C-MYC基因与老年胃癌及直肠癌的关系研究
作者：姜艳芳 郑永晨 谭岩 赵平伟
单位：姜艳芳 郑永晨 谭岩(白求恩医科大学第一临床学院中心实验室，长春 130021)；赵平伟(第一汽车集团公司职工医院肝胆外科)
关键词：癌基因；C-MYC；胃癌；直肠癌
中国老年学杂志000514摘 要 目的 研究老年人胃癌和直肠癌中的C-MYC基因扩增情况。方法 用聚合酶链式反应(PCR)测定84例老年胃癌和直肠癌患者中的C-MYC基因，通过激光密度扫描仪对琼脂糖凝胶EB染色底片进行积分光密度分析。结果 正常组织无C-MYC扩增，C-MYC/N+L-MYC比值95%可信区间为0.086 9～0.625 7，胃癌组织C-MYC基因扩增阳性率为69.2%，直肠癌组织的C-MYC基因扩增阳性率为62.5%，84例肿瘤组织C-MYC扩增总阳性率为66.7%。结论 癌组织C-MYC扩增高于正常组织，在不同肿瘤组织中扩增程度不同，与细胞潜在的增殖能力成正相关；这可为肿瘤的发生、发展及预后，特别为指导基因治疗提供有用的资料。
, 百拇医药
MYC基因家族属核蛋白类，其编码产物与核内DNA特异结合，在细胞核内转化成蛋白。目前，已知的MYC家族至少3个成员：C-MYC，N-MYC和L-MYC。其中C-MYC是髓细胞性白血病病毒V-MYC的同源物，其作用是三者中最强的，可促进细胞增殖、永生化、去分化和转化等，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位〔1〕。胃癌和直肠癌是老年人最常见的恶性肿瘤。本文就C-MYC基因在老年胃癌及直肠癌中的扩增情况与正常人进行比较，旨在证实C-MYC基因在胃癌及直肠癌的发生、发展中起重要作用。
1 材料与方法
1.1 材料 标本：52例胃癌，32例直肠癌患者；男47例，女37例；年龄61～72岁，平均64.6岁；均经病理及手术证实。32例正常对照为同期非肿瘤病人的组织标本，男21例，女10例；年龄60～71岁，平均64.5岁。标本取材后速置于-20℃冰柜中保存备用。
PCR反应MYC通用引物为中科院上海细胞所合成C-MYC，N-MYC，L-MYC第二外显子上同源序列。
, 百拇医药
上游：5′-CCCAGCGAGGA(TC)ATCTGGAAGAA-3′
下游：5′-GAGAAGCCGCTCCACAT(AG)CAGTC-3′
主要试剂Taq DNA聚合酶，dNTP，Φχ174/HaeⅢ酶切片断，为Promega公司产品，其他试剂均为分析纯。
1.2 方法 组织中DNA提取见文献〔2〕。
PCR扩增MYC家族基因：5.0 μl10倍PCR缓冲液，4.0 μl dNTP(2.5 mmol/L)，通用MYC引物(上，下游)各0.5 μl(各20 pmol)，ddH2O(37.7 μl)，DNA聚合酶0.3 μl(1.5 U)，制成DNA模板2.0 μl，总体积50.0 μl，混匀离心置于DNA扩增仪(PE2400)内反应。反应程序为：①变性温度95℃，45 s，②退火温度55℃，45 s，③延伸温度72℃，90 s。一共35周期，外加72℃，7 min。
, 百拇医药
产物检测：2%琼脂糖凝胶电泳，电泳时电压为3 V/cm，5.0 μl产物与1.0 μl上样缓冲液混匀，加入凝胶孔内，当指示剂走到2/3位置时停止电泳，溴化乙锭染色，取出凝胶在紫外分析上观察结果。
图象分析：底片置于激光密度扫描仪(LKB)上测各电泳条带的积分光密度，得出各带的积分光密度值，将C-MYC/N+L-MYC的比值进行比较，正常组织与肿瘤组织进行比较和分析，并进行不同种类肿瘤组织进行比较和分析，并进行统计学处理。
2 结 果
2.1 32例正常组织MYC基因PCR扩增产物检测结果 PCR产物琼脂糖电泳检测结果：本实验采用通用引物PCR方法，实验设计引物扩增MYC家族基因中三个成员：N-MYC，C-MYC，L-MYC，PCR扩增产物电泳结果EB染色后紫外灯下显示：可见2条MYC电泳带，其中一条带为N-MYC(230 bp)和L-MYC(227 bp)，由于2条带DNA产物分子量只相差3 bp，在琼脂糖凝胶中难以分开，故电泳中呈现一条带，第2条带为C-MYC(284 bp)。见图1。
, 百拇医药
2.2 肿瘤组织PCR扩增产物检测结果 肿瘤组织PCR扩增产物电泳检测结果(以胃癌为例)见图2。
C-MYC带比N+L-MYC带弱；N+L-MYC电泳带宽且强；1～5孔，7～17孔为正常组织PCR扩增产物；6孔为Φχ174/Hae Ⅲ酶切片断
图1 正常组织PCR产物电泳结果
3，4，6，7，9～11，13～15孔C-MYC扩增阳性；
1～11孔，13～17孔为肿瘤组织；12孔为Φχ174/Hae Ⅲ酶切片断
图2 胃癌组织PCR产物电泳结果
, 百拇医药
2.3 不同种类肿瘤组织激光扫描结果 见表1。
表1 不同肿瘤组织PCR扩增MYC家族产物激光扫描结果 组织类型
例数
-
+
阳性百分比
χ2
正常组织
32
32
0
直肠癌
, 百拇医药
32
12
20
62.5
14.54
胃癌
52
16
36
69.2
19.38
合计
116
, 百拇医药
60
56
66.7
17.66
各肿瘤组织与正常组织相比P<0.05
3 讨 论
MYC基因属于“不死性”或“永生性”癌基因，过度表达可改变细胞内的基因调控，使细胞于转化为恶性表型。癌基因扩增是癌基因激活的主要形式，核内原癌基因C-MYC的扩增是Collins和Favera等〔1，3〕首先报道的。本文采用通用引物进行PCR扩增，产物负片用激光密度扫描仪检测后，积分光密度值C-MYC与N+L-MYC的比值可以得出相对的竞争优势，进行半定量分析，研究基因扩增变化。从正常组织的检查结果分析，C-MYC/N+L-MYC正常值范围为x±1.96 s，0.086 9～0.625 7，确定阳性标准为0.625 7。只要大于此值，即有95%的可信度为阳性。Ninomiya等〔4〕对胃癌用免疫组化方法分析C-MYC蛋白质，结果发现C-MYC蛋白的高表达与肿瘤的分化程度、侵犯深度及预后密切相关。Yander等〔5〕发现化学诱变大肠癌过程中有C-MYC蛋白的高表达。本实验对老年患者的胃癌、直肠癌MYC基因进行癌基因检测，结果表明C-MYC癌基因在胃癌中表现突出，达69.2%。其中扩增2倍以上14例，3例以上6例，5倍以上2例。基因扩增在有淋巴结转移的病例中表现突出，C-MYC基因扩增与胃癌的恶性程度相关，提示C-MYC扩增是肿瘤患者的较晚期事件，可望为老年患者的基因治疗提供分子水平依据。32例老年结肠癌患者有62.5%的C-MYC基因扩增，其中扩增2倍以上有10例，3倍以上有2例。
, 百拇医药
目前肿瘤基因治疗计划通过反义核苷酸技术干扰癌基因的转录和翻译，从而关闭其表达〔6〕。美国RAC(肿瘤中心)最近以“一个病人使用(single-patient use)”作为基因治疗采纳与否的指导思想〔7〕。这样在分子水平上对C-MYC基因做出个体扩增情况的分析显得尤其重要。本研究结果表明，C-MYC基因在这两种老年肿瘤患者中虽有大量表达，但也有一些患者没有明显变化。因此依据研究结果，对每一病例进行检测，确定是否有C-MYC基因的扩增，由此决定是否用C-MYC反义核苷酸进行治疗。这样可解决以往疗效不佳的问题，对预后起非常重要的作用。 作者简介：姜艳芳，女，29岁，硕士，初级研究员，主要从事分子生物学的研究
参考文献
1，Collins SJ,Groudine M.Amplification of endogenous myc-related DNA sequences in a human myeloid leukaemia cell line.Nature，1982；298：679
, 百拇医药
2，郑永晨，傅文永，潘国强 et al.PCR检测技术中模板DNA的简易快速提取法.白求恩医科大学学报，1993；19(4)：407
3，Fravera RD,Wong-Staal F,Gallo RC.Oncogene amplification in promyelocytic leukaemia cell line HL-60 and primary leukaemia cells of the same patient.Nature，1982；299：61
4，Ninomiya I,Yonemura Y,Matsumoto H.Expression of C-MYC gene product in gastric carcinomas.Oncology，1991；48：149
5，Yander G,Halsey H,Kenna M et al.Amplification and elevated expression of C-MYC in a chemically induced morse colon tumor.Cancer Res，1985；45：4 433
6，Stein CA,Cheng YC.Antisence oligonucleotides as therapeutic agents-is the bullet really magical.Science，1993；261：1 004
7，Jenks S.RAC approves policy for single-patient use of gene therapy(news).J Natl Cancer Inst，1993；85：266
收稿日期：1999-10-15, 百拇医药
单位：姜艳芳 郑永晨 谭岩(白求恩医科大学第一临床学院中心实验室，长春 130021)；赵平伟(第一汽车集团公司职工医院肝胆外科)
关键词：癌基因；C-MYC；胃癌；直肠癌
中国老年学杂志000514摘 要 目的 研究老年人胃癌和直肠癌中的C-MYC基因扩增情况。方法 用聚合酶链式反应(PCR)测定84例老年胃癌和直肠癌患者中的C-MYC基因，通过激光密度扫描仪对琼脂糖凝胶EB染色底片进行积分光密度分析。结果 正常组织无C-MYC扩增，C-MYC/N+L-MYC比值95%可信区间为0.086 9～0.625 7，胃癌组织C-MYC基因扩增阳性率为69.2%，直肠癌组织的C-MYC基因扩增阳性率为62.5%，84例肿瘤组织C-MYC扩增总阳性率为66.7%。结论 癌组织C-MYC扩增高于正常组织，在不同肿瘤组织中扩增程度不同，与细胞潜在的增殖能力成正相关；这可为肿瘤的发生、发展及预后，特别为指导基因治疗提供有用的资料。
, 百拇医药
MYC基因家族属核蛋白类，其编码产物与核内DNA特异结合，在细胞核内转化成蛋白。目前，已知的MYC家族至少3个成员：C-MYC，N-MYC和L-MYC。其中C-MYC是髓细胞性白血病病毒V-MYC的同源物，其作用是三者中最强的，可促进细胞增殖、永生化、去分化和转化等，在多种肿瘤形成过程中处于重要地位〔1〕。胃癌和直肠癌是老年人最常见的恶性肿瘤。本文就C-MYC基因在老年胃癌及直肠癌中的扩增情况与正常人进行比较，旨在证实C-MYC基因在胃癌及直肠癌的发生、发展中起重要作用。
1 材料与方法
1.1 材料 标本：52例胃癌，32例直肠癌患者；男47例，女37例；年龄61～72岁，平均64.6岁；均经病理及手术证实。32例正常对照为同期非肿瘤病人的组织标本，男21例，女10例；年龄60～71岁，平均64.5岁。标本取材后速置于-20℃冰柜中保存备用。
PCR反应MYC通用引物为中科院上海细胞所合成C-MYC，N-MYC，L-MYC第二外显子上同源序列。
, 百拇医药
上游：5′-CCCAGCGAGGA(TC)ATCTGGAAGAA-3′
下游：5′-GAGAAGCCGCTCCACAT(AG)CAGTC-3′
主要试剂Taq DNA聚合酶，dNTP，Φχ174/HaeⅢ酶切片断，为Promega公司产品，其他试剂均为分析纯。
1.2 方法 组织中DNA提取见文献〔2〕。
PCR扩增MYC家族基因：5.0 μl10倍PCR缓冲液，4.0 μl dNTP(2.5 mmol/L)，通用MYC引物(上，下游)各0.5 μl(各20 pmol)，ddH2O(37.7 μl)，DNA聚合酶0.3 μl(1.5 U)，制成DNA模板2.0 μl，总体积50.0 μl，混匀离心置于DNA扩增仪(PE2400)内反应。反应程序为：①变性温度95℃，45 s，②退火温度55℃，45 s，③延伸温度72℃，90 s。一共35周期，外加72℃，7 min。
, 百拇医药
产物检测：2%琼脂糖凝胶电泳，电泳时电压为3 V/cm，5.0 μl产物与1.0 μl上样缓冲液混匀，加入凝胶孔内，当指示剂走到2/3位置时停止电泳，溴化乙锭染色，取出凝胶在紫外分析上观察结果。
图象分析：底片置于激光密度扫描仪(LKB)上测各电泳条带的积分光密度，得出各带的积分光密度值，将C-MYC/N+L-MYC的比值进行比较，正常组织与肿瘤组织进行比较和分析，并进行不同种类肿瘤组织进行比较和分析，并进行统计学处理。
2 结 果
2.1 32例正常组织MYC基因PCR扩增产物检测结果 PCR产物琼脂糖电泳检测结果：本实验采用通用引物PCR方法，实验设计引物扩增MYC家族基因中三个成员：N-MYC，C-MYC，L-MYC，PCR扩增产物电泳结果EB染色后紫外灯下显示：可见2条MYC电泳带，其中一条带为N-MYC(230 bp)和L-MYC(227 bp)，由于2条带DNA产物分子量只相差3 bp，在琼脂糖凝胶中难以分开，故电泳中呈现一条带，第2条带为C-MYC(284 bp)。见图1。
, 百拇医药
2.2 肿瘤组织PCR扩增产物检测结果 肿瘤组织PCR扩增产物电泳检测结果(以胃癌为例)见图2。
C-MYC带比N+L-MYC带弱；N+L-MYC电泳带宽且强；1～5孔，7～17孔为正常组织PCR扩增产物；6孔为Φχ174/Hae Ⅲ酶切片断
图1 正常组织PCR产物电泳结果
3，4，6，7，9～11，13～15孔C-MYC扩增阳性；
1～11孔，13～17孔为肿瘤组织；12孔为Φχ174/Hae Ⅲ酶切片断
图2 胃癌组织PCR产物电泳结果
, 百拇医药
2.3 不同种类肿瘤组织激光扫描结果 见表1。
表1 不同肿瘤组织PCR扩增MYC家族产物激光扫描结果 组织类型
例数
-
+
阳性百分比
χ2
正常组织
32
32
0
直肠癌
, 百拇医药
32
12
20
62.5
14.54
胃癌
52
16
36
69.2
19.38
合计
116
, 百拇医药
60
56
66.7
17.66
各肿瘤组织与正常组织相比P<0.05
3 讨 论
MYC基因属于“不死性”或“永生性”癌基因，过度表达可改变细胞内的基因调控，使细胞于转化为恶性表型。癌基因扩增是癌基因激活的主要形式，核内原癌基因C-MYC的扩增是Collins和Favera等〔1，3〕首先报道的。本文采用通用引物进行PCR扩增，产物负片用激光密度扫描仪检测后，积分光密度值C-MYC与N+L-MYC的比值可以得出相对的竞争优势，进行半定量分析，研究基因扩增变化。从正常组织的检查结果分析，C-MYC/N+L-MYC正常值范围为x±1.96 s，0.086 9～0.625 7，确定阳性标准为0.625 7。只要大于此值，即有95%的可信度为阳性。Ninomiya等〔4〕对胃癌用免疫组化方法分析C-MYC蛋白质，结果发现C-MYC蛋白的高表达与肿瘤的分化程度、侵犯深度及预后密切相关。Yander等〔5〕发现化学诱变大肠癌过程中有C-MYC蛋白的高表达。本实验对老年患者的胃癌、直肠癌MYC基因进行癌基因检测，结果表明C-MYC癌基因在胃癌中表现突出，达69.2%。其中扩增2倍以上14例，3例以上6例，5倍以上2例。基因扩增在有淋巴结转移的病例中表现突出，C-MYC基因扩增与胃癌的恶性程度相关，提示C-MYC扩增是肿瘤患者的较晚期事件，可望为老年患者的基因治疗提供分子水平依据。32例老年结肠癌患者有62.5%的C-MYC基因扩增，其中扩增2倍以上有10例，3倍以上有2例。
, 百拇医药
目前肿瘤基因治疗计划通过反义核苷酸技术干扰癌基因的转录和翻译，从而关闭其表达〔6〕。美国RAC(肿瘤中心)最近以“一个病人使用(single-patient use)”作为基因治疗采纳与否的指导思想〔7〕。这样在分子水平上对C-MYC基因做出个体扩增情况的分析显得尤其重要。本研究结果表明，C-MYC基因在这两种老年肿瘤患者中虽有大量表达，但也有一些患者没有明显变化。因此依据研究结果，对每一病例进行检测，确定是否有C-MYC基因的扩增，由此决定是否用C-MYC反义核苷酸进行治疗。这样可解决以往疗效不佳的问题，对预后起非常重要的作用。 作者简介：姜艳芳，女，29岁，硕士，初级研究员，主要从事分子生物学的研究
参考文献
1，Collins SJ,Groudine M.Amplification of endogenous myc-related DNA sequences in a human myeloid leukaemia cell line.Nature，1982；298：679
, 百拇医药
2，郑永晨，傅文永，潘国强 et al.PCR检测技术中模板DNA的简易快速提取法.白求恩医科大学学报，1993；19(4)：407
3，Fravera RD,Wong-Staal F,Gallo RC.Oncogene amplification in promyelocytic leukaemia cell line HL-60 and primary leukaemia cells of the same patient.Nature，1982；299：61
4，Ninomiya I,Yonemura Y,Matsumoto H.Expression of C-MYC gene product in gastric carcinomas.Oncology，1991；48：149
5，Yander G,Halsey H,Kenna M et al.Amplification and elevated expression of C-MYC in a chemically induced morse colon tumor.Cancer Res，1985；45：4 433
6，Stein CA,Cheng YC.Antisence oligonucleotides as therapeutic agents-is the bullet really magical.Science，1993；261：1 004
7，Jenks S.RAC approves policy for single-patient use of gene therapy(news).J Natl Cancer Inst，1993；85：266
收稿日期：1999-10-15, 百拇医药