中药总蒽醌粗提物对低密度脂蛋白氧化的抑制作用
作者：程向缨 王拥军 温玫 于凯 杨静芳 董秀敏 武剑
单位：
关键词：中药；蒽醌；低密度脂蛋白；氧化
中国老年学杂志000524摘 要 目的 从单味中药大黄、虎杖、何首乌中提取总蒽醌类化合物，观察其对低密度脂蛋白氧化修饰的抑制作用。方法 以95%乙醇提取并加用碱提取酸沉淀法提取蒽醌类成分，观察其对Cu2+诱导的LDL氧化的抑制作用，以硫代巴比妥酸反应物质法(TBARS)测定丙二醛(MDA)含量，计算药物对氧化的抑制率以及抑制率为50%时所需药物浓度(IR50)。结果 总蒽醌类提取物使氧化动力曲线迟滞相延长，峰值降低，抑制过氧化脂质生成并有浓度依赖性，各种药物的IR50分别为8.18 μg/ml(大黄)、15.58 μg/ml(虎杖)、3.06×109 μg/ml(何首乌)。结论 三种药物蒽醌类提取物均有抑制LDL氧化作用，但抑制作用强度不同。
, 百拇医药
Inhibition of low density lipoprotein oxidation by anthroquinone extracted from Chinese herbal medicine
Cheng Xiangying,Wang Yongjun,Wen Mei et al
(Department of Neurology,Xuanwu Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100053)
Abstract：Objective Independently extracted the anthroquinone mixture from herbal medicine Rheum palmatum L,Polygonum cuspidatum Sieb et Zuu and Polygonum multiflorum Thunb were examined.Methods Extract the anthroquinone constituent with 95% ethanolic solution. The extracts solved in alkaline solutions and then deposit from acidic solution. The oxidative low density lipoprotein(ox-LDL) was induced by Cu2+ and oxidation degree was assessed by measuring thiobarbituric acid-reactive substances(TBARS). The inhibition rate and IR50 was assessed by bivariate correlation and linear regression with SPSS.Results The extracts could delay the lag phase in the kinetics process of LDL oxidation. The formation of TBARS was inhibited.IR50 was 8.18 μg/ml、15.58 μg/ml、3.06×109 μg/ml respectively.Conclusions All the extracts can inhibited the LDL oxidation. The antioxidative activity of the three extracts were different,Rheum palmatum L seems to be the most powerful one.
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Key words Herbal medicine Anthroquinone Low density lipoprotein Oxidation
低密度脂蛋白(LDL)的氧化修饰对动脉粥样硬化(AS)的发生和发展有着重要意义〔1〕，抑制LDL氧化修饰的药物研究具有良好前景，药物丙丁酚(probucol)减轻AS损伤的作用，源于它的两个羟基酚结构〔2，3〕。但由于其价格昂贵以及降低LDL和使QT间期延长等副作用一直未能广泛应用。我们从中药大黄、虎杖、何首乌中提取具有相似结构的蒽醌类化合物，观察其对LDL氧化的影响，为今后药物开发提供新的理论基础。
1 材料和方法
1.1 药物总蒽醌粗提物制备 中药生药大黄、虎杖、何首乌由北京宣武医院中药房提供。采用乙醇提取并加用碱提取酸沉淀法提取总蒽醌类化合物：中药生药以95%乙醇加热3 h回流提取，重复3次；提取液浓缩并以NaOH调节pH值至8；1 500 r/min离心10 min，取上清液，以5 N HCl调pH值为5；真空抽滤取沉淀物，以蒸馏水洗至中性；收集沉淀物，晾干保存于-20 ℃。提取物以碱试剂检测呈红色反应，表明药物提取物中有羟基蒽醌存在〔4〕。
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1.2 氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)制备 取健康成人空腹12 h混合静脉血，以密度梯度超速离心制备LDL。LDL浓度由考马斯亮兰G250蛋白定量法测定。新鲜LDL透析后以0.15 M PBS调节使其终浓度为0.4 mg/ml，加入新鲜配制的CuCl2，使Cu2+终浓度为40 μM，置于37 ℃水浴孵育，于波长234 nm测定吸光度(A)。以水浴前A作为起点值，每30 min测定，连续监测，至A上至最高点后开始下降，以等体积2 mg/ml EDTA终止氧化。以不同时间点的A值绘制氧化动力曲线，迟滞相估计参考切线法〔5〕。氧化前后分别以TBARS法测定LDL氧化含量。以MDA含量作为LDL中过氧化脂质含量。
1.3 LDL氧化的抑制 中药粗提取以75%乙醇配制成为4 mg/ml溶液，用时分别取10、20、40、80 μl，以75%乙醇补足体积至80 μl，于加入Cu2+之前加入各OX-LDL制备管，使药物形成10 μg/ml，20 μg/ml，40 μg/ml，80 μg/ml四种终浓度；对照管仅入80 μl 75%乙醇；各管形成反应物总量为4 ml，LDL终浓度为0.4 mg/ml，Cu2+终浓度为40 μM的反应体系，于234 nm波长下监测结合二烯键形成过程，观察药物对氧化动力曲线的影响；氧化前后分别以TBARS法测定过氧化脂质含量增加数，并相对于对照管氧化增加倍数计算其抑制氧化百分率。
, 百拇医药
1.4 统计分析 浓度与抑制率关系进行直线相关与回归分析，由SPSS统计软件处理。
2 结 果
2.1 药物溶剂对LDL氧化动力曲线的影响 自提中药溶剂为75%乙醇。以OX-LDL制备管做对照，观察溶剂加入反应体系对结合二烯键形成的影响，结果溶剂不改变动力曲线的特异性变化，测氧化前后MDA示过氧化脂质增加倍数与对照管无明显差异，均增加近30倍。
2.2 药物提取对动力曲线的影响 在反应体系中加入不同浓度药物提取物，对照管中加等体积溶剂，观察药物对氧化动力曲线的影响，结果见图1。可见三种药物均可改变氧化动力曲线的形态，主要表现为迟滞相延长，药物浓度增加，延长时间也增加，大黄浓度为10 μg/ml时使迟滞相明显延长，20 μg/ml时LDL无明显变化；虎杖浓度达40 μg/ml时，亦使曲线峰值明显降低；药物浓度为80 μg/ml时，曲线均不出现快速氧化期，保持在基线附近。
, 百拇医药
2.3 TBARS反应中药物的作用 加入不同浓度药物后测定其氧化后MDA含量增加倍数，相对于对照管MDA增加倍数计算药物抑制MDA增加百分率，见表1。可见药物对过氧化质生成均有抑制作用，且其抑制率具有浓度依赖性。
2.4 药物浓度与抑制率的相关性及药物作用强度的比较 以所用药物浓度的常用对数为因变量，做曲线拟合分析，发现药物浓度与药物对LDL氧化抑制率有明显的相关性，做线性回归分析得到回归方程，由此计算抑制率为50%时所需药物浓度(IR50)，以比较药物的作用强度(表2)。可见各种药物粗提物的抑制率都有明显的浓度依赖性。比较IR50发现以大黄抑制作用最强，虎杖次之，何首乌作用最弱。
对照管及药物不同终浓度管(d：大黄；h：虎杖；s：何首乌。1、2、3、4分别示终浓度10、20、40、80 μg/ml)
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图1 三种药物对结合二烯键形成的影响
表1 药物不同浓度时的抑制率(μg/ml)
抑制率(%)
10
20
40
80
大黄
32.37
86.23
93.07
92.46
, 百拇医药
虎杖
0
0
55.72
92.65
何首乌
0
6.98
5.21
93.87
表2 药物浓度与抑制率的关系
r
P值
, 百拇医药
y
IR50(μg/ml)
大黄
0.975 3
<0.001
0.018 3x-0.002 2
8.18
虎杖
0.782 4
<0.01
0.197 6+0.019 9x
15.58
, 百拇医药
何首乌
0.651 4
<0.05
0.285 3+0.184 0x
3.06×109
r相关系数；y：药物浓度；x：抑制率；IR50：抑制率为50%时的药物浓度
3 讨 论
在Cu2+存在条件下，LDL氧化动力曲线具有特征性变化；开始曲线上升缓慢，称为迟滞相，一般认为由内源性抗氧化物耗竭所致；随后为快速氧化相，曲线陡升，产生大量过氧化脂质；此后氧化停滞并有所分解，曲线上升至一定程度时A值不再增加或有所下降。我们的实验结果表明以乙醇提取总蒽醌类化合物有改变氧化动力曲线形态特点的作用，首先使迟滞相延长，高浓度时曲线峰值降低，甚至无明显的快速氧化期。多数蒽醌的母核上有不同数目的羟基取代，蒽醌衍生物多有酚羟基取代，呈弱酸性反应，在氧化反应中可以作为一种断链抗氧化剂，起着与丙丁酚类似的抗氧化作用。中药大黄、虎杖、何首乌的主要成分为蒽醌类化合物，其药物提取加入反应体系后产生类似的抗氧化效应，测定氧化前后MDA含量发现过氧化脂质增加受抑。
, 百拇医药
进行抑制率与浓度的曲线拟合分析，发现各种药物的抑制率均与其加药浓度呈正相关，由所得到的回归方程计算IR50发现药物作用强度差异，大黄作用最强，虎杖次之，而何首乌作用最弱。Arora等〔6〕报道黄酮类化合物的抗氧化活性取决于其苯环上的取代物，羟基取代的位置不同时其抗氧化能力亦不同。三种蒽醌类化合物抑制LDL氧化的作用强度有所不同，这可能与总黄酮类化合物有类似的情况，这与总蒽醌类化合物中组成成分不同有关，具有不同羟基取代位置的蒽醌成分不同其抗氧化活性也不相同。
我们的实验证实了中药总蒽醌粗提物抑制LDL体外氧化的作用，表明其使LDL氧化迟滞相延长，抑制过氧化脂质生成的作用，以药物的IR50进行比较，发现药物之间存在作用强度差异。 北京市科技新星计划和北京市优秀青年知识分子基金资助
作者简介：程向缨，女，28岁，主治医师
, 百拇医药 参考文献
1，Steinberg D.Lewis conner memorial lecture：Oxidation modification of LDL and atherosclerosis.Circulation，1997；95(4)：1062
2，Kuzuya M,Kuzuya F.Probucol as an antioxidant and antiatherogenic drug.Free Radic Biol Med，1993：14：67
3，Oshima R,Ikeda T,Watanabe K et al.Probucol treatment attenuates the aortic atherosclerosis in watanabe heritable hyperlipidemic rabbits.Atherosclerosis，1998；137：13-12
, 百拇医药
4，丁林生，刘丽娟，刘焱文 et al.中药化学.北京：中国中医药出版社，1997：59-65
5，Maggi EM.Bellazzi R.Falaschi F et al.Enhanced LDL oxidation in uremic patients:An additional mechanism for accelerated atherosclerosis?Kidney Int，1994；45：876
6，Arora A，Nair MG，Strasburg GM.Structure-activity relationships for antivities of a series of flavonoids in a liposomal system.Free Radic Bio Med，1998；24(9)：1335
收稿日期：1999-06-29
修回日期：1999-08-24, http://www.100md.com
单位：
关键词：中药；蒽醌；低密度脂蛋白；氧化
中国老年学杂志000524摘 要 目的 从单味中药大黄、虎杖、何首乌中提取总蒽醌类化合物，观察其对低密度脂蛋白氧化修饰的抑制作用。方法 以95%乙醇提取并加用碱提取酸沉淀法提取蒽醌类成分，观察其对Cu2+诱导的LDL氧化的抑制作用，以硫代巴比妥酸反应物质法(TBARS)测定丙二醛(MDA)含量，计算药物对氧化的抑制率以及抑制率为50%时所需药物浓度(IR50)。结果 总蒽醌类提取物使氧化动力曲线迟滞相延长，峰值降低，抑制过氧化脂质生成并有浓度依赖性，各种药物的IR50分别为8.18 μg/ml(大黄)、15.58 μg/ml(虎杖)、3.06×109 μg/ml(何首乌)。结论 三种药物蒽醌类提取物均有抑制LDL氧化作用，但抑制作用强度不同。
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Inhibition of low density lipoprotein oxidation by anthroquinone extracted from Chinese herbal medicine
Cheng Xiangying,Wang Yongjun,Wen Mei et al
(Department of Neurology,Xuanwu Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing 100053)
Abstract：Objective Independently extracted the anthroquinone mixture from herbal medicine Rheum palmatum L,Polygonum cuspidatum Sieb et Zuu and Polygonum multiflorum Thunb were examined.Methods Extract the anthroquinone constituent with 95% ethanolic solution. The extracts solved in alkaline solutions and then deposit from acidic solution. The oxidative low density lipoprotein(ox-LDL) was induced by Cu2+ and oxidation degree was assessed by measuring thiobarbituric acid-reactive substances(TBARS). The inhibition rate and IR50 was assessed by bivariate correlation and linear regression with SPSS.Results The extracts could delay the lag phase in the kinetics process of LDL oxidation. The formation of TBARS was inhibited.IR50 was 8.18 μg/ml、15.58 μg/ml、3.06×109 μg/ml respectively.Conclusions All the extracts can inhibited the LDL oxidation. The antioxidative activity of the three extracts were different,Rheum palmatum L seems to be the most powerful one.
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Key words Herbal medicine Anthroquinone Low density lipoprotein Oxidation
低密度脂蛋白(LDL)的氧化修饰对动脉粥样硬化(AS)的发生和发展有着重要意义〔1〕，抑制LDL氧化修饰的药物研究具有良好前景，药物丙丁酚(probucol)减轻AS损伤的作用，源于它的两个羟基酚结构〔2，3〕。但由于其价格昂贵以及降低LDL和使QT间期延长等副作用一直未能广泛应用。我们从中药大黄、虎杖、何首乌中提取具有相似结构的蒽醌类化合物，观察其对LDL氧化的影响，为今后药物开发提供新的理论基础。
1 材料和方法
1.1 药物总蒽醌粗提物制备 中药生药大黄、虎杖、何首乌由北京宣武医院中药房提供。采用乙醇提取并加用碱提取酸沉淀法提取总蒽醌类化合物：中药生药以95%乙醇加热3 h回流提取，重复3次；提取液浓缩并以NaOH调节pH值至8；1 500 r/min离心10 min，取上清液，以5 N HCl调pH值为5；真空抽滤取沉淀物，以蒸馏水洗至中性；收集沉淀物，晾干保存于-20 ℃。提取物以碱试剂检测呈红色反应，表明药物提取物中有羟基蒽醌存在〔4〕。
, http://www.100md.com
1.2 氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)制备 取健康成人空腹12 h混合静脉血，以密度梯度超速离心制备LDL。LDL浓度由考马斯亮兰G250蛋白定量法测定。新鲜LDL透析后以0.15 M PBS调节使其终浓度为0.4 mg/ml，加入新鲜配制的CuCl2，使Cu2+终浓度为40 μM，置于37 ℃水浴孵育，于波长234 nm测定吸光度(A)。以水浴前A作为起点值，每30 min测定，连续监测，至A上至最高点后开始下降，以等体积2 mg/ml EDTA终止氧化。以不同时间点的A值绘制氧化动力曲线，迟滞相估计参考切线法〔5〕。氧化前后分别以TBARS法测定LDL氧化含量。以MDA含量作为LDL中过氧化脂质含量。
1.3 LDL氧化的抑制 中药粗提取以75%乙醇配制成为4 mg/ml溶液，用时分别取10、20、40、80 μl，以75%乙醇补足体积至80 μl，于加入Cu2+之前加入各OX-LDL制备管，使药物形成10 μg/ml，20 μg/ml，40 μg/ml，80 μg/ml四种终浓度；对照管仅入80 μl 75%乙醇；各管形成反应物总量为4 ml，LDL终浓度为0.4 mg/ml，Cu2+终浓度为40 μM的反应体系，于234 nm波长下监测结合二烯键形成过程，观察药物对氧化动力曲线的影响；氧化前后分别以TBARS法测定过氧化脂质含量增加数，并相对于对照管氧化增加倍数计算其抑制氧化百分率。
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1.4 统计分析 浓度与抑制率关系进行直线相关与回归分析，由SPSS统计软件处理。
2 结 果
2.1 药物溶剂对LDL氧化动力曲线的影响 自提中药溶剂为75%乙醇。以OX-LDL制备管做对照，观察溶剂加入反应体系对结合二烯键形成的影响，结果溶剂不改变动力曲线的特异性变化，测氧化前后MDA示过氧化脂质增加倍数与对照管无明显差异，均增加近30倍。
2.2 药物提取对动力曲线的影响 在反应体系中加入不同浓度药物提取物，对照管中加等体积溶剂，观察药物对氧化动力曲线的影响，结果见图1。可见三种药物均可改变氧化动力曲线的形态，主要表现为迟滞相延长，药物浓度增加，延长时间也增加，大黄浓度为10 μg/ml时使迟滞相明显延长，20 μg/ml时LDL无明显变化；虎杖浓度达40 μg/ml时，亦使曲线峰值明显降低；药物浓度为80 μg/ml时，曲线均不出现快速氧化期，保持在基线附近。
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2.3 TBARS反应中药物的作用 加入不同浓度药物后测定其氧化后MDA含量增加倍数，相对于对照管MDA增加倍数计算药物抑制MDA增加百分率，见表1。可见药物对过氧化质生成均有抑制作用，且其抑制率具有浓度依赖性。
2.4 药物浓度与抑制率的相关性及药物作用强度的比较 以所用药物浓度的常用对数为因变量，做曲线拟合分析，发现药物浓度与药物对LDL氧化抑制率有明显的相关性，做线性回归分析得到回归方程，由此计算抑制率为50%时所需药物浓度(IR50)，以比较药物的作用强度(表2)。可见各种药物粗提物的抑制率都有明显的浓度依赖性。比较IR50发现以大黄抑制作用最强，虎杖次之，何首乌作用最弱。
对照管及药物不同终浓度管(d：大黄；h：虎杖；s：何首乌。1、2、3、4分别示终浓度10、20、40、80 μg/ml)
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图1 三种药物对结合二烯键形成的影响
表1 药物不同浓度时的抑制率(μg/ml)
抑制率(%)
10
20
40
80
大黄
32.37
86.23
93.07
92.46
, 百拇医药
虎杖
0
0
55.72
92.65
何首乌
0
6.98
5.21
93.87
表2 药物浓度与抑制率的关系
r
P值
, 百拇医药
y
IR50(μg/ml)
大黄
0.975 3
<0.001
0.018 3x-0.002 2
8.18
虎杖
0.782 4
<0.01
0.197 6+0.019 9x
15.58
, 百拇医药
何首乌
0.651 4
<0.05
0.285 3+0.184 0x
3.06×109
r相关系数；y：药物浓度；x：抑制率；IR50：抑制率为50%时的药物浓度
3 讨 论
在Cu2+存在条件下，LDL氧化动力曲线具有特征性变化；开始曲线上升缓慢，称为迟滞相，一般认为由内源性抗氧化物耗竭所致；随后为快速氧化相，曲线陡升，产生大量过氧化脂质；此后氧化停滞并有所分解，曲线上升至一定程度时A值不再增加或有所下降。我们的实验结果表明以乙醇提取总蒽醌类化合物有改变氧化动力曲线形态特点的作用，首先使迟滞相延长，高浓度时曲线峰值降低，甚至无明显的快速氧化期。多数蒽醌的母核上有不同数目的羟基取代，蒽醌衍生物多有酚羟基取代，呈弱酸性反应，在氧化反应中可以作为一种断链抗氧化剂，起着与丙丁酚类似的抗氧化作用。中药大黄、虎杖、何首乌的主要成分为蒽醌类化合物，其药物提取加入反应体系后产生类似的抗氧化效应，测定氧化前后MDA含量发现过氧化脂质增加受抑。
, 百拇医药
进行抑制率与浓度的曲线拟合分析，发现各种药物的抑制率均与其加药浓度呈正相关，由所得到的回归方程计算IR50发现药物作用强度差异，大黄作用最强，虎杖次之，而何首乌作用最弱。Arora等〔6〕报道黄酮类化合物的抗氧化活性取决于其苯环上的取代物，羟基取代的位置不同时其抗氧化能力亦不同。三种蒽醌类化合物抑制LDL氧化的作用强度有所不同，这可能与总黄酮类化合物有类似的情况，这与总蒽醌类化合物中组成成分不同有关，具有不同羟基取代位置的蒽醌成分不同其抗氧化活性也不相同。
我们的实验证实了中药总蒽醌粗提物抑制LDL体外氧化的作用，表明其使LDL氧化迟滞相延长，抑制过氧化脂质生成的作用，以药物的IR50进行比较，发现药物之间存在作用强度差异。 北京市科技新星计划和北京市优秀青年知识分子基金资助
作者简介：程向缨，女，28岁，主治医师
, 百拇医药 参考文献
1，Steinberg D.Lewis conner memorial lecture：Oxidation modification of LDL and atherosclerosis.Circulation，1997；95(4)：1062
2，Kuzuya M,Kuzuya F.Probucol as an antioxidant and antiatherogenic drug.Free Radic Biol Med，1993：14：67
3，Oshima R,Ikeda T,Watanabe K et al.Probucol treatment attenuates the aortic atherosclerosis in watanabe heritable hyperlipidemic rabbits.Atherosclerosis，1998；137：13-12
, 百拇医药
4，丁林生，刘丽娟，刘焱文 et al.中药化学.北京：中国中医药出版社，1997：59-65
5，Maggi EM.Bellazzi R.Falaschi F et al.Enhanced LDL oxidation in uremic patients:An additional mechanism for accelerated atherosclerosis?Kidney Int，1994；45：876
6，Arora A，Nair MG，Strasburg GM.Structure-activity relationships for antivities of a series of flavonoids in a liposomal system.Free Radic Bio Med，1998；24(9)：1335
收稿日期：1999-06-29
修回日期：1999-08-24, http://www.100md.com