肾康注射液对肾小管上皮细胞LLCPK1分泌Ⅳ型胶原的影响
作者：赵宗江 张新雪 傅博 陈香美 叶传蕙 牛建昭 李明权
单位：北京中医药大学，北京 100029
关键词：肾康注射液；肾小管上皮细胞；LLCPK1；Ⅳ型胶原；中医药
中国中西医结合急救杂志000403摘要：目的：探讨肾康注射液对肾小管上皮细胞LLCPK1分泌Ⅳ型胶原(CoⅣ)的影响。方法：用细胞酶联免疫吸附法(ELISA)，以单味大黄注射液为实验对照组，检测肾康注射液对肾小管上皮细胞LLCPK1分泌CoⅣ含量的影响。结果：肾康注射液可以显著抑制肾小管上皮细胞LLCPK1分泌CoⅣ的含量，并呈剂量依赖关系；肾康注射液作用明显优于同等含量的单味大黄注射液。结论：肾康注射液抑制肾小管上皮细胞LLCPK1分泌CoⅣ含量，是该中药复方延缓慢性肾功能衰竭进展的机制之一。
, http://www.100md.com
中图分类号：R334.1 文献标识码：A 文章编号：10089691(2000)04020003
The effects of Shenkang injection(肾康注射液) on the collagen Ⅳ of LLCPK1 renal tubular epithelial cells
ZHAO Zongjiang,ZHANG Xinxue,FU Bo
Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029
Abstract:Objective:To study the effects of Shenkang injection(肾康注射液) on the collagenⅣ(CoⅣ) of LLCPK1 renal tubular epithelial cell.Methods:Using enzymelinked immunosorbent assay(ELISA) to observed the effects of Shenkang injection on the CoⅣ of LLCPK1 renal tubular epithelial cells,in contrast group treated with the injection that was extracted from Rheum officinale Baill.Results:CoⅣ of LLCPK1 renal tubular epithelial cell was inhibited by Shenkang injection,and those actions were doesdependent,more remarkable than that of the injection that was extracted from Rheum officinale Baill.Conclusions:The mechanism of delaying chronic renal failure with Shenkang injection is achieved by inhibiting CoⅣ of LLCPK1 renal tubular epithelial cell.
, 百拇医药
Key words:Shenkang injection;renal tubular epithelial cell;LLCPK1；collagenⅣ,traditional Chinese medicine
CLC number:R334.1 Document code:A Artical ID:10089691(2000)04020003
慢性肾功能衰竭(CRF)时，肾小管上皮细胞处于高代谢状态，一方面导致自身损伤，另一方面使其过度合成和分泌细胞外基质(ECM)，尤其是Ⅳ型胶原(CoⅣ)大量增加，直接参与肾间质纤维化的形成，最终导致肾功能的持续恶化。具有化瘀泄浊、益气固本功效的肾康注射液，治疗CRF有较好的临床疗效〔1〕。为探讨其延缓CRF的作用机制，本实验以单味大黄注射液为实验对照组，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了肾康注射液对猪近端肾小管上皮细胞株(LLCPK1细胞)分泌CoⅣ的影响。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料：LLCPK1细胞购自美国ATCC公司。肾康注射液(简称肾康)，每毫升相当生药0.3 g，大黄注射液(简称大黄)，每毫升相当生药0.05 g，均为成都中医药大学附属医院制剂室提供。主要试剂：RPMI1640培养基，普通胰素，胰蛋白酶(美国GIBC公司产品)；HEPES (美国Sigma公司产品)；小牛血清(FCS，天津血液病研究所产品)；明胶(日本和光纯药工业株式会社产品)；邻苯二氨(DAB)，EDTA*2Na(美国Serva公司产品)。兔抗人CoⅣ抗体，辣根过氧化物酶标(HRP)羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司产品)。
1.2 实验方法：
1.2.1 细胞复苏与同步：取冻存于液态氮中的80代LLCPK1细胞，迅速用双手揉搓至冰水状，然后吸入10 ml离心管中，加RPMI1640 5 ml，离心，弃上清液，加10%FCS RPMI1640，平分于2个5 ml 细胞培养瓶中，孵箱孵育72小时，待细胞融合80%以上时，胰酶消化、离心，用计数板计数，按每孔10%FCS RPMI1640、2.5×103个细胞种植于96孔培养板上，4块复板，每板60孔，周围孔加同等剂量生理盐水。孵育24小时，待细胞完全贴壁后，吸出培养液，换RPMI1640液每孔培养，使细胞静止于G0期。
, 百拇医药
1.2.2 分组与加刺激物：将96孔培养板按每行前8复孔各为1组，最后2列12复孔为1组，即空白对照组、LPS对照组、大黄及不同浓度肾康组，共7组。甩去板中残液后，分别施加各种刺激因素，每孔200 μl。各组实验条件见表1。除空白对照组外，其余各组加入相应浓度刺激物后，置37 ℃、5%CO2孵育箱培养。
表1 肾康对体外培养LLCPK1细胞分泌CoⅣ的影响的实验方法 组序
名称
实验方法
Ⅰ组
空白对照组
2%FCS RPMI1640
Ⅱ组
, 百拇医药
LPS对照组
2%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L
Ⅲ组
肾康低浓度组
2%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L+肾康0.5 g/L
Ⅳ组
肾康中浓度1组
2%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L+肾康1.0 g/L
Ⅴ组
肾康中浓度2组
2%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L+肾康2.0 g/L
, 百拇医药
Ⅵ组
大黄组
2%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L+大黄0.7 g/L
Ⅶ组
肾康高浓度组
1%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L+肾康4.0 g/L
1.3 ELISA测定CoⅣ含量〔2〕：分12、24、48和60小时等4个时间点，每个时间点结束时，甩去培养上清，用1%多聚甲醛固定细胞，1%牛血清白蛋白(BSA)封闭非结合区域，加兔抗人CoⅣ抗体(1∶1 000稀释)，用PBSTween20洗，加HRP羊抗兔IgG(1∶1 000稀释)，再用PBSTween20洗，加DAB+H2O2，避光，每孔加入H2SO4 2 mol/L终止，在492 nm处测吸光度(A)值。
, 百拇医药
1.4 统计学方法：数据用均数±标准差(x±s)表示，均采用SDAS统计软件进行统计学处理，组间比较用t检验。
2 结 果
不同时间点肾康对体外培养LLCPK1细胞分泌CoⅣ含量的影响见表2。结果表明，肾康对体外培养LLCPK1细胞分泌CoⅣ的影响在12小时作用不明显，24小时开始起效，60小时不同浓度肾康组显示有良好的量效关系，肾康组明显优于同等剂量大黄组。说明肾康对体外培养LLCPK1细胞分泌CoⅣ有显著抑制作用。
3 讨 论
在既往CRF的研究中，大量的动物实验及临床观察都集中在肾小球病变上，认为是由于肾小球的严重病变所致，而对肾小管、间质病变重视不够。近年来越来越多的资料显示，肾小管、间质病变在CRF中起着十分重要的作用，是决定预后的更为重要的因素〔3〕。肾间质纤维化是各种原因造成的肾小管及间质病变的最终结果，也是导致CRF的主要原因之一。当CRF时，由于长期缺血或滤过的血浆蛋白造成肾小管损伤，细胞功能障碍，受损的肾小管上皮细胞可产生大量细胞因子如转化生长因子β(TGFβ)、血小板衍化生长因子(PDGF)、白介素6(IL6)、IL8和表皮生长因子(EGF)〔4〕。而这些细胞因子可促使成纤维细胞增殖、细胞外基质(ECM)合成增加，尤其是CoⅣ分泌增加，直接导致了肾间质纤维化的形成及CRF进程加速。
, 百拇医药
本实验动态观察了肾康注射液对肾小管上皮细胞产生CoⅣ的影响。结果发现各组肾小管上皮细胞分泌CoⅣ含量随时间而增加，而肾康注射液可以显著抑制CoⅣ的分泌，第12小时作用不明显，24小时开始起效，60小时不同浓度肾康组显示有良好的量效关系，且肾康注射液组作用明显优于同等剂量大黄组，说明肾康注射液药物之间有协同作用，发挥了多种成分、多个靶点作用的优势。这一结果提示，肾康注射液延缓CRF进展的作用机制可能是通过抑制肾小管上皮细胞肥大、缓解细胞高代谢状态、减少细胞因子释放和抑制CoⅣ的分泌而实现的。
表2 肾康对体外培养LLCPK1细胞分泌CoⅣ含量(A值)的影响(
±s) 组别
刺激因素
12小时A值
24小时A值
, 百拇医药
48小时A值
60小时A值
Ⅰ组
0.165 8±0.004 6
0.166 3±0.0053
0.167 0±0.003 3
0.201 0±0.005 4
Ⅱ组
LPS 1 mg/L
0.166 1±0.004 9
0.170 1±0.0039
, 百拇医药
0.187 2±0.010 2
0.202 9±0.004 8
Ⅲ组
LPS 1 mg/L+肾康0.5 g/L
0.163 7±0.003 2
0.148 1±0.0040
0.149 5±0.003 2*
0.174 1±0.003 6*
Ⅳ组
LPS 1 mg/L+肾康1.0 g/L
, 百拇医药
0.158 5±0.003 8
0.140 2±0.0024
0.148 2±0.003 0*
0.159 5±0.005 9**★
Ⅴ组
LPS 1 mg/L+肾康2.0 g/L
0.156 4±0.006 9
0.142 0±0.0049
0.142 7±0.0031*
0.156 1±0.004 7**★☆
, 百拇医药
Ⅵ组
LPS 1 mg/L+大黄0.7 g/L
0.151 5±0.002 2
0.143 8±0.0038
0.142 6±0.012 8*
0.154 2±0.0020**★☆
Ⅶ组
LPS 1 mg/L+肾康4.0 g/L
0.146 0±0.005 3
0.130 9±0.0052
, 百拇医药
0.139 5±0.003 1**★☆※□
0.133 6±0.0045**★☆※□
注：与Ⅱ组比较：P<0.05，P<0.01；与Ⅲ组比较：★P<0.05；与Ⅳ组比较：☆P<0.05；与Ⅴ组比较：※P<0.05；与Ⅵ组比较：□P<0.05 (致谢：本课题在解放军总医院肾脏病重点实验室完成，并得到了叶一舟技师、李文歌博士和刘述文主治医师等的悉心指导。在此谨表谢忱。)
基金项目：国家中医药管理局科研基金资助项目
获奖项目：国家中医药管理局科技进步一等奖(92D089)
, 百拇医药 作者简介：赵宗江(1960)，男(汉族)，河北阜平人，博士，讲师。目前为北京中医药大学中西医结合博士后，研究方向为中西医结合中医药防治器官(肝、肾等脏器)纤维化的基础实验研究。已发表论文18篇，参编、主编专著7部。
参考文献：
〔1〕叶传蕙，王安娜，叶学锋，等.中药肾康注射液及栓剂治疗慢性肾功能衰竭临床及实验研究.首届国际中西医结合肾脏病学术会议，杭州，1994.1416.
〔2〕Marui N,Offermann M K,Swerlick R,et al.Vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1) gene transcription and expression are regulated through an antioxidantsensitive mechanism in human vascular endothelial cells.J Clin Invest,1993,92(4):18661874.
, 百拇医药
〔3〕吴燕，杨俊伟.慢性肾脏病进展中小管间质纤维化的发生机理及治疗原则.肾脏病与透析肾移植杂志，1995，4(4):337342.
〔4〕Ong A C M,Fine L G.Tubularderived growth factor and cytokins in the pathogenesis of tubulointerstitial fibrosis:implication for human renal disease progression.Am J Kidney Dis,1994,23(2):205209.
(收稿日期：2000-05-11)
(修回日期：2000-06-19), http://www.100md.com
单位：北京中医药大学，北京 100029
关键词：肾康注射液；肾小管上皮细胞；LLCPK1；Ⅳ型胶原；中医药
中国中西医结合急救杂志000403摘要：目的：探讨肾康注射液对肾小管上皮细胞LLCPK1分泌Ⅳ型胶原(CoⅣ)的影响。方法：用细胞酶联免疫吸附法(ELISA)，以单味大黄注射液为实验对照组，检测肾康注射液对肾小管上皮细胞LLCPK1分泌CoⅣ含量的影响。结果：肾康注射液可以显著抑制肾小管上皮细胞LLCPK1分泌CoⅣ的含量，并呈剂量依赖关系；肾康注射液作用明显优于同等含量的单味大黄注射液。结论：肾康注射液抑制肾小管上皮细胞LLCPK1分泌CoⅣ含量，是该中药复方延缓慢性肾功能衰竭进展的机制之一。
, http://www.100md.com
中图分类号：R334.1 文献标识码：A 文章编号：10089691(2000)04020003
The effects of Shenkang injection(肾康注射液) on the collagen Ⅳ of LLCPK1 renal tubular epithelial cells
ZHAO Zongjiang,ZHANG Xinxue,FU Bo
Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029
Abstract:Objective:To study the effects of Shenkang injection(肾康注射液) on the collagenⅣ(CoⅣ) of LLCPK1 renal tubular epithelial cell.Methods:Using enzymelinked immunosorbent assay(ELISA) to observed the effects of Shenkang injection on the CoⅣ of LLCPK1 renal tubular epithelial cells,in contrast group treated with the injection that was extracted from Rheum officinale Baill.Results:CoⅣ of LLCPK1 renal tubular epithelial cell was inhibited by Shenkang injection,and those actions were doesdependent,more remarkable than that of the injection that was extracted from Rheum officinale Baill.Conclusions:The mechanism of delaying chronic renal failure with Shenkang injection is achieved by inhibiting CoⅣ of LLCPK1 renal tubular epithelial cell.
, 百拇医药
Key words:Shenkang injection;renal tubular epithelial cell;LLCPK1；collagenⅣ,traditional Chinese medicine
CLC number:R334.1 Document code:A Artical ID:10089691(2000)04020003
慢性肾功能衰竭(CRF)时，肾小管上皮细胞处于高代谢状态，一方面导致自身损伤，另一方面使其过度合成和分泌细胞外基质(ECM)，尤其是Ⅳ型胶原(CoⅣ)大量增加，直接参与肾间质纤维化的形成，最终导致肾功能的持续恶化。具有化瘀泄浊、益气固本功效的肾康注射液，治疗CRF有较好的临床疗效〔1〕。为探讨其延缓CRF的作用机制，本实验以单味大黄注射液为实验对照组，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了肾康注射液对猪近端肾小管上皮细胞株(LLCPK1细胞)分泌CoⅣ的影响。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料：LLCPK1细胞购自美国ATCC公司。肾康注射液(简称肾康)，每毫升相当生药0.3 g，大黄注射液(简称大黄)，每毫升相当生药0.05 g，均为成都中医药大学附属医院制剂室提供。主要试剂：RPMI1640培养基，普通胰素，胰蛋白酶(美国GIBC公司产品)；HEPES (美国Sigma公司产品)；小牛血清(FCS，天津血液病研究所产品)；明胶(日本和光纯药工业株式会社产品)；邻苯二氨(DAB)，EDTA*2Na(美国Serva公司产品)。兔抗人CoⅣ抗体，辣根过氧化物酶标(HRP)羊抗兔IgG(北京中山生物技术有限公司产品)。
1.2 实验方法：
1.2.1 细胞复苏与同步：取冻存于液态氮中的80代LLCPK1细胞，迅速用双手揉搓至冰水状，然后吸入10 ml离心管中，加RPMI1640 5 ml，离心，弃上清液，加10%FCS RPMI1640，平分于2个5 ml 细胞培养瓶中，孵箱孵育72小时，待细胞融合80%以上时，胰酶消化、离心，用计数板计数，按每孔10%FCS RPMI1640、2.5×103个细胞种植于96孔培养板上，4块复板，每板60孔，周围孔加同等剂量生理盐水。孵育24小时，待细胞完全贴壁后，吸出培养液，换RPMI1640液每孔培养，使细胞静止于G0期。
, 百拇医药
1.2.2 分组与加刺激物：将96孔培养板按每行前8复孔各为1组，最后2列12复孔为1组，即空白对照组、LPS对照组、大黄及不同浓度肾康组，共7组。甩去板中残液后，分别施加各种刺激因素，每孔200 μl。各组实验条件见表1。除空白对照组外，其余各组加入相应浓度刺激物后，置37 ℃、5%CO2孵育箱培养。
表1 肾康对体外培养LLCPK1细胞分泌CoⅣ的影响的实验方法 组序
名称
实验方法
Ⅰ组
空白对照组
2%FCS RPMI1640
Ⅱ组
, 百拇医药
LPS对照组
2%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L
Ⅲ组
肾康低浓度组
2%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L+肾康0.5 g/L
Ⅳ组
肾康中浓度1组
2%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L+肾康1.0 g/L
Ⅴ组
肾康中浓度2组
2%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L+肾康2.0 g/L
, 百拇医药
Ⅵ组
大黄组
2%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L+大黄0.7 g/L
Ⅶ组
肾康高浓度组
1%FCS RPMI1640+LPS 1 mg/L+肾康4.0 g/L
1.3 ELISA测定CoⅣ含量〔2〕：分12、24、48和60小时等4个时间点，每个时间点结束时，甩去培养上清，用1%多聚甲醛固定细胞，1%牛血清白蛋白(BSA)封闭非结合区域，加兔抗人CoⅣ抗体(1∶1 000稀释)，用PBSTween20洗，加HRP羊抗兔IgG(1∶1 000稀释)，再用PBSTween20洗，加DAB+H2O2，避光，每孔加入H2SO4 2 mol/L终止，在492 nm处测吸光度(A)值。
, 百拇医药
1.4 统计学方法：数据用均数±标准差(x±s)表示，均采用SDAS统计软件进行统计学处理，组间比较用t检验。
2 结 果
不同时间点肾康对体外培养LLCPK1细胞分泌CoⅣ含量的影响见表2。结果表明，肾康对体外培养LLCPK1细胞分泌CoⅣ的影响在12小时作用不明显，24小时开始起效，60小时不同浓度肾康组显示有良好的量效关系，肾康组明显优于同等剂量大黄组。说明肾康对体外培养LLCPK1细胞分泌CoⅣ有显著抑制作用。
3 讨 论
在既往CRF的研究中，大量的动物实验及临床观察都集中在肾小球病变上，认为是由于肾小球的严重病变所致，而对肾小管、间质病变重视不够。近年来越来越多的资料显示，肾小管、间质病变在CRF中起着十分重要的作用，是决定预后的更为重要的因素〔3〕。肾间质纤维化是各种原因造成的肾小管及间质病变的最终结果，也是导致CRF的主要原因之一。当CRF时，由于长期缺血或滤过的血浆蛋白造成肾小管损伤，细胞功能障碍，受损的肾小管上皮细胞可产生大量细胞因子如转化生长因子β(TGFβ)、血小板衍化生长因子(PDGF)、白介素6(IL6)、IL8和表皮生长因子(EGF)〔4〕。而这些细胞因子可促使成纤维细胞增殖、细胞外基质(ECM)合成增加，尤其是CoⅣ分泌增加，直接导致了肾间质纤维化的形成及CRF进程加速。
, 百拇医药
本实验动态观察了肾康注射液对肾小管上皮细胞产生CoⅣ的影响。结果发现各组肾小管上皮细胞分泌CoⅣ含量随时间而增加，而肾康注射液可以显著抑制CoⅣ的分泌，第12小时作用不明显，24小时开始起效，60小时不同浓度肾康组显示有良好的量效关系，且肾康注射液组作用明显优于同等剂量大黄组，说明肾康注射液药物之间有协同作用，发挥了多种成分、多个靶点作用的优势。这一结果提示，肾康注射液延缓CRF进展的作用机制可能是通过抑制肾小管上皮细胞肥大、缓解细胞高代谢状态、减少细胞因子释放和抑制CoⅣ的分泌而实现的。
表2 肾康对体外培养LLCPK1细胞分泌CoⅣ含量(A值)的影响(
±s) 组别刺激因素
12小时A值
24小时A值
, 百拇医药
48小时A值
60小时A值
Ⅰ组
0.165 8±0.004 6
0.166 3±0.0053
0.167 0±0.003 3
0.201 0±0.005 4
Ⅱ组
LPS 1 mg/L
0.166 1±0.004 9
0.170 1±0.0039
, 百拇医药
0.187 2±0.010 2
0.202 9±0.004 8
Ⅲ组
LPS 1 mg/L+肾康0.5 g/L
0.163 7±0.003 2
0.148 1±0.0040
0.149 5±0.003 2*
0.174 1±0.003 6*
Ⅳ组
LPS 1 mg/L+肾康1.0 g/L
, 百拇医药
0.158 5±0.003 8
0.140 2±0.0024
0.148 2±0.003 0*
0.159 5±0.005 9**★
Ⅴ组
LPS 1 mg/L+肾康2.0 g/L
0.156 4±0.006 9
0.142 0±0.0049
0.142 7±0.0031*
0.156 1±0.004 7**★☆
, 百拇医药
Ⅵ组
LPS 1 mg/L+大黄0.7 g/L
0.151 5±0.002 2
0.143 8±0.0038
0.142 6±0.012 8*
0.154 2±0.0020**★☆
Ⅶ组
LPS 1 mg/L+肾康4.0 g/L
0.146 0±0.005 3
0.130 9±0.0052
, 百拇医药
0.139 5±0.003 1**★☆※□
0.133 6±0.0045**★☆※□
注：与Ⅱ组比较：P<0.05，P<0.01；与Ⅲ组比较：★P<0.05；与Ⅳ组比较：☆P<0.05；与Ⅴ组比较：※P<0.05；与Ⅵ组比较：□P<0.05 (致谢：本课题在解放军总医院肾脏病重点实验室完成，并得到了叶一舟技师、李文歌博士和刘述文主治医师等的悉心指导。在此谨表谢忱。)
基金项目：国家中医药管理局科研基金资助项目
获奖项目：国家中医药管理局科技进步一等奖(92D089)
, 百拇医药 作者简介：赵宗江(1960)，男(汉族)，河北阜平人，博士，讲师。目前为北京中医药大学中西医结合博士后，研究方向为中西医结合中医药防治器官(肝、肾等脏器)纤维化的基础实验研究。已发表论文18篇，参编、主编专著7部。
参考文献：
〔1〕叶传蕙，王安娜，叶学锋，等.中药肾康注射液及栓剂治疗慢性肾功能衰竭临床及实验研究.首届国际中西医结合肾脏病学术会议，杭州，1994.1416.
〔2〕Marui N,Offermann M K,Swerlick R,et al.Vascular cell adhesion molecule1 (VCAM1) gene transcription and expression are regulated through an antioxidantsensitive mechanism in human vascular endothelial cells.J Clin Invest,1993,92(4):18661874.
, 百拇医药
〔3〕吴燕，杨俊伟.慢性肾脏病进展中小管间质纤维化的发生机理及治疗原则.肾脏病与透析肾移植杂志，1995，4(4):337342.
〔4〕Ong A C M,Fine L G.Tubularderived growth factor and cytokins in the pathogenesis of tubulointerstitial fibrosis:implication for human renal disease progression.Am J Kidney Dis,1994,23(2):205209.
(收稿日期：2000-05-11)
(修回日期：2000-06-19), http://www.100md.com