肾复康对大鼠C-BSA肾炎的药理作用
作者：周玖瑶 廖雪珍 李锐
单位：广州中医药大学药理教研室 ，广州 510405
关键词：@肾复康/药理学；肾小球肾炎/中药疗法；雷公藤/治疗应用；疾病模型，动物；大鼠
广州中医药大学学报000417摘要：肾复康为本校第一附属医院治疗肾小球肾炎的临床有效方剂，由雷公藤、黄芪、三七、益母草等药组成。通过参考Border方法复制了阳离子化小牛血清白蛋白(C-BSA)致膜性肾小球肾炎大鼠模型，并观察了肾复康对该模型的药理作用。结果表明，肾复康可消除C-BSA肾炎模型大鼠尿蛋白，升高C-BSA肾炎模型大鼠血清总蛋白、白蛋白含量及白蛋白/球蛋白(A/G)比值，降低C-BSA肾炎模型大鼠胆固醇含量、血清肌酐和尿素氮含量，对肾功能具有保护作用。肾复康能抑制C-BSA肾炎模型大鼠血浆的血栓素B2(TXB2)含量的升高和6-酮基-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)含量的降低。肾复康小鼠灌胃半数致死量(LD50)为(174.34±36.74)g/kg，与雷公藤浸膏雌性小鼠灌胃LD50的(29.73±6.46)g/kg和雄性小鼠灌胃LD50的(101.74±10.93) g/kg 比较，肾复康复方中药对雷公藤具有一定的减毒作用。
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中图分类号：R285.5 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)04-0342-06
Pharmacological Action of Shenfukang on Rat Model with
Nephritis Induced by Cationized Bovine Serum Albumin
ZHOU Jiuyao, LIAO Xuezhen,LI Rui
(Dept. of Pharmacology, Guangzhou University of TCM , Guangzhou 510405,China)
ABSTRACT: Shenfukang is an effective formula for glomerulonephritis applied in the first affiliated hospital of Guangzhou University of TCM. It is composed of Radix Folium seu Flos Tripterygii wilfordii, Radix Astragali seu Hedysari, Radix Notoginseng, Herba Leonuri, etc.. Glomerulonephritis rat model was induced by cationized bovine serum albumin (C-BSA) according to Border's method and was used to observe the pharmacological action of Shenfukang. The results showed that Shenfukang can eliminate urine protein, increase the levels of serum protein, albumin (A), globulin (G) and A/G ratio, and decrease the contents of serum cholesterol, creatinine and urea nitrogen. It can also counteract the increase of plasma TXB2 and the decrease of plasma 6-keto-PGF1α. LD50 of Shenfukang for mice is 174.34±36.74?g/kg which is much larger than that of Tripterygium wilfordii (29.73±6.46?g/kg for female mice and 101.74±10.93?g/kg for male mice). It is indicated that Shenfukang exerts a protective effect on renal function and reduces toxicity of Tripterygium wilfordii.
, 百拇医药
Key words:@SHENFUKANG/pharmacology; GLOMERULONEPHRITIS/TCD therapy;TRIPTERYGIUM WILFORDII/ther. use; DISEASE MODELS，ANIMAL； RATS
在临床实践中，肾小球疾病是一种常见病，也是导致终末期肾病(ESRD)最常见的病因。在我国，导致ESRD的病因中以肾小球疾病为主，占54.4%，其中肾小球肾炎却占48.1%[1，2] 。尿蛋白是慢性肾小球肾炎诊断和疗效判定的主要指标，近年消除尿蛋白仍以激素或免疫抑制剂为主要治疗手段，但对难治性肾病疗效欠佳，缓解率也只在30%左右，且停药后尿蛋白的反跳率高达50%～70%，有的病人还因禁忌症不能应用这些药物[3]。因此，寻求消除肾性尿蛋白并有维护肾功能的药物是一个重要的课题。雷公藤是治疗慢性肾小球肾炎的常用中药，但毒副作用较多[4]。肾复康是我校第一临床医学院洪钦国教授30多年用于治疗肾小球肾炎的经验方，以雷公藤为君药，取其清热解毒、祛风胜湿、活血消肿的功效，配以黄芪健脾益气，三七、益母草活血化瘀，具有疗效高(观察70例，总有效率高达77.1%，其中治愈率达22.9%)、副作用小、复发率低等优点[5]。本课题采用阳离子化小牛血清白蛋白(C-BSA)致膜性肾小球肾炎模型研究肾复康的药效，并初步探讨了其作用机理。另外，还对肾复康进行了急性毒性试验。
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1 材料
1.1 试验药物
肾复康由广州中医药大学中药学院制剂工艺研究室提供(以下简称肾复康)，每克浸膏粉含71.428g生药，批号：980111；单味雷公藤浸膏粉由广州中医药大学中药学院制剂工艺研究室提供，每克浸膏粉含50.0 g生药；雷公藤多苷片：上海医科大学红旗制药厂产品，批号：971001；醋酸泼尼松片：仙居制药股份有限公司产品，批号：9805161。弗氏不完全佐剂来自Sigma公司；小牛血清白蛋白(BSA)来自北京天象人生物工程有限责任公司，PR0025-3。异硫氰酸荧光素IgG(FITC-IgG)来自北京生物制品公司，异硫氰酸荧光素C3(FITC-C3)来自Capple Co.USA;无水乙二胺(EDA)、碳化二亚胺(EDC)均为分析纯试剂。血栓素B2(TXB2)和6-酮基-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)试剂盒，购自天津四方化工有限公司，用放射免疫分析法(TXB2：γ=0.9991，CV=3.8%，6-Keto-PGF1α：γ= 0.9992,CV=2.6%)。其他生化测试试剂来自南京建成生物工程研究所。
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1.2 实验动物
SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供。NIH小鼠由广东省卫生厅实验动物中心提供。
2 方法
2.1 肾复康对C-BSA肾炎大鼠模型的治疗作用
2.1.1 阳离子化小牛血清蛋白(C-BSA)的制备 参考Border方法[6]，用67mL EDA加500mL双蒸水，然后缓慢加入6mol/L盐酸350mL，调pH至4.75，保持溶液在25℃；将5gBSA溶解于25mL双蒸水，再将此溶液缓慢加入EDA溶液，不断搅拌，使液温恒定25℃，加入1.8 g EDC；2h后用pH为4.75 的醋酸缓冲液30mL终止反应，即得等电点提高的C-BSA溶液。用4℃双蒸水透析72h(每3至5h换水)C-BSA溶液，冷冻干燥，得等电点(PI)为8.4以上的C-BSA粉剂，保存于-20℃备用。
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2.1.2 C-BSA肾炎大鼠模型的复制及实验分组 参考Border方法[6]进行模型复制。选取雄性SD大鼠70只，体重150～200g，随机分为7组。除正常对照组10只，不作任何处理，正常饲养外，其余各组大鼠均分别取C-BSA1.0mg与弗氏不完全佐剂0.1mL混均，大鼠皮下多点注射预免疫。每只大鼠预免疫1周后，每只注射C-BSA，先腹腔注射1周，第1天至第7天的剂量依次为1.0mg、1.0mg、1.0mg、1.5mg、1.5mg、2mg、2mg。第2周起，每次在灭菌条件下尾静脉注射2.5mg C-BSA，同时灌胃给药，中药阳性药组给予雷公藤多苷，西药阳性药组给予醋酸泼尼松，肾复康组给予高、中、低剂量的肾复康，正常组与模型组给予等容量20mL/kg的生理盐水。
2.1.3 观察项目 (1)生化指标：分别在给药第14天和第32天收集各大鼠24h尿液，进行尿蛋白定量实验；药后32d，从眼眶静脉取血，检测血清总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白(A/G)、胆固醇及血清肌酐和尿素氮含量。(2)肾组织免疫学、组织化学和超微结构观察：于药后32d活杀大鼠，取肾组织分成3块，第一块取肾皮质，即刻恒温冷冻切片经冰冻切片制成5μm的切片，进行免疫荧光染色，采用直接法，荧光抗体为FITC-IgG、FITC-C3抗体。第二块组织取肾皮质，20%(V/V)甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，制成3μm切片，分别进行HE染色，作光镜观察。第三块组织取肾皮质，2.5%(V/V)戊二醛前固定，1%(m/m)锇酸后固定，Epon618包埋，超薄切片，1%(m/m)醋酸铀染色，进行透射电镜(HITACHI-H600)观察。各组均取最具特征性的两个部位摄象以作对照。
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2.1.4 统计方法 所有结果进行t检验。
2.2 肾复康急性毒性试验
选取NIH小鼠150只，体重为18～22g，肾复康组50只，雌雄各半；雷公藤浸膏组100只，分为雌性组、雄性组各50只(预试时发现雌雄性别对雷公藤的毒性反应有较大差异，故分开给药)。空腹12h，分别随机分为5个等比剂量组，肾复康组和雷公藤雌性组均按40mL/kg的容积，雷公藤雄性组按20mL/kg的容积灌胃给药，给药后连续观察7d，并记录小鼠的一般情况、急性毒性反应及死亡情况。死亡小鼠及7d后颈椎脱臼处死小鼠，解剖并肉眼观察各脏器病理变化。
3 结果
3.1 肾复康对C-BSA肾炎大鼠模型的治疗作用
3.1.1 肾复康对C-BSA致膜性肾炎模型尿蛋白的作用
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结果表明，高、中、低剂量的肾复康在药后14d和32d均显著消除C-BSA肾炎模型大鼠尿蛋白，与模型组比较P<0.01。高、中剂量的肾复康作用与雷公藤多苷组、醋酸泼尼松组相近。见表1。
3.1.2 肾复康对膜性肾炎模型血清生化指标的影响 结果表明，高、中剂量肾复康在药后32d明显升高C-BSA肾炎模型大鼠血清总蛋白和白蛋白含量(P<0.01～0.05)。但对球蛋白、白蛋白/球蛋白(A/G)比值影响不显著(P>0.05)，见表2。高、中低剂量的肾复康显降低C-BSA肾炎模型大鼠胆固醇含量(P<0.01)，降低血清肌酐和尿素氮含量(P<0.01～0.05)，对肾功能具有保护作用，见表3。各项血清生化指标的改善均与雷公藤多苷组、醋酸泼尼松组相似。
3.1.3 肾复康对C-BSA肾炎大鼠血浆的TXB2和6-Keto-PGF1α含量的影响 表4结果表明，高、中剂量的肾复康能显著抑制C-BSA肾炎模型大鼠血浆TXB2含量的升高和6-Keto-PGF1α含量的降低(P<0.01～0.05)。作用与醋酸泼尼松及雷公藤多苷相近。
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3.1.4 肾复康对C-BSA肾炎模型肾组织免疫学、组织化学和超微结构的影响
(1)免疫荧光：免疫32d后，造模各组均可见IgG、C3呈颗粒状沿毛细管沉着，荧光强度多在+～++间。但肾复康治疗组、雷公藤多苷组及醋酸泼尼松组荧光强度明显较模型组弱。
表1 肾复康对C-BSA肾炎模型大鼠尿蛋白影响(
±s) 组 别
N/只
ω/(g.kg-1)
14d尿蛋白
总量(m24h/mg)
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32d尿蛋白
总量(m24h/mg)
正常组
10
-
4.3±0.87
4.1±0.64
模型组
10
-
122.8±14.11##
197.4±11.05##
, 百拇医药
高剂量肾复康
10
1.452
66.1±10.81**
64.2±8.54**
中剂量肾复康
10
0.726
67.2±7.48**
83.2±9.11**
低剂量肾复康
, 百拇医药
10
0.363
88.7±12.48*
115.9±11.37**
雷公藤多苷
10
0.0165
59.4±8.87**
76.4±8.34**
醋酸泼尼松
10
, 百拇医药
0.0055
68.5±9.14**
66.7±10.54**
##与正常组比较P<0.01，#P<0.05；**与模型组比较P<0.01，*P<0.05(下同)表2 肾复康药后32d对C-BSA肾炎模型大鼠血清蛋白影响(±s) 组 别
N/只
ω/(g.kg-1)
ρ总蛋白/(g.L-1)
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ρ白蛋白/(g.L-1)
ρ球蛋白/(g.L-1)
pA/G
正常组
10
-
72.34±1.227
29.24±4.258
43.12±5.041
0.77±0.153
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模型组
10
-
64.83±4.304##
24.25±2.788##
40.53±4.876
0.58±0.508##
高剂量肾复康
10
1.452
68.87±4.351
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28.93±2.789**
42.78±5.640
0.60±0.245
中剂量肾复康
10
0.726
67.84±3.367
26.61±2.878*
41.21±4.135
0.63±0.061
低剂量肾复康
, 百拇医药
10
0.363
69.83±2.451
26.08±3.615
40.91±2.895
0.69±0.086
雷公藤多苷
10
0.0165
67.48±4.374
25.00±3.326
42.49±6.282
, 百拇医药
0.59±0.270
醋酸泼尼松
10
0.0055
68.31±3.227
28.44±3.124**
39.87±3.368
0.70±0.128*
(2)光镜检查：模型大鼠肾小球肿大，球囊腔变窄，肾小球基底膜不规则变厚，血栓形成。高、中剂量肾复康治疗组、雷公藤多苷组及醋酸泼尼松组病理变化明显较模型组轻。
(3)电镜检查：造模各组肾小球基底膜内皮下电子致密物沉积，足突融合，肾小球基底膜不规则增厚。高、中剂量肾复康治疗组、雷公藤多苷组及醋酸泼尼松组病理变化较模型组明显减轻。见图1。
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表3 肾复康药后32d对C-BSA肾炎模型大鼠血清生化指标影响 (±s) 组 别
N/只
ω/(g.kg-1)
c胆固醇/(mmol.L-1)
c血清肌酐/(μmol.L-1)
c血清尿素氮/(mmol.L-1)
正常组
, 百拇医药
10
-
1.40±0.127
12.91±2.663
5.28±0.861
模型组
10
-
1.71±0.169##
34.93±9.565##
18.34±2.598##
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高剂量肾复康
10
1.452
1.30±0.171**
25.21±7.022
9.07±1.157**
中剂量肾复康
10
0.726
1.32±0.176**
25.00±3.356*
, 百拇医药
8.12±1.078**
低剂量肾复康
10
0.363
1.12±0.142**
26.81±6.491
9.59±0.547**
雷公藤多苷
10
0.0165
1.28±0.145**
, 百拇医药
24.23±3.234
9.09±2.372**
醋酸泼尼松
10
0.0055
1.29±0.213**
24.42±3.276*
8.40±0.772**
表4 肾复康对C-BSA肾炎模型大鼠血浆的TXB2和6-Keto-PGF1α含量的影响 (±s) 组 别
, 百拇医药
N/只
ω/(g.kg-1)
ρTXB2/(pg.mL-1)
ρ6-Keto-PGF1α/(pg.mL-1)
正常组
10
-
301.23±52.811
50.64±16.014
, 百拇医药
模型组
10
-
672.05±148.305##
32.84±6.941##
高剂量肾复康
10
1.452
537.88±96.836*
48.09±8.024**
中剂量肾复康
, 百拇医药
10
0.726
435.48±82.038**
43.47±10.710*
低剂量肾复康
10
0.363
677.42±87.161
40.20±12.134
雷公藤多苷
10
0.0165
, 百拇医药
492.45±103.776**
49.06±8.976**
醋酸泼尼松
10
0.0055
436.90±161.153**
45.39±11.200**
3.2 肾复康急性毒性试验
肾复康给药组药后0.5h，小鼠自发活动明显减少，俯伏少动，反应迟钝，部分小鼠发生腹泻，死亡多发生在1～3h，死前可见肌肉瘫软、呼吸短促、抽搐等表现。尸检小鼠，心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等脏器，除少数见胃肠轻度充血外，未见表面及切面异常。根据各剂量组小鼠死亡情况，按改良寇氏法计算，肾复康的小鼠半数致死量(LD50)为(174.34±36.74)g/kg(肾复康中雷公藤生药含量)。雷公藤浸膏组，药后几小时小鼠自发活动无明显变化，死亡多发生在1～3d，死前可见俯伏少动，反应迟钝，步履不稳，共济失调、肌肉瘫软、呼吸短促、抽搐等表现，尸检小鼠，心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等脏器，除部分见心肌轻度充血外，未见表面及切面异常。根据各剂量组小鼠死亡情况，按改良寇氏法计算，雷公藤浸膏雌性小鼠LD50的雷公藤生药含量为(29.73±6.46)g/kg，雷公藤浸膏雄性小鼠LD50为(101.74±10.93)g/kg。说明肾复康复方中药对雷公藤具有一定的减毒作用。
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4 讨论
用阳离子化小牛血清白蛋白复制的膜性肾小球肾炎动物模型，其免疫发病机理和人类肾小球肾炎非常近似，是一种较理想的慢性肾小球肾炎病理模型。本研究以大鼠为实验动物，用C-BSA复制慢性血清病模型，并产生膜性肾炎病变。静脉注射C-BSA后，病理组大鼠出现大量尿蛋白，IgG沿肾小球毛细血管壁呈颗粒状沉积，毛细血管壁增厚，钉突形成，大量上皮下电子致密沉积物，这些病变特点与Border等报道的家兔肾炎模型的特点类似。据文献报道，膜性肾炎按中医辨证多属肾阳虚型[7]，其主要临床表现为阳虚。本实验模型具有膜性肾炎典型的临床表现(大量尿蛋白)，肾组织又可见膜性肾炎典型的病理改变，说明此病理模型与阳虚证相类似。随膜性肾炎持续发展，其阳虚程度日益加重，至后期肾功能衰竭阶段，表现为脾肾衰弱，阳气不足，并易产生湿浊、瘀阻等病理。本研究结果表明，肾复康能显著减轻C-BSA肾炎模型大鼠的尿蛋白，抑制C-BSA肾炎模型大鼠的血清白蛋白和总蛋白的降低及血清胆固醇、肌酐及血清尿素氮的升高，同时改善肾小球组织的病理变化。提示肾复康对C-BSA肾炎模型大鼠有较好的治疗作用，其疗效和机理与醋酸泼尼松及雷公藤多苷相近。但临床应用表明，与雷公藤多苷比较，本组方有一定优势，特别是减轻毒副作用方面更为明显，对肝功能、胃肠道以及女性月经等几乎没有什么影响[5]。这与急性毒性结果相吻合，即肾复康LD50雷公藤生药含量为(174.34±36.74)g/kg，与雷公藤雌性小鼠LD50的(101.74±10.93g/kg)和雄性小鼠LD50的(29.73±6.46g/kg)比较，肾复康复方中药对雷公藤具有一定的减毒作用，为临床治疗慢性肾小球肾炎长期应用提供了可能。
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目前认为肾小球肾炎发病机理中，血小板及其所释放的炎症介质有重要的致病作用，参与肾炎的发生和发展。通过抗血小板聚集的方法来治疗肾炎动物模型已取得了明显的疗效。血小板为炎症细胞释放多种炎症介质，如阴离子物质，结合在GBM上，破坏GBM阴离子屏障。血小板具有的多种蛋白质因子及分解酶，血小板释放因子(PF4)、血小板激活因子(PAF)、TXB2等均可使GBM阴离子成分变性或改变，使GBM通透性增加。PGI2和TXA2对血小板及血管功能的调节具有重要的意义。正常情况下，两者保持动态平衡对维持血管的正常功能、调节血流量具有重要的意义，病理状态下两者平衡失调是造成血小板聚集、血栓形式及血管痉挛的重要原因。TXA2生物半衰期约30s，迅速代谢成无活性的TXB2；PGI2生物半衰期约3min，代谢成6-keto-PGF1α。由于PGI2和TXA2性质不稳定，难以直接测定，故国内外均以测定6-keto-PGF1α和TXB2作为判断PGI2和TXA2浓度的指标。实验动物造成膜性肾小球肾炎后，血浆6-keto-PGF1α降低和TXB2升高。这可能是膜性肾小球肾炎致血管内皮细胞合成PGI2减少，而血小板的粘附及聚集更加明显，产生大量TXA2，进一步引起血小板的聚集，加重了膜性肾小球肾炎[8]。肾复康高、中、低剂量，雷公藤多苷及醋酸泼尼松均能显著减轻C-BSA肾炎模型大鼠的6-keto-PGF1α降低和TXB2升高。此外，我们还在另外一个实验中观察到肾复康能抑制Heymann肾炎模型大鼠血清和肾组织匀浆过氧化脂质(LPO)的生成，减少LPO对细胞结构及功能的严重损害，表现为血清和肾组织中的LPO含量降低，增强超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性，可保护细胞和细胞膜，缓解炎症。这些可能是其治疗肾小球肾炎的机理之一。
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基金项目：国家中医药管理局重点课题(编号：95B133)，广东省中医药管理局课题(编号：B98027)
作者简介：周玖瑶(1970-)，男，医学硕士，讲师；
参考文献：
[1] Hricik D E,Chung_park M,Sedor J R.Glomerulonephritis[J].N Engl J Med,1998,339:888
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[4] 李瑞林，舒达夫.雷公藤的研究与临床应用[M].北京：中国科技出版社，1989.360
, 百拇医药
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[7] 施赛珠，张玲娟.慢性肾炎的中医辨证分型与肾活检病理关系的初步探讨[J].中国中西医结合杂志，1984，4(7)：414
[8] Lidenos E A,Andres G A,Dum M J.Glomerular prostaglandin and thromboxane synthesis in rat nephritic serum nephritis[J].J Clin Invest,1983,172:1439
收稿日期：2000-08-30, http://www.100md.com
单位：广州中医药大学药理教研室 ，广州 510405
关键词：@肾复康/药理学；肾小球肾炎/中药疗法；雷公藤/治疗应用；疾病模型，动物；大鼠
广州中医药大学学报000417摘要：肾复康为本校第一附属医院治疗肾小球肾炎的临床有效方剂，由雷公藤、黄芪、三七、益母草等药组成。通过参考Border方法复制了阳离子化小牛血清白蛋白(C-BSA)致膜性肾小球肾炎大鼠模型，并观察了肾复康对该模型的药理作用。结果表明，肾复康可消除C-BSA肾炎模型大鼠尿蛋白，升高C-BSA肾炎模型大鼠血清总蛋白、白蛋白含量及白蛋白/球蛋白(A/G)比值，降低C-BSA肾炎模型大鼠胆固醇含量、血清肌酐和尿素氮含量，对肾功能具有保护作用。肾复康能抑制C-BSA肾炎模型大鼠血浆的血栓素B2(TXB2)含量的升高和6-酮基-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)含量的降低。肾复康小鼠灌胃半数致死量(LD50)为(174.34±36.74)g/kg，与雷公藤浸膏雌性小鼠灌胃LD50的(29.73±6.46)g/kg和雄性小鼠灌胃LD50的(101.74±10.93) g/kg 比较，肾复康复方中药对雷公藤具有一定的减毒作用。
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中图分类号：R285.5 文献标识码：A
文章编号：1007-3213(2000)04-0342-06
Pharmacological Action of Shenfukang on Rat Model with
Nephritis Induced by Cationized Bovine Serum Albumin
ZHOU Jiuyao, LIAO Xuezhen,LI Rui
(Dept. of Pharmacology, Guangzhou University of TCM , Guangzhou 510405,China)
ABSTRACT: Shenfukang is an effective formula for glomerulonephritis applied in the first affiliated hospital of Guangzhou University of TCM. It is composed of Radix Folium seu Flos Tripterygii wilfordii, Radix Astragali seu Hedysari, Radix Notoginseng, Herba Leonuri, etc.. Glomerulonephritis rat model was induced by cationized bovine serum albumin (C-BSA) according to Border's method and was used to observe the pharmacological action of Shenfukang. The results showed that Shenfukang can eliminate urine protein, increase the levels of serum protein, albumin (A), globulin (G) and A/G ratio, and decrease the contents of serum cholesterol, creatinine and urea nitrogen. It can also counteract the increase of plasma TXB2 and the decrease of plasma 6-keto-PGF1α. LD50 of Shenfukang for mice is 174.34±36.74?g/kg which is much larger than that of Tripterygium wilfordii (29.73±6.46?g/kg for female mice and 101.74±10.93?g/kg for male mice). It is indicated that Shenfukang exerts a protective effect on renal function and reduces toxicity of Tripterygium wilfordii.
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Key words:@SHENFUKANG/pharmacology; GLOMERULONEPHRITIS/TCD therapy;TRIPTERYGIUM WILFORDII/ther. use; DISEASE MODELS，ANIMAL； RATS
在临床实践中，肾小球疾病是一种常见病，也是导致终末期肾病(ESRD)最常见的病因。在我国，导致ESRD的病因中以肾小球疾病为主，占54.4%，其中肾小球肾炎却占48.1%[1，2] 。尿蛋白是慢性肾小球肾炎诊断和疗效判定的主要指标，近年消除尿蛋白仍以激素或免疫抑制剂为主要治疗手段，但对难治性肾病疗效欠佳，缓解率也只在30%左右，且停药后尿蛋白的反跳率高达50%～70%，有的病人还因禁忌症不能应用这些药物[3]。因此，寻求消除肾性尿蛋白并有维护肾功能的药物是一个重要的课题。雷公藤是治疗慢性肾小球肾炎的常用中药，但毒副作用较多[4]。肾复康是我校第一临床医学院洪钦国教授30多年用于治疗肾小球肾炎的经验方，以雷公藤为君药，取其清热解毒、祛风胜湿、活血消肿的功效，配以黄芪健脾益气，三七、益母草活血化瘀，具有疗效高(观察70例，总有效率高达77.1%，其中治愈率达22.9%)、副作用小、复发率低等优点[5]。本课题采用阳离子化小牛血清白蛋白(C-BSA)致膜性肾小球肾炎模型研究肾复康的药效，并初步探讨了其作用机理。另外，还对肾复康进行了急性毒性试验。
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1 材料
1.1 试验药物
肾复康由广州中医药大学中药学院制剂工艺研究室提供(以下简称肾复康)，每克浸膏粉含71.428g生药，批号：980111；单味雷公藤浸膏粉由广州中医药大学中药学院制剂工艺研究室提供，每克浸膏粉含50.0 g生药；雷公藤多苷片：上海医科大学红旗制药厂产品，批号：971001；醋酸泼尼松片：仙居制药股份有限公司产品，批号：9805161。弗氏不完全佐剂来自Sigma公司；小牛血清白蛋白(BSA)来自北京天象人生物工程有限责任公司，PR0025-3。异硫氰酸荧光素IgG(FITC-IgG)来自北京生物制品公司，异硫氰酸荧光素C3(FITC-C3)来自Capple Co.USA;无水乙二胺(EDA)、碳化二亚胺(EDC)均为分析纯试剂。血栓素B2(TXB2)和6-酮基-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)试剂盒，购自天津四方化工有限公司，用放射免疫分析法(TXB2：γ=0.9991，CV=3.8%，6-Keto-PGF1α：γ= 0.9992,CV=2.6%)。其他生化测试试剂来自南京建成生物工程研究所。
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1.2 实验动物
SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供。NIH小鼠由广东省卫生厅实验动物中心提供。
2 方法
2.1 肾复康对C-BSA肾炎大鼠模型的治疗作用
2.1.1 阳离子化小牛血清蛋白(C-BSA)的制备 参考Border方法[6]，用67mL EDA加500mL双蒸水，然后缓慢加入6mol/L盐酸350mL，调pH至4.75，保持溶液在25℃；将5gBSA溶解于25mL双蒸水，再将此溶液缓慢加入EDA溶液，不断搅拌，使液温恒定25℃，加入1.8 g EDC；2h后用pH为4.75 的醋酸缓冲液30mL终止反应，即得等电点提高的C-BSA溶液。用4℃双蒸水透析72h(每3至5h换水)C-BSA溶液，冷冻干燥，得等电点(PI)为8.4以上的C-BSA粉剂，保存于-20℃备用。
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2.1.2 C-BSA肾炎大鼠模型的复制及实验分组 参考Border方法[6]进行模型复制。选取雄性SD大鼠70只，体重150～200g，随机分为7组。除正常对照组10只，不作任何处理，正常饲养外，其余各组大鼠均分别取C-BSA1.0mg与弗氏不完全佐剂0.1mL混均，大鼠皮下多点注射预免疫。每只大鼠预免疫1周后，每只注射C-BSA，先腹腔注射1周，第1天至第7天的剂量依次为1.0mg、1.0mg、1.0mg、1.5mg、1.5mg、2mg、2mg。第2周起，每次在灭菌条件下尾静脉注射2.5mg C-BSA，同时灌胃给药，中药阳性药组给予雷公藤多苷，西药阳性药组给予醋酸泼尼松，肾复康组给予高、中、低剂量的肾复康，正常组与模型组给予等容量20mL/kg的生理盐水。
2.1.3 观察项目 (1)生化指标：分别在给药第14天和第32天收集各大鼠24h尿液，进行尿蛋白定量实验；药后32d，从眼眶静脉取血，检测血清总蛋白、白蛋白、白蛋白/球蛋白(A/G)、胆固醇及血清肌酐和尿素氮含量。(2)肾组织免疫学、组织化学和超微结构观察：于药后32d活杀大鼠，取肾组织分成3块，第一块取肾皮质，即刻恒温冷冻切片经冰冻切片制成5μm的切片，进行免疫荧光染色，采用直接法，荧光抗体为FITC-IgG、FITC-C3抗体。第二块组织取肾皮质，20%(V/V)甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，制成3μm切片，分别进行HE染色，作光镜观察。第三块组织取肾皮质，2.5%(V/V)戊二醛前固定，1%(m/m)锇酸后固定，Epon618包埋，超薄切片，1%(m/m)醋酸铀染色，进行透射电镜(HITACHI-H600)观察。各组均取最具特征性的两个部位摄象以作对照。
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2.1.4 统计方法 所有结果进行t检验。
2.2 肾复康急性毒性试验
选取NIH小鼠150只，体重为18～22g，肾复康组50只，雌雄各半；雷公藤浸膏组100只，分为雌性组、雄性组各50只(预试时发现雌雄性别对雷公藤的毒性反应有较大差异，故分开给药)。空腹12h，分别随机分为5个等比剂量组，肾复康组和雷公藤雌性组均按40mL/kg的容积，雷公藤雄性组按20mL/kg的容积灌胃给药，给药后连续观察7d，并记录小鼠的一般情况、急性毒性反应及死亡情况。死亡小鼠及7d后颈椎脱臼处死小鼠，解剖并肉眼观察各脏器病理变化。
3 结果
3.1 肾复康对C-BSA肾炎大鼠模型的治疗作用
3.1.1 肾复康对C-BSA致膜性肾炎模型尿蛋白的作用
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结果表明，高、中、低剂量的肾复康在药后14d和32d均显著消除C-BSA肾炎模型大鼠尿蛋白，与模型组比较P<0.01。高、中剂量的肾复康作用与雷公藤多苷组、醋酸泼尼松组相近。见表1。
3.1.2 肾复康对膜性肾炎模型血清生化指标的影响 结果表明，高、中剂量肾复康在药后32d明显升高C-BSA肾炎模型大鼠血清总蛋白和白蛋白含量(P<0.01～0.05)。但对球蛋白、白蛋白/球蛋白(A/G)比值影响不显著(P>0.05)，见表2。高、中低剂量的肾复康显降低C-BSA肾炎模型大鼠胆固醇含量(P<0.01)，降低血清肌酐和尿素氮含量(P<0.01～0.05)，对肾功能具有保护作用，见表3。各项血清生化指标的改善均与雷公藤多苷组、醋酸泼尼松组相似。
3.1.3 肾复康对C-BSA肾炎大鼠血浆的TXB2和6-Keto-PGF1α含量的影响 表4结果表明，高、中剂量的肾复康能显著抑制C-BSA肾炎模型大鼠血浆TXB2含量的升高和6-Keto-PGF1α含量的降低(P<0.01～0.05)。作用与醋酸泼尼松及雷公藤多苷相近。
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3.1.4 肾复康对C-BSA肾炎模型肾组织免疫学、组织化学和超微结构的影响
(1)免疫荧光：免疫32d后，造模各组均可见IgG、C3呈颗粒状沿毛细管沉着，荧光强度多在+～++间。但肾复康治疗组、雷公藤多苷组及醋酸泼尼松组荧光强度明显较模型组弱。
表1 肾复康对C-BSA肾炎模型大鼠尿蛋白影响(
±s) 组 别N/只
ω/(g.kg-1)
14d尿蛋白
总量(m24h/mg)
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32d尿蛋白
总量(m24h/mg)
正常组
10
-
4.3±0.87
4.1±0.64
模型组
10
-
122.8±14.11##
197.4±11.05##
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高剂量肾复康
10
1.452
66.1±10.81**
64.2±8.54**
中剂量肾复康
10
0.726
67.2±7.48**
83.2±9.11**
低剂量肾复康
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10
0.363
88.7±12.48*
115.9±11.37**
雷公藤多苷
10
0.0165
59.4±8.87**
76.4±8.34**
醋酸泼尼松
10
, 百拇医药
0.0055
68.5±9.14**
66.7±10.54**
##与正常组比较P<0.01，#P<0.05；**与模型组比较P<0.01，*P<0.05(下同)表2 肾复康药后32d对C-BSA肾炎模型大鼠血清蛋白影响(
±s) 组 别N/只
ω/(g.kg-1)
ρ总蛋白/(g.L-1)
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ρ白蛋白/(g.L-1)
ρ球蛋白/(g.L-1)
pA/G
正常组
10
-
72.34±1.227
29.24±4.258
43.12±5.041
0.77±0.153
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模型组
10
-
64.83±4.304##
24.25±2.788##
40.53±4.876
0.58±0.508##
高剂量肾复康
10
1.452
68.87±4.351
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28.93±2.789**
42.78±5.640
0.60±0.245
中剂量肾复康
10
0.726
67.84±3.367
26.61±2.878*
41.21±4.135
0.63±0.061
低剂量肾复康
, 百拇医药
10
0.363
69.83±2.451
26.08±3.615
40.91±2.895
0.69±0.086
雷公藤多苷
10
0.0165
67.48±4.374
25.00±3.326
42.49±6.282
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0.59±0.270
醋酸泼尼松
10
0.0055
68.31±3.227
28.44±3.124**
39.87±3.368
0.70±0.128*
(2)光镜检查：模型大鼠肾小球肿大，球囊腔变窄，肾小球基底膜不规则变厚，血栓形成。高、中剂量肾复康治疗组、雷公藤多苷组及醋酸泼尼松组病理变化明显较模型组轻。
(3)电镜检查：造模各组肾小球基底膜内皮下电子致密物沉积，足突融合，肾小球基底膜不规则增厚。高、中剂量肾复康治疗组、雷公藤多苷组及醋酸泼尼松组病理变化较模型组明显减轻。见图1。
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表3 肾复康药后32d对C-BSA肾炎模型大鼠血清生化指标影响 (
±s) 组 别N/只
ω/(g.kg-1)
c胆固醇/(mmol.L-1)
c血清肌酐/(μmol.L-1)
c血清尿素氮/(mmol.L-1)
正常组
, 百拇医药
10
-
1.40±0.127
12.91±2.663
5.28±0.861
模型组
10
-
1.71±0.169##
34.93±9.565##
18.34±2.598##
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高剂量肾复康
10
1.452
1.30±0.171**
25.21±7.022
9.07±1.157**
中剂量肾复康
10
0.726
1.32±0.176**
25.00±3.356*
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8.12±1.078**
低剂量肾复康
10
0.363
1.12±0.142**
26.81±6.491
9.59±0.547**
雷公藤多苷
10
0.0165
1.28±0.145**
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24.23±3.234
9.09±2.372**
醋酸泼尼松
10
0.0055
1.29±0.213**
24.42±3.276*
8.40±0.772**
表4 肾复康对C-BSA肾炎模型大鼠血浆的TXB2和6-Keto-PGF1α含量的影响 (
±s) 组 别, 百拇医药
N/只
ω/(g.kg-1)
ρTXB2/(pg.mL-1)
ρ6-Keto-PGF1α/(pg.mL-1)
正常组
10
-
301.23±52.811
50.64±16.014
, 百拇医药
模型组
10
-
672.05±148.305##
32.84±6.941##
高剂量肾复康
10
1.452
537.88±96.836*
48.09±8.024**
中剂量肾复康
, 百拇医药
10
0.726
435.48±82.038**
43.47±10.710*
低剂量肾复康
10
0.363
677.42±87.161
40.20±12.134
雷公藤多苷
10
0.0165
, 百拇医药
492.45±103.776**
49.06±8.976**
醋酸泼尼松
10
0.0055
436.90±161.153**
45.39±11.200**
3.2 肾复康急性毒性试验
肾复康给药组药后0.5h，小鼠自发活动明显减少，俯伏少动，反应迟钝，部分小鼠发生腹泻，死亡多发生在1～3h，死前可见肌肉瘫软、呼吸短促、抽搐等表现。尸检小鼠，心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等脏器，除少数见胃肠轻度充血外，未见表面及切面异常。根据各剂量组小鼠死亡情况，按改良寇氏法计算，肾复康的小鼠半数致死量(LD50)为(174.34±36.74)g/kg(肾复康中雷公藤生药含量)。雷公藤浸膏组，药后几小时小鼠自发活动无明显变化，死亡多发生在1～3d，死前可见俯伏少动，反应迟钝，步履不稳，共济失调、肌肉瘫软、呼吸短促、抽搐等表现，尸检小鼠，心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等脏器，除部分见心肌轻度充血外，未见表面及切面异常。根据各剂量组小鼠死亡情况，按改良寇氏法计算，雷公藤浸膏雌性小鼠LD50的雷公藤生药含量为(29.73±6.46)g/kg，雷公藤浸膏雄性小鼠LD50为(101.74±10.93)g/kg。说明肾复康复方中药对雷公藤具有一定的减毒作用。
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4 讨论
用阳离子化小牛血清白蛋白复制的膜性肾小球肾炎动物模型，其免疫发病机理和人类肾小球肾炎非常近似，是一种较理想的慢性肾小球肾炎病理模型。本研究以大鼠为实验动物，用C-BSA复制慢性血清病模型，并产生膜性肾炎病变。静脉注射C-BSA后，病理组大鼠出现大量尿蛋白，IgG沿肾小球毛细血管壁呈颗粒状沉积，毛细血管壁增厚，钉突形成，大量上皮下电子致密沉积物，这些病变特点与Border等报道的家兔肾炎模型的特点类似。据文献报道，膜性肾炎按中医辨证多属肾阳虚型[7]，其主要临床表现为阳虚。本实验模型具有膜性肾炎典型的临床表现(大量尿蛋白)，肾组织又可见膜性肾炎典型的病理改变，说明此病理模型与阳虚证相类似。随膜性肾炎持续发展，其阳虚程度日益加重，至后期肾功能衰竭阶段，表现为脾肾衰弱，阳气不足，并易产生湿浊、瘀阻等病理。本研究结果表明，肾复康能显著减轻C-BSA肾炎模型大鼠的尿蛋白，抑制C-BSA肾炎模型大鼠的血清白蛋白和总蛋白的降低及血清胆固醇、肌酐及血清尿素氮的升高，同时改善肾小球组织的病理变化。提示肾复康对C-BSA肾炎模型大鼠有较好的治疗作用，其疗效和机理与醋酸泼尼松及雷公藤多苷相近。但临床应用表明，与雷公藤多苷比较，本组方有一定优势，特别是减轻毒副作用方面更为明显，对肝功能、胃肠道以及女性月经等几乎没有什么影响[5]。这与急性毒性结果相吻合，即肾复康LD50雷公藤生药含量为(174.34±36.74)g/kg，与雷公藤雌性小鼠LD50的(101.74±10.93g/kg)和雄性小鼠LD50的(29.73±6.46g/kg)比较，肾复康复方中药对雷公藤具有一定的减毒作用，为临床治疗慢性肾小球肾炎长期应用提供了可能。
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目前认为肾小球肾炎发病机理中，血小板及其所释放的炎症介质有重要的致病作用，参与肾炎的发生和发展。通过抗血小板聚集的方法来治疗肾炎动物模型已取得了明显的疗效。血小板为炎症细胞释放多种炎症介质，如阴离子物质，结合在GBM上，破坏GBM阴离子屏障。血小板具有的多种蛋白质因子及分解酶，血小板释放因子(PF4)、血小板激活因子(PAF)、TXB2等均可使GBM阴离子成分变性或改变，使GBM通透性增加。PGI2和TXA2对血小板及血管功能的调节具有重要的意义。正常情况下，两者保持动态平衡对维持血管的正常功能、调节血流量具有重要的意义，病理状态下两者平衡失调是造成血小板聚集、血栓形式及血管痉挛的重要原因。TXA2生物半衰期约30s，迅速代谢成无活性的TXB2；PGI2生物半衰期约3min，代谢成6-keto-PGF1α。由于PGI2和TXA2性质不稳定，难以直接测定，故国内外均以测定6-keto-PGF1α和TXB2作为判断PGI2和TXA2浓度的指标。实验动物造成膜性肾小球肾炎后，血浆6-keto-PGF1α降低和TXB2升高。这可能是膜性肾小球肾炎致血管内皮细胞合成PGI2减少，而血小板的粘附及聚集更加明显，产生大量TXA2，进一步引起血小板的聚集，加重了膜性肾小球肾炎[8]。肾复康高、中、低剂量，雷公藤多苷及醋酸泼尼松均能显著减轻C-BSA肾炎模型大鼠的6-keto-PGF1α降低和TXB2升高。此外，我们还在另外一个实验中观察到肾复康能抑制Heymann肾炎模型大鼠血清和肾组织匀浆过氧化脂质(LPO)的生成，减少LPO对细胞结构及功能的严重损害，表现为血清和肾组织中的LPO含量降低，增强超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性，可保护细胞和细胞膜，缓解炎症。这些可能是其治疗肾小球肾炎的机理之一。
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基金项目：国家中医药管理局重点课题(编号：95B133)，广东省中医药管理局课题(编号：B98027)
作者简介：周玖瑶(1970-)，男，医学硕士，讲师；
参考文献：
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收稿日期：2000-08-30, http://www.100md.com