特异性细胞毒T淋巴细胞与脑荷瘤鼠生存期延长的研究
作者：王云永 赵贵德
单位：王云永 赵贵德(大连医科大学附属第二医院,辽宁 大连 116023)
关键词：胶质瘤；细胞毒T淋巴细胞；过继性免疫治疗；生存期
现代康复000445
摘要：目的：探索过继性免疫与脑荷瘤鼠的生存期。方法：瘤苗致敏小鼠的脾细胞在体外再次经瘤细胞和重组白细胞介素-2(rIL-2)刺激后，过继免疫治疗荷瘤鼠。结果：局部注射细胞毒T淋巴细胞(CTL)+rIL-2治疗荷瘤鼠的生存期明显延长。结论：上述方法获得的效应细胞对G422瘤细胞具有特异性杀伤,局部注射CTL+rIL-2能有效的治疗脑胶质瘤并延长其生存期。
中图分类号：R730.264 文献标识码：A
文章编号：1007-5496(2000)04-0566-02
, http://www.100md.com
Specifical cytotoxic T lymphocytes treated glioma in mice
WANG Yun-yong，ZHAO Gui-de
(Department of Neurosurgery,The Second Affilited Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116023,China)
Abstract Objective:To find the method of adoptive immunologic therapy to glioma.Method:The spleen cells which were obtained from the mice immunized with vaccine were cultured with G422 cells and rIL-2 for in vitro . Tumor-bearing mice were treated by local injection of these immune cells and their survival were observed.Result:Survival of tumor-bearing mice treated by these cells+rIL- 2 was increased.Conclusion:Glioma may be treated effectively by local adminstration of tumor-specific immune cells and rIL-2.
, 百拇医药
Key words glioma;cytotoxic T lymphocyte;adoptive immunotherapy
1资料与方法
1.1实验资料动物：雌性昆明鼠，18～20g。瘤株：G422胶质母细胞瘤。白血病瘤株Raji，试剂：重组白细胞介素-2(rIL-2),抗CD4+单克隆抗体、抗CD8+单克隆抗体。
1.2实验方法按文献[1]的方法,制成丝裂霉素榄香烯瘤苗。取瘤苗1ml,给小鼠皮下以及腹腔多点注射2次，第2次致敏10d后，将小鼠断头处死，取其脾脏，获得脾细胞，每毫升培养液中加入2×106脾细胞，4×105瘤细胞(经榄香烯和丝裂霉素处理)，rIL-2400u于37℃5%CO2培养箱中培养扩增10d，收集培养后的脾细胞，用FACSCalibur流式细胞仪测定细胞表型。
取G422瘤块，机械剪碎，200目铜网过滤，制成单细胞悬液，用96孔培养板每孔加入靶细胞1×105/100ml，再将体内、外二次致敏的脾细胞(A组)，单纯体内致敏脾细胞(B组)，LAK(C组)，正常脾细胞(D组)按效/靶比1:1、5:1、10:1、20:1、40:1分别加入每孔中。置培养箱中18h，用胎盘兰排除法计数存活靶细胞。
, 百拇医药
效应细胞杀伤力=(1-与效应细胞共育后剩余的靶细胞/未加效应细胞培养液中所生存的靶细胞)×100%。
比较细胞毒T淋巴细胞(CTL)对G422瘤和非胶质瘤细胞Raji细胞的杀伤性。
用过继性免疫治疗方法及荷瘤鼠生存期观察。将55只昆明鼠随机分成4组：A组15只，B组15只，C组15只，，D组10只。用微量注射器取1×103/5ml,直接穿刺小鼠右额叶，进针深度3～4mm，缓慢注射G422。接种后第2d再在原来穿刺部位分别注射效应细胞：CTL2×106+rIL-2100u，CTL2×106，rIL-2100u，生理盐水5ml。观察这些荷瘤鼠的生存期。
2结果
2.1细胞表型的测定CD4+A(71±10)%；B(57±9)%，C(54±11)%，D(43±8)%。CD8+A(37±6)%，B(30±6)%，C(29±8)%，D(27±7)%。(P<0.05)。
, 百拇医药
2.2各组效应细胞对G422的杀伤力不同效/靶比的效应细胞对G422杀伤以不同效/靶比为自变量(x)，以杀伤百分率为因变量(Y)，所得的各组相关系数和回归方程见表1。不同实验组效应细胞杀伤差异显著性见表2。
从表2可见A与D，B与D，C与D的回归系数差异显著(P<0.05)，说明正常脾细胞对G422的杀伤力最低。B与C虽然回归系数无显著差异，但是截距有显著差异(P<0.05)，证明体内致敏的脾细胞较LAK杀伤强，A与B回归系数和截距系数均无显著差异，但有增强的趋势。由此看出体内致敏的脾细胞，体外再次经rIL-2和瘤细胞培养后获得的CTL杀伤力最强。
2.3CTL对G422和Raji的杀伤性测定见表3。
由表3可以看出不同浓度的CTL对G422的杀伤性均强于对Raji细胞的杀伤性，说明此方法诱导的CTL对G422瘤细胞的具有特异性杀伤，而对非胶质瘤Raji细胞无明显细胞毒性。
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2.4脑荷瘤鼠的生存期(见图1)。从图1可以看出中位生存时间A组为73d，B组36d，C组为24d，D组为18d。A与D、B与D生存期时序检验P<0.005。A与B生存期时序检验P<0.05,而C与D生存期时序检验P>0.05。A组荷瘤鼠的生存期明显延长。
3讨论
3.1诱导特异性CTL对比Holladay用RT2胶质瘤细胞和短小棒杆菌给小鼠体内致敏，取脾细胞，体外与RT2瘤细胞和IL-2共同培养出效应细胞，细胞表型2/3为CD4+、1/3为CD8+T淋巴细胞。这种经2次致敏的效应细胞对RT2瘤细胞具有明显的特异性杀伤性[2]。本组研制的瘤苗诱导的CTL的细胞毒性与Holladay的结果一致。体内和体外2次刺激的效应细胞对G422瘤细胞杀伤性较单纯体内致敏的淋巴细胞、正常脾细胞、LAK细胞有所增强，且对非胶质瘤细胞Raji细胞无明显杀伤性。原因可能是瘤苗体内致敏后，小鼠产生CTL的前效应细胞。体外细胞毒性测定显示CTL对G422的杀伤较单纯体内致敏的淋巴细胞的细胞毒性增强。
, 百拇医药
3.2过继性免疫的治疗模型Holladay[3]等用静脉注射CTL和rIL-2治疗大鼠胶质瘤，使荷瘤鼠生存期得到延长。他认为CTL可以通过血脑屏障进入胶质瘤灶内，而且rIL-2还有开放血脑屏障的作用。Kruse[4]等用立体定向方法向瘤灶内局部注射LAK和rIL-2有明显疗效。本组实验是局部注射CTL+rIL-2治疗脑内荷瘤鼠,生存期较单纯注射CTL或rIL-2及对照组的生存期明显延长。比较两种方法，局部注射过继免疫治疗方法更适合脑胶质瘤：(1)CTL直接进入瘤灶中，避免了血脑屏障的影晌。(2)减少rIL-2的剂量，减少rIL-2的付作用。(3)脑胶质瘤多呈单灶性生长，为局部注射治疗提供了有利条件。
图1各组小鼠生存曲线
用同种异体动物的CTL治疗脑胶质瘤，虽然存在组织相容性的问题，但是不会引起强烈移植物抗宿主反应，CTL其特异性表现为只对同源性胶质瘤产生免疫杀伤，而对异源性胶质瘤、非胶质瘤和正常脑细胞不产生免疫杀伤。原因是细胞免疫受抗原和主要组织相容复合体(MHC)的双重限制。CTL对靶细胞的杀伤受MHC-I类分子的限制，而MHC-I类分子只在脑肿瘤细胞上表达。另外，脑组织是部分免疫特免器官，对外来异物的排斥反应较弱，为异体CTL的存活提供了条件。此点符合临床病人情况，胶质瘤病人自身的免疫功能低下，且胶质瘤细胞产生转化生长因子β2(TGFβ2)，TGFβ2能抑制机体细胞免疫应答反应[5]，不能产生数量足够的前效应细胞，而免疫功能正常的健康人，经瘤苗免疫后能产生足够的前效应细胞，体外经肿瘤细胞再次刺激而产生大量的CTL。
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表1 各组的相关系数与回归方程
相关系数
回归方程
A
r=0.9780t=8.1229P<0.005
Y=32.9347+1.0964X
B
r=0.924t=4.1866P<0.02
Y=26.4038+0.8287X
C
r=0.9740t=7.4978P<0.005
, 百拇医药
Y=17.2076+1.0535X
D
r=0.9077t=3.7477P<0.05
Y=7.4212+0.2985X
表2 各组的回归方程显著性检验
回归系数检验
截矩系数检验
A与B
t=1.4997P>0.05
t=2.0780P>0.05
B与C
, http://www.100md.com
t=1.2282P>0.05
t=2.6519P<0.05
A与C
t=0.2201P>0.05
t=4.5758P<0.005
B与D
t=3.7473P<0.01
t=7.8180P>0.001
A与D
t=5.0951P<0.01
t=9.1033P<0.001
, 百拇医药
C与D
t=4.6952P<0.05
t=3.4280P>0.02
表3 CTL对G422和Raji杀伤活性测定 效/靶比
G422
Raji
1:1
30±0.3*
2.2±0.1
5:1
37.8±0.7*
2.3±0.2
, http://www.100md.com
10:1
46.9±0.8*
2.4±0.2
20:1
59.3±0.2*
2.5±0.3
40:1
74±0.7
2.5±0.1
作者简介：王云永(1966-)，男，硕士，主治医师。研究方向：胶质瘤的免疫治疗。
参 考 文 献
, 百拇医药 [1]吴东升，赵贵德，魏明海.瘤苗主动免疫治疗恶性肿瘤实验研究及床初步观察[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，1999,2：134～135
[2]Holladay FP,Lopez G,Mamata de,et al.Generation of cytotoxic immune response against a rat glioma by in vivo primary and secondary in vitro stimulation with tumor cells[J].Neurosurgery,1992,30:499
[3]Holladay FP,Heitz T,Chen YL,et al.Successful treatment of a malig-ment rat glioma with cytotoxic T lymphocytes[J].Neurosurgery,1992,31:528～ 533
, 百拇医药
[4]Krusw CA,Schilta PM,Bellgrau D,et al.Intracranial administration of single or multipe source allogeneic cytotoxic T lymphocytes :chronic therapy for primary brain tumors[J]. J Neurooncol,1994,19:161
[5]Kuppner MC,Hamou MF,Bodmer S.The glioblastoma drived T- cell suppressor facters transforming growth facter b inhibits the generation of lymphokine- activated killer(LAK) cells[J].Int J cancer,1988,42:562
收稿：2000-01-31, 百拇医药
单位：王云永 赵贵德(大连医科大学附属第二医院,辽宁 大连 116023)
关键词：胶质瘤；细胞毒T淋巴细胞；过继性免疫治疗；生存期
现代康复000445
摘要：目的：探索过继性免疫与脑荷瘤鼠的生存期。方法：瘤苗致敏小鼠的脾细胞在体外再次经瘤细胞和重组白细胞介素-2(rIL-2)刺激后，过继免疫治疗荷瘤鼠。结果：局部注射细胞毒T淋巴细胞(CTL)+rIL-2治疗荷瘤鼠的生存期明显延长。结论：上述方法获得的效应细胞对G422瘤细胞具有特异性杀伤,局部注射CTL+rIL-2能有效的治疗脑胶质瘤并延长其生存期。
中图分类号：R730.264 文献标识码：A
文章编号：1007-5496(2000)04-0566-02
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Specifical cytotoxic T lymphocytes treated glioma in mice
WANG Yun-yong，ZHAO Gui-de
(Department of Neurosurgery,The Second Affilited Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116023,China)
Abstract Objective:To find the method of adoptive immunologic therapy to glioma.Method:The spleen cells which were obtained from the mice immunized with vaccine were cultured with G422 cells and rIL-2 for in vitro . Tumor-bearing mice were treated by local injection of these immune cells and their survival were observed.Result:Survival of tumor-bearing mice treated by these cells+rIL- 2 was increased.Conclusion:Glioma may be treated effectively by local adminstration of tumor-specific immune cells and rIL-2.
, 百拇医药
Key words glioma;cytotoxic T lymphocyte;adoptive immunotherapy
1资料与方法
1.1实验资料动物：雌性昆明鼠，18～20g。瘤株：G422胶质母细胞瘤。白血病瘤株Raji，试剂：重组白细胞介素-2(rIL-2),抗CD4+单克隆抗体、抗CD8+单克隆抗体。
1.2实验方法按文献[1]的方法,制成丝裂霉素榄香烯瘤苗。取瘤苗1ml,给小鼠皮下以及腹腔多点注射2次，第2次致敏10d后，将小鼠断头处死，取其脾脏，获得脾细胞，每毫升培养液中加入2×106脾细胞，4×105瘤细胞(经榄香烯和丝裂霉素处理)，rIL-2400u于37℃5%CO2培养箱中培养扩增10d，收集培养后的脾细胞，用FACSCalibur流式细胞仪测定细胞表型。
取G422瘤块，机械剪碎，200目铜网过滤，制成单细胞悬液，用96孔培养板每孔加入靶细胞1×105/100ml，再将体内、外二次致敏的脾细胞(A组)，单纯体内致敏脾细胞(B组)，LAK(C组)，正常脾细胞(D组)按效/靶比1:1、5:1、10:1、20:1、40:1分别加入每孔中。置培养箱中18h，用胎盘兰排除法计数存活靶细胞。
, 百拇医药
效应细胞杀伤力=(1-与效应细胞共育后剩余的靶细胞/未加效应细胞培养液中所生存的靶细胞)×100%。
比较细胞毒T淋巴细胞(CTL)对G422瘤和非胶质瘤细胞Raji细胞的杀伤性。
用过继性免疫治疗方法及荷瘤鼠生存期观察。将55只昆明鼠随机分成4组：A组15只，B组15只，C组15只，，D组10只。用微量注射器取1×103/5ml,直接穿刺小鼠右额叶，进针深度3～4mm，缓慢注射G422。接种后第2d再在原来穿刺部位分别注射效应细胞：CTL2×106+rIL-2100u，CTL2×106，rIL-2100u，生理盐水5ml。观察这些荷瘤鼠的生存期。
2结果
2.1细胞表型的测定CD4+A(71±10)%；B(57±9)%，C(54±11)%，D(43±8)%。CD8+A(37±6)%，B(30±6)%，C(29±8)%，D(27±7)%。(P<0.05)。
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2.2各组效应细胞对G422的杀伤力不同效/靶比的效应细胞对G422杀伤以不同效/靶比为自变量(x)，以杀伤百分率为因变量(Y)，所得的各组相关系数和回归方程见表1。不同实验组效应细胞杀伤差异显著性见表2。
从表2可见A与D，B与D，C与D的回归系数差异显著(P<0.05)，说明正常脾细胞对G422的杀伤力最低。B与C虽然回归系数无显著差异，但是截距有显著差异(P<0.05)，证明体内致敏的脾细胞较LAK杀伤强，A与B回归系数和截距系数均无显著差异，但有增强的趋势。由此看出体内致敏的脾细胞，体外再次经rIL-2和瘤细胞培养后获得的CTL杀伤力最强。
2.3CTL对G422和Raji的杀伤性测定见表3。
由表3可以看出不同浓度的CTL对G422的杀伤性均强于对Raji细胞的杀伤性，说明此方法诱导的CTL对G422瘤细胞的具有特异性杀伤，而对非胶质瘤Raji细胞无明显细胞毒性。
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2.4脑荷瘤鼠的生存期(见图1)。从图1可以看出中位生存时间A组为73d，B组36d，C组为24d，D组为18d。A与D、B与D生存期时序检验P<0.005。A与B生存期时序检验P<0.05,而C与D生存期时序检验P>0.05。A组荷瘤鼠的生存期明显延长。
3讨论
3.1诱导特异性CTL对比Holladay用RT2胶质瘤细胞和短小棒杆菌给小鼠体内致敏，取脾细胞，体外与RT2瘤细胞和IL-2共同培养出效应细胞，细胞表型2/3为CD4+、1/3为CD8+T淋巴细胞。这种经2次致敏的效应细胞对RT2瘤细胞具有明显的特异性杀伤性[2]。本组研制的瘤苗诱导的CTL的细胞毒性与Holladay的结果一致。体内和体外2次刺激的效应细胞对G422瘤细胞杀伤性较单纯体内致敏的淋巴细胞、正常脾细胞、LAK细胞有所增强，且对非胶质瘤细胞Raji细胞无明显杀伤性。原因可能是瘤苗体内致敏后，小鼠产生CTL的前效应细胞。体外细胞毒性测定显示CTL对G422的杀伤较单纯体内致敏的淋巴细胞的细胞毒性增强。
, 百拇医药
3.2过继性免疫的治疗模型Holladay[3]等用静脉注射CTL和rIL-2治疗大鼠胶质瘤，使荷瘤鼠生存期得到延长。他认为CTL可以通过血脑屏障进入胶质瘤灶内，而且rIL-2还有开放血脑屏障的作用。Kruse[4]等用立体定向方法向瘤灶内局部注射LAK和rIL-2有明显疗效。本组实验是局部注射CTL+rIL-2治疗脑内荷瘤鼠,生存期较单纯注射CTL或rIL-2及对照组的生存期明显延长。比较两种方法，局部注射过继免疫治疗方法更适合脑胶质瘤：(1)CTL直接进入瘤灶中，避免了血脑屏障的影晌。(2)减少rIL-2的剂量，减少rIL-2的付作用。(3)脑胶质瘤多呈单灶性生长，为局部注射治疗提供了有利条件。
图1各组小鼠生存曲线
用同种异体动物的CTL治疗脑胶质瘤，虽然存在组织相容性的问题，但是不会引起强烈移植物抗宿主反应，CTL其特异性表现为只对同源性胶质瘤产生免疫杀伤，而对异源性胶质瘤、非胶质瘤和正常脑细胞不产生免疫杀伤。原因是细胞免疫受抗原和主要组织相容复合体(MHC)的双重限制。CTL对靶细胞的杀伤受MHC-I类分子的限制，而MHC-I类分子只在脑肿瘤细胞上表达。另外，脑组织是部分免疫特免器官，对外来异物的排斥反应较弱，为异体CTL的存活提供了条件。此点符合临床病人情况，胶质瘤病人自身的免疫功能低下，且胶质瘤细胞产生转化生长因子β2(TGFβ2)，TGFβ2能抑制机体细胞免疫应答反应[5]，不能产生数量足够的前效应细胞，而免疫功能正常的健康人，经瘤苗免疫后能产生足够的前效应细胞，体外经肿瘤细胞再次刺激而产生大量的CTL。
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表1 各组的相关系数与回归方程
相关系数
回归方程
A
r=0.9780t=8.1229P<0.005
Y=32.9347+1.0964X
B
r=0.924t=4.1866P<0.02
Y=26.4038+0.8287X
C
r=0.9740t=7.4978P<0.005
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Y=17.2076+1.0535X
D
r=0.9077t=3.7477P<0.05
Y=7.4212+0.2985X
表2 各组的回归方程显著性检验
回归系数检验
截矩系数检验
A与B
t=1.4997P>0.05
t=2.0780P>0.05
B与C
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t=1.2282P>0.05
t=2.6519P<0.05
A与C
t=0.2201P>0.05
t=4.5758P<0.005
B与D
t=3.7473P<0.01
t=7.8180P>0.001
A与D
t=5.0951P<0.01
t=9.1033P<0.001
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C与D
t=4.6952P<0.05
t=3.4280P>0.02
表3 CTL对G422和Raji杀伤活性测定 效/靶比
G422
Raji
1:1
30±0.3*
2.2±0.1
5:1
37.8±0.7*
2.3±0.2
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10:1
46.9±0.8*
2.4±0.2
20:1
59.3±0.2*
2.5±0.3
40:1
74±0.7
2.5±0.1
作者简介：王云永(1966-)，男，硕士，主治医师。研究方向：胶质瘤的免疫治疗。
参 考 文 献
, 百拇医药 [1]吴东升，赵贵德，魏明海.瘤苗主动免疫治疗恶性肿瘤实验研究及床初步观察[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，1999,2：134～135
[2]Holladay FP,Lopez G,Mamata de,et al.Generation of cytotoxic immune response against a rat glioma by in vivo primary and secondary in vitro stimulation with tumor cells[J].Neurosurgery,1992,30:499
[3]Holladay FP,Heitz T,Chen YL,et al.Successful treatment of a malig-ment rat glioma with cytotoxic T lymphocytes[J].Neurosurgery,1992,31:528～ 533
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[4]Krusw CA,Schilta PM,Bellgrau D,et al.Intracranial administration of single or multipe source allogeneic cytotoxic T lymphocytes :chronic therapy for primary brain tumors[J]. J Neurooncol,1994,19:161
[5]Kuppner MC,Hamou MF,Bodmer S.The glioblastoma drived T- cell suppressor facters transforming growth facter b inhibits the generation of lymphokine- activated killer(LAK) cells[J].Int J cancer,1988,42:562
收稿：2000-01-31, 百拇医药