，14例癌旁肺组织中，4例(28.57%)EBV DNA阳性，两者之间阳性率差异有显著性(P<0.01)。
2例肺转移性平滑肌肉瘤和1例肺结核瘤中均未发现EBV DNA扩增，但它们的支气管粘膜组织中EBV DNA呈阳性反应。
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2.2 间接原位PCR法结果 12例EBV DNA PCR阳性病例中10例间接原位PCR呈阳性，阳性信号强弱不等，从棕黄色到兰黑色，定位于胞核中，有靠核边倾向。2例阴性病例未发现阳性信号。
2.3 免疫组织化学分析结果 p53、Bcl-2和C-myc免疫组织化学染色法检测结果见表1。 48例肺癌标本中，26例(54.17%)p53阳性, 18例(37.5%)Bcl-2阳性，36例(75%)C-myc阳性(图3、4)。p53和Bcl-2基因表达在组织学分型间差异有显著性(P<0.01)。p53、Bcl-2、C-myc基因在患者性别、肿瘤大小、临床分期、淋巴结有无转移间差异没有显著性。
表1 不同组织中p53、Bcl-2和C-myc免疫组化法分析结果
Tab 1 Comparison of p53, Bcl-2 and C-myc
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expression in different lung tissues Lung tissue
N
No. of cases
p53
positive(%)
Bcl-2
positive(%)
C-myc
positive(%)
Lung cancer
48
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26(54.16)
18(37.50)
36(75)
Squamous epithelial
cancer
20
14(70)
4(20)
18(90)
Adenocarcinoma
22
10(45.45)
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11(50)
16(72.73)
Atypical carcinoid
3
1(33.33)
1(33.33)
2(66.67)
Large cell lung cancer
1
1(100)
0
0
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Small cell lung cancer
2
0
2(100.00)
0
Bronchial mucosa
21
0
2(100.00)
0
Pulmonary tissue
14
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0
2(14.28)
2(14.28)
Metastatic leiomyosarcoma
2
1(50.00)
0
0
Tuberculosis
1
0
0
, 百拇医药 0
图3 细支气管肺泡细胞癌，胞浆内Bcl-2阳性 ×400 SABC法
Fig 3 Alveolar-bronchial carcinoma with positive Bcl-2 protein immunohistochemical staining in cytoplasma ×200 SABC
图4 低分化腺癌，胞核和胞浆内C-myc阳性 ×400 SABC法
Fig 4 Low differentiated squamous cell carcinoma with positive C-myc protein immunmohistochemical staining in nucleus and cytoplasma ×400 SABC
, 百拇医药
癌旁支气管粘膜组织、肺组织，以及肿瘤间质和肺结核瘤中p53均呈阴性,仅1例(50%)肺转移性平滑肌肉瘤p53呈阳性；9例癌旁支气管粘膜组织基底细胞呈Bcl-2阳性，间质中淋巴组织Bcl-2呈阳性反应，但生发中心中淋巴母细胞呈阴性反应(图5)；C-myc在支气管粘膜及肺组织中部分呈阳性反应。
图5 肺内淋巴组织Bcl-2染色反应，淋巴小结亮区呈阴性反应，暗区呈阳性反应 ×200 SABC法
Fig 5 Bcl-2 protein immunohistochemical staining results in pulmonary lymphatic tissue. The light region of lymphonodule showed negative and dark zone showed positive ×200 SABC
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2.4 EBV DNA阳性和p53、Bcl-2、C-myc表达的关系 在25例EBV DNA阳性的病例中，18例(72%)为p53阳性，13例(52%)为Bcl-2阳性，23例(92%)为C-myc阳性。在EBV DNA阴性病例中p53、Bcl-2和C-myc基因的表达分别为34.78%、21.73%和69.56%，明显低于EBV DNA阳性者中的表达率。
3 讨论
EBV是一种癌基因病毒，与许多肿瘤发生有关[1～4]。EBV DNA有9个基因能编码EBV核抗原(EBNA)和3个潜在膜蛋白，其中EBNA1是EBV相关恶性肿瘤中唯一始终表达的蛋白质，具有和DNA结合能力，而且还有较强的RNA结合能力，它在所有含病毒基因组的细胞中均可被检出，EBV DNA在低分化鼻咽癌中出现的概率几乎是100%[1]。我们结合文献设计两对EBV DNA引物,用PCR方法来检测48例原发性肺癌组织标本中EBV DNA。结果发现25例EBV DNA阳性，间接原位PCR反应证实EBV DNA阳性信号位于胞核中。其中鳞癌的阳性率最高，较多癌旁支气管粘膜组织和部分癌旁肺组织中发现EBV DNA阳性，2例肺转移性平滑肌肉瘤和1例肺结核瘤中EBV DNA阴性，但其支气管粘膜组织中EBV DNA也呈阳性反应。这些结果说明EBV在肺癌组织中有很高的感染率，EBV有可能在肺癌发生中发挥重要作用。
, 百拇医药
p53在肺癌中的表达率为43%～75%[6，7]，p53免疫组织化学研究表明本组有54.16%p53呈阳性反应，反应为胞核型。其中鳞癌的阳性率显著高于腺癌，EBV DNA阳性者中p53表达较阴性者明显升高。
Henderson等[8]和Finke等[9]证明Bcl-2过度表达是由Lmp-1介导所致，在淋巴系统EBV DNA阳性肿瘤中已被证明有Bcl-2过度表达。Chen等[4]发现EBER-1阳性的“肺淋巴上皮样癌”中全部表达Bcl-2，与其它组织学类型间有显著性差异。Bcl-2在正常支气管粘膜上皮基底层细胞选择性地阳性，似乎表明Bcl-2可以延长基底细胞生命期[10]，从而导致另外的危险因素发生，如EBV感染。本组结果发现EBV DNA阳性和EBV DNA阴性患者中Bcl-2表达差异有显著性，提示EBV感染和Bcl-2高表达有一定的联系。
, 百拇医药 原癌基因C-myc在细胞的生长和凋亡过程中均发挥作用。在永生化B淋巴细胞中，C-myc基因表达异常，目前仍未发现有肺癌中EBV和C-myc基因关系的研究报道。本组48例患者中36例免疫组织化学C-myc呈阳性反应,反应以胞核为主，部分细胞胞浆也呈阳性反应。EBV DNA阳性病例中C-myc表达率显著高于阴性病例，提示EBV与C-myc之间可能有关。
在恶性肿瘤癌基因的研究中，不少学者提出了多基因协同作用的假设，认为在肿瘤的发生、发展的各阶段，至少有二个或二个以上的功能不同的异常激活的癌基因各自发挥不同的作用，并在时间和空间上相互配合、协同加强了细胞的癌变。在决定细胞是增生还是凋亡，需要p53、Bcl-2和C-myc三者的存在，更重要的是三者出现在时间和量上的精确调节。本研究结果说明p53、C-myc、Bcl-2三个癌基因均在肺癌的发生中起了一定的作用。此外，EBV DNA阳性者和阴性者中p 53、Bcl-2、C-myc的表达差异有显著性，但由于本组病例数较少，EBV感染与p53、Bcl-2、C-myc是否存在相关关系还需进一步探讨。
, 百拇医药
参 考 文 献
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3，Kasai K, Sato Y, Kameya T, et al.Incidence of latent infection of Epstein-Barr virus in lung cancer --an analysis of EBER, expression in lung cancers by in situ hybridization. J Pathol,1994,174(3)∶257-265.
, 百拇医药
4，Chen FF, Yan JJ, Lai WW, et al. Epstein-Barr virus-associated non-small cell lung carcinoma. Undifferentiated“lymphoepithelioma-like "carcinoma as a distinct entity with better prognosis. Cancer,1998,82(12)∶2334-2342.
5，Telenti A, Marshall WF, Smith TF. Detection of Epstein-Barr virus by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol,1990,28(10)∶2187-2192.
6，Kishmoto Y, Murakami Y, Shirashi M, et al. Aberrations of the p53 tumor suppressor gene in human non-small cell lung carcinomas of the lung. Cancer Res,1992,52(17)∶4799-4804.
, 百拇医药
7，高振强，高志萍，张晓彬.肺癌中p53基因突变类型和可能致癌因素.中华预防医学杂志,1997，31(2)∶88-91.
8，Henderson S, Rowe M, Giegory C, et al. Induction of Bcl-2 expression by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 proteins infected B-cells from programmed cell death. Cell,1991,65(7)∶1107-1115.
9，Finke J, Fritzen R, Terns P, et al. Expression of Bcl-2 in Burkitt'lymphoma cell lines: Induction by latent Epstein-Barr virus genes. Blood,1992,80(2)∶459-469.
10，Walker C, Roberson L, Myokow M, et al. Expression of the Bcl-2 protein in normal and dysplastic bronchial epithelium and in lung carcinomas. Br J Cancer,1995,72(1)∶164-169.
(收稿：1999-11-17 修回：2000-02-19), 百拇医药
单位：夏和顺 吴建平 陈春梅 毛永荣 朱剑 常青(430079 武汉，湖北省肿瘤医院病理科)；糜克永 赵军理(中国科学院武汉病毒所)；张明和(湖北省肿瘤研究所)
关键词：肺肿瘤；EB病毒；EBV DNA；病因；癌基因
中国肺癌杂志000407
【摘要】 目的 研究肺癌组织中EBV感染率以及p53、Bcl-2和C-myc基因的表达，分析EBV和p53、Bcl-2、C-myc基因表达的关系。方法 检测48例手术切除肺癌标本，18例癌旁支气管粘膜组织，2例肺转移平滑肌肉瘤，1例结核瘤，14例正常肺组织中EBV DNA及p53、Bcl-2、C-myc基因表达。用PCR法检测新鲜组织的EBV DNA，间接原位PCR法观察EBV阳性信号在细胞中的反应部位，免疫组化(SABC)法检测p53、Bcl-2、C-myc在肺癌中的表达。结果 25例(52.08%)肺癌标本呈EBV DNA阳性，其中鳞癌的阳性率(75%)最高。EBV DNA阳性和肺癌组织学分型有关(P<0.01)。癌旁支气管粘膜组织和肺组织EBV DNA阳性率分别为61.11%和28.57%(P<0.01)。免疫组化分析表明p53、Bcl-2和C-myc在肺癌组织中表达率分别为54.17%、37.5%和75%，其中p53和Bcl-2表达与组织学分型有关(P<0.05)。肺癌组织中EBV DNA阳性者的p53、Bcl-2、C-myc表达阳性率较阴性者明显增高(P<0.05)。结论 肺癌中有较高的EBV感染率。EBV感染可能在肺癌的发生中起重要作用，这种作用可能是通过激活某些癌基因实现的。
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【中图分类号】 R734.202；R734.204
The relationship between Epstein-Barr-virus infection and expression of p53, Bcl-2 and C-myc gene in lung cancer
XIA Heshun WU Jianping CHEN Chunmei MAO Yongrong ZHU Jian CHANG Qing MI Keyong, ZHAO Junli ZHANG Minghe
(Pathology Department of Hubei Cancer Hospital, Wuhan, Hubei 430079, P.R.China)
【Abstract】 Objective To investigate the infection rate of EBV and the expression of p53, Bcl-2 and C-myc gene in lung cancer, to explore the relation between EBV and oncogenesis of lung cancer, and the relation between EBV and expression of p53, Bcl-2 and C-myc. Methods Forty-eight cases of excised specimen of lung cancer, 2 of lung metastatic leiomyosarcoma, 1 of tuberculoma, 18 of paraneoplastic bronchial mucosa tissue, and 14 of normal lung tissue were analyzed. EBV DNA of the fresh tissue was detected with PCR, and indirect in situ PCR was used to observe the reaction site of EBV DNA, and immunohistochemistry (SABC) was used to detect the expression of p53, Bcl-2, and C-myc gene. Results Twenty-five cases of the 48 lung cancer had positive staining of EBV DNA and 75% of squamous cell carcinoma showed positive staining of EBV DNA. The positive staining of EBV DNA was closely related to histological classfication of lung cancer (P<0.01). The positive rate of EBV DNA in paraneoplastic bronchial mucosa tissues and normal pulmonary tissues was 61.11%(11/18) and 28.5%(4/14) respectively (P<0.01). The positive rate of p53, Bcl-2 and C-myc expression in lung cancer tissues was 54.17%, 37.5% and 75% respectively. The expression of p53 and Bcl-2 was closely related to histological classification (P<0.05). The positive rate of p53, Bcl-2 and C-myc expression in patients with positive EBV DNA was significantly higher than that in patients with negative EBV DNA (P<0.05). Conclusion Lung cancer has high EBV infection. EBV infection may play an important role in the oncogenesis of lung cancer, which might bring about through activating some oncogenes.
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【Key words】 Lung neoplasms EBV EBV DNA Pathogenesis Oncogene
爱波司坦-巴尔病毒(EBV)是一种癌基因DNA病毒，研究认为它与某些肿瘤发生有关[1，2]，在肺癌中它主要和肺淋巴上皮样癌有关[3，4]。肺癌的发生、演变及恶性程度与某些癌基因激活、抑癌基因的丢失导致凋亡缺陷和受阻有密切关系，这些基因中研究较多且具重要作用的有p53、Bcl-2和C-myc等基因。本研究用分子生物学的方法对48例肺癌患者癌组织及其相关组织中EBV感染及p53、Bcl-2及C-myc基因表达及它们在肺癌发生中的作用进行了探讨。
1 材料和方法
1.1 组织标本 收集48例肺癌患者的癌组织，同时收集18例癌旁支气管粘膜组织及14例癌旁肺组织。患者中男性31例，女性17例，年龄34～63岁，平均47岁。其中鳞癌20例，腺癌22例(包括3例细支气管肺泡癌)，非典型性类癌3例，小细胞肺癌2例，大细胞肺癌1例。原发瘤直径<3cm者4例，>3cm者44例。Ⅰ期26例，Ⅱ期18例，Ⅲ期4例。另选2例肺转移性平滑肌肉瘤，1例肺结核瘤及其支气管粘膜组织作为对照组织。
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1.2 EBV DNA的普通PCR检测 取新鲜组织裂解后，常规酚/氯仿提取DNA。EBV DNA引物参照文献5的序列设计，两对引物分别为：
①gp220(BamHI L region) 5′-GGCTGGTGTCACCGGTGTTA-3′，5′-CCTTAGGAGGAACAAGTCCC-3′，扩增片段长度239bp；
②EBNA1(BamHI W Region) 5′-GTCATCATCATCCGGGTCTC-3′，5′-TTCGGGTTGGAACCTCCTTG-3′，扩增片段长度269bp。
30μlPCR反应液中，含1× PCR buffer，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTPs，1U Taq DNA聚合酶，上、下游引物各0.5μmol/L，模板5μl，上覆30μl无菌矿物油。扩增程序为94℃预变性5分钟，94℃60秒，55℃60秒，72℃60秒，共35个循环，最后72℃延伸3分钟。反应结束后取5μl PCR反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，透射紫外仪上观察结果，在Marker的237bp及269bp附近处有DNA条带者为阳性。阳性对照为B95-8转化细胞。
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1.3 间接原位PCR检测 用间接原位PCR法对普通PCR法检测出的12例EBV阳性和2例阴性肺癌病例的石蜡切片进行检测，分析EBV DNA在癌组织中的反应部位。将原位载玻片在0.1NHCl中浸泡过夜，蒸馏水清洗，晾干，用1%APES-丙酮溶液处理30秒，丙酮中5分钟，晾干。组织切片厚4μm，经预处理后，进行PCR原位扩增。100μl原位PCR反应液中，含1×PCR buffer，1.5mmol/L MgCl2，300μmol/L dNTPs，10U Taq DNA聚合酶，上、下游引物各1μmol/L。每张切片加80～100μl反应液，使组织切片被完全覆盖。扩增程序同普通PCR，经20个循环，最后72℃延伸10分钟。将1.2中常规PCR扩增的特异性EBV DNA片段用长臂光敏生物素标记成探针，杂交探针浓度为1μg/ml，AV-VP亲合，NBT和BCIP显色，核固红套染。胞核中出现黄棕色到兰黑色颗粒者为阳性。
1.4 免疫组织化学方法分析 免疫组织化学方法使用SABC法。p53阳性着色为胞核呈棕黄色，Bcl-2阳性为胞浆呈棕黄色，C-myc阳性为细胞核或胞浆染色呈棕黄色。
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1.5 统计学处理 统计方法采用χ2检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 EBV DNA普通PCR检测结果 48例肺癌组织中，有25例(52.08%)EBV DNA阳性(图1、2)，其中鳞癌的阳性率为75% (15/20)，腺癌为36.36%(8/22)，非典型性类癌为33.33%(1/3)，大细胞肺癌为100%(1/1)，小细胞肺癌为0(0/2)。EBV DNA阳性率在鳞癌中较高，与其它组织类型之间(大细胞肺癌除外)的差异有显著性(χ2＝6.31，P<0.06)。EBV DNA阳性者中临床分期属Ⅰ期者有18例(18/26，69.23%)，Ⅱ期者6例(6/18，33.33%)，Ⅲ期者1例(1/4，25%)，不同期别间阳性率差异有显著性(P<0.05)。
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图1 EBV P1P2 DNA引物(BamHI L region)扩增产物电泳图
1：PCR marker；2：阳性对照；3：阴性对照；4、5、8：阳性；6、7：阴性。
Fig 1 The electrophoresis photograph of amplification product of EBV DNA P1P2 polymer(BamHI L region)
1: PCR marker; 2: positive control; 3: negative control; 4,5 and 8: EBV DNA positive; 6 and 7: EBV DNA negative.
图2 EBV P3P4 DNA引物(BamHI W region)扩增产物电泳图
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1：PCR marker；2：阳性对照；3：阴性对照；4、7、8：阳性；5、6：阴性。
Fig 2 The electrophoresis photograph of amplification product of EBV DNA P3P4 polymer(BamHI W region)
1: PCR marker; 2: positive control; 3: negative control; 4,7 and 8: EBV DNA positive; 5 and 6: EBV DNA negative.
18例癌旁支气管粘膜组织中，11例(61.11%)EBV DNA阳性，14例癌旁肺组织中，4例(28.57%)EBV DNA阳性，两者之间阳性率差异有显著性(P<0.01)。
2例肺转移性平滑肌肉瘤和1例肺结核瘤中均未发现EBV DNA扩增，但它们的支气管粘膜组织中EBV DNA呈阳性反应。
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2.2 间接原位PCR法结果 12例EBV DNA PCR阳性病例中10例间接原位PCR呈阳性，阳性信号强弱不等，从棕黄色到兰黑色，定位于胞核中，有靠核边倾向。2例阴性病例未发现阳性信号。
2.3 免疫组织化学分析结果 p53、Bcl-2和C-myc免疫组织化学染色法检测结果见表1。 48例肺癌标本中，26例(54.17%)p53阳性, 18例(37.5%)Bcl-2阳性，36例(75%)C-myc阳性(图3、4)。p53和Bcl-2基因表达在组织学分型间差异有显著性(P<0.01)。p53、Bcl-2、C-myc基因在患者性别、肿瘤大小、临床分期、淋巴结有无转移间差异没有显著性。
表1 不同组织中p53、Bcl-2和C-myc免疫组化法分析结果
Tab 1 Comparison of p53, Bcl-2 and C-myc
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expression in different lung tissues Lung tissue
N
No. of cases
p53
positive(%)
Bcl-2
positive(%)
C-myc
positive(%)
Lung cancer
48
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26(54.16)
18(37.50)
36(75)
Squamous epithelial
cancer
20
14(70)
4(20)
18(90)
Adenocarcinoma
22
10(45.45)
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11(50)
16(72.73)
Atypical carcinoid
3
1(33.33)
1(33.33)
2(66.67)
Large cell lung cancer
1
1(100)
0
0
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Small cell lung cancer
2
0
2(100.00)
0
Bronchial mucosa
21
0
2(100.00)
0
Pulmonary tissue
14
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0
2(14.28)
2(14.28)
Metastatic leiomyosarcoma
2
1(50.00)
0
0
Tuberculosis
1
0
0
, 百拇医药 0
图3 细支气管肺泡细胞癌，胞浆内Bcl-2阳性 ×400 SABC法
Fig 3 Alveolar-bronchial carcinoma with positive Bcl-2 protein immunohistochemical staining in cytoplasma ×200 SABC
图4 低分化腺癌，胞核和胞浆内C-myc阳性 ×400 SABC法
Fig 4 Low differentiated squamous cell carcinoma with positive C-myc protein immunmohistochemical staining in nucleus and cytoplasma ×400 SABC
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癌旁支气管粘膜组织、肺组织，以及肿瘤间质和肺结核瘤中p53均呈阴性,仅1例(50%)肺转移性平滑肌肉瘤p53呈阳性；9例癌旁支气管粘膜组织基底细胞呈Bcl-2阳性，间质中淋巴组织Bcl-2呈阳性反应，但生发中心中淋巴母细胞呈阴性反应(图5)；C-myc在支气管粘膜及肺组织中部分呈阳性反应。
图5 肺内淋巴组织Bcl-2染色反应，淋巴小结亮区呈阴性反应，暗区呈阳性反应 ×200 SABC法
Fig 5 Bcl-2 protein immunohistochemical staining results in pulmonary lymphatic tissue. The light region of lymphonodule showed negative and dark zone showed positive ×200 SABC
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2.4 EBV DNA阳性和p53、Bcl-2、C-myc表达的关系 在25例EBV DNA阳性的病例中，18例(72%)为p53阳性，13例(52%)为Bcl-2阳性，23例(92%)为C-myc阳性。在EBV DNA阴性病例中p53、Bcl-2和C-myc基因的表达分别为34.78%、21.73%和69.56%，明显低于EBV DNA阳性者中的表达率。
3 讨论
EBV是一种癌基因病毒，与许多肿瘤发生有关[1～4]。EBV DNA有9个基因能编码EBV核抗原(EBNA)和3个潜在膜蛋白，其中EBNA1是EBV相关恶性肿瘤中唯一始终表达的蛋白质，具有和DNA结合能力，而且还有较强的RNA结合能力，它在所有含病毒基因组的细胞中均可被检出，EBV DNA在低分化鼻咽癌中出现的概率几乎是100%[1]。我们结合文献设计两对EBV DNA引物,用PCR方法来检测48例原发性肺癌组织标本中EBV DNA。结果发现25例EBV DNA阳性，间接原位PCR反应证实EBV DNA阳性信号位于胞核中。其中鳞癌的阳性率最高，较多癌旁支气管粘膜组织和部分癌旁肺组织中发现EBV DNA阳性，2例肺转移性平滑肌肉瘤和1例肺结核瘤中EBV DNA阴性，但其支气管粘膜组织中EBV DNA也呈阳性反应。这些结果说明EBV在肺癌组织中有很高的感染率，EBV有可能在肺癌发生中发挥重要作用。
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p53在肺癌中的表达率为43%～75%[6，7]，p53免疫组织化学研究表明本组有54.16%p53呈阳性反应，反应为胞核型。其中鳞癌的阳性率显著高于腺癌，EBV DNA阳性者中p53表达较阴性者明显升高。
Henderson等[8]和Finke等[9]证明Bcl-2过度表达是由Lmp-1介导所致，在淋巴系统EBV DNA阳性肿瘤中已被证明有Bcl-2过度表达。Chen等[4]发现EBER-1阳性的“肺淋巴上皮样癌”中全部表达Bcl-2，与其它组织学类型间有显著性差异。Bcl-2在正常支气管粘膜上皮基底层细胞选择性地阳性，似乎表明Bcl-2可以延长基底细胞生命期[10]，从而导致另外的危险因素发生，如EBV感染。本组结果发现EBV DNA阳性和EBV DNA阴性患者中Bcl-2表达差异有显著性，提示EBV感染和Bcl-2高表达有一定的联系。
, 百拇医药 原癌基因C-myc在细胞的生长和凋亡过程中均发挥作用。在永生化B淋巴细胞中，C-myc基因表达异常，目前仍未发现有肺癌中EBV和C-myc基因关系的研究报道。本组48例患者中36例免疫组织化学C-myc呈阳性反应,反应以胞核为主，部分细胞胞浆也呈阳性反应。EBV DNA阳性病例中C-myc表达率显著高于阴性病例，提示EBV与C-myc之间可能有关。
在恶性肿瘤癌基因的研究中，不少学者提出了多基因协同作用的假设，认为在肿瘤的发生、发展的各阶段，至少有二个或二个以上的功能不同的异常激活的癌基因各自发挥不同的作用，并在时间和空间上相互配合、协同加强了细胞的癌变。在决定细胞是增生还是凋亡，需要p53、Bcl-2和C-myc三者的存在，更重要的是三者出现在时间和量上的精确调节。本研究结果说明p53、C-myc、Bcl-2三个癌基因均在肺癌的发生中起了一定的作用。此外，EBV DNA阳性者和阴性者中p 53、Bcl-2、C-myc的表达差异有显著性，但由于本组病例数较少，EBV感染与p53、Bcl-2、C-myc是否存在相关关系还需进一步探讨。
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参 考 文 献
1，Shao X, He Z, Chen Z, et al. Expression of an Epstein-Barr-virus receptor and Epstein-Barr-Virus-dependent transformation of human nasopharyngeal epithelial cells. Int J Cancer,1997,71(5)∶750-755.
2，Wong MP, Chung LP, Yuen ST,et al. In situ detection of Epstein-Barr virus in non-small cell lung carcinomas. J Pathol,1995,177(3)∶233-240.
3，Kasai K, Sato Y, Kameya T, et al.Incidence of latent infection of Epstein-Barr virus in lung cancer --an analysis of EBER, expression in lung cancers by in situ hybridization. J Pathol,1994,174(3)∶257-265.
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4，Chen FF, Yan JJ, Lai WW, et al. Epstein-Barr virus-associated non-small cell lung carcinoma. Undifferentiated“lymphoepithelioma-like "carcinoma as a distinct entity with better prognosis. Cancer,1998,82(12)∶2334-2342.
5，Telenti A, Marshall WF, Smith TF. Detection of Epstein-Barr virus by polymerase chain reaction. J Clin Microbiol,1990,28(10)∶2187-2192.
6，Kishmoto Y, Murakami Y, Shirashi M, et al. Aberrations of the p53 tumor suppressor gene in human non-small cell lung carcinomas of the lung. Cancer Res,1992,52(17)∶4799-4804.
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7，高振强，高志萍，张晓彬.肺癌中p53基因突变类型和可能致癌因素.中华预防医学杂志,1997，31(2)∶88-91.
8，Henderson S, Rowe M, Giegory C, et al. Induction of Bcl-2 expression by Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 proteins infected B-cells from programmed cell death. Cell,1991,65(7)∶1107-1115.
9，Finke J, Fritzen R, Terns P, et al. Expression of Bcl-2 in Burkitt'lymphoma cell lines: Induction by latent Epstein-Barr virus genes. Blood,1992,80(2)∶459-469.
10，Walker C, Roberson L, Myokow M, et al. Expression of the Bcl-2 protein in normal and dysplastic bronchial epithelium and in lung carcinomas. Br J Cancer,1995,72(1)∶164-169.
(收稿：1999-11-17 修回：2000-02-19), 百拇医药