载脂蛋白E基因多态性与Alzheimer病的相关性研究
作者：岳培彬 崔行 王墨林
单位：山东医科大学生物化学教研室，济南 250012
关键词：Alzheimer病；载脂蛋白E；基因型；多态性
中国老年学杂志000501摘 要 目的 研究中国老龄人群ApoE等位基因与Alzheimer病(AD)发病危险性的关系。方法 选取22例散发性AD患者和64例正常老年人做为研究对象，采用聚合酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)方法鉴定载脂蛋白E(ApoE)基因型，分析ApoE等位基因及ε4基因剂量与AD发病的关系。结果 ApoE ε4等位基因与AD发病关系密切，AD患者中ε4基因频率较正常对照明显增高，且随着ε4基因剂量增加，AD患病率增高，发病年龄降低。结论 ApoE ε4等位基因与AD发病有关，是散发性AD发病的危险因子之一。
, http://www.100md.com
Calcitonin gene-related peptide(CGRP) expression in plasma of the patients with cerebrovascular disorder
Chen Qinhui,Ren Hui,Jiang Ligang et al
(Department of Neurology,Second Affiliated Hospital,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130041)
Absract：Objective To explore the role of CGRP in the pathogenesis of cerebrovascular disorder(CVD).Methods The changes of plasma CGRP in patients with CVD were determined by radioimmunoassay.Results The levels of plasma CGRP in acute cerebral infarction(CI) group were significantly lower than those after recovery and controls(P<0.01),The levelsof CGRP in severe group were significantly lower than those in light and moderate groups(P<0.01),but were significantly higher with hypertension than those without hypertension(P<0.01); The levels of plasma CGRP in acute cerebra hemorrhage(CH) were significantly higher than those at recovery stage and the controls(P<0.01). The highest levels of CGRP were those with severe condition,but with difference between groups with or without hypertension.Conclusions CGRP is involved in pathophysiological course of CVD. The changes of CGRP can be used to judge the severity of CVD,the effects of intervention and the prognosis.
, 百拇医药
Key words Cerebral infarction Cerebral hemorrhage Calcitonin gene-related peptide
人载脂蛋白E(ApoE)是含299个氨基酸残基的分泌性糖蛋白，其基因位于第19号染色体上，约3.7 kb，含4个外显子和3个内含子。ApoE基因呈现多态性，其3个等位基因ε2、ε3、ε4分别编码ApoE 3种主要异构体E2、E3和E4。这3种异构体多肽链第112位和第158位氨基酸残基不同，E2均为半胱氨酸(Cys)，E4均为精氨酸(Arg)，E3第112位为Cys，第158位为Arg。ApoE 3个等位基因组合产生6种基因型ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4、ε3/4，对应存在6种遗传表型E2/2、E3/3、E4/4、E2/3、E2/4、E3/4〔1〕。正常人群中的ApoE基因型分布以ε3/3最多，ε2/2或ε4/4最少。ApoE是血浆脂蛋白重要组分之一，主要在肝脏合成，中枢神经系统中主要由星形胶质细胞合成和分泌〔2〕，在体内脂质代谢和神经系统发育及损伤修复过程中均起着重要作用〔3，4〕。
, 百拇医药
近年来研究发现ApoE及其基因与散发性及晚发家族性Alzheimer病(AD)发病有十分密切的关系，为此我们分析ApoE基因多态性，以研究中国人群中ApoE等位基因与AD发病的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象 根据美国精神疾病诊断和统计手册第3版修订版(DSM-Ⅲ-R)痴呆诊断标准和Folstein简短精神状态检查法(MMSE)作出痴呆诊断；根据病史和脑影像学检查排除脑血管病、外伤等其他病因；再根据NINCDS-ADRDA的Alzheimer病临床诊断标准作出AD的诊断。AD患者22例，随机选择，无血缘关系，经两名副主任以上临床医师共同诊断认定。其中男性9例，女性13例；平均年龄73.4±7.5岁，发病年龄70.1±8.5岁。选择64例与上述患者无血缘关系的正常老年人为对照组，其中男性32例，女性32例，平均年龄60.9±6.2岁。
1.2 基因组DNA的提取 取新鲜抗凝血，分离出淋巴细胞，按常规方法提取基因组DNA。
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1.3 聚合酶链式反应(PCR)扩增ApoE基因〔5〕 ApoE基因扩增采用如下引物序列：上游引物：5′-AGAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3′和下游引物：5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′，扩增ApoE基因第4外显子中含多态性位点的DNA片段，扩增产物长度244 bp。PCR反应体系50 μl，包括0.5 μg基因组DNA，4种dNTPs各250 μmol/L，引物各1 μmol/L，10%二甲亚砜，Taq DNA聚合酶2.5单位。反应体系用50 μl石蜡覆盖，94℃预变性4 min，然后按94℃变性1 min→65℃退火1 min→72℃延伸1 min进行35个循环，最后72℃再延伸7 min。
1.4 ApoE基因限制性片段长度多态性分析〔5〕 取扩增产物5 μl，用2%琼脂糖凝胶电泳检测目的DNA片段，剩余产物纯化后加入6单位HhaⅠ内切酶及其缓冲液，37℃消化4～5 h。然后用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物片段，溴化乙锭染色后在紫外透射反射仪下观察DNA带型，按照Hixson的方法进行ApoE基因分型(见图1)。
, 百拇医药
图1 15%PAGE显示的6种ApoE基因型
限制性酶切片多态性
2 结 果
2.1 ApoE等位基因频率分布 根据ApoE基因型频数，利用基因计数方法统计AD患者和正常人ApoE 3种等位基因频率分布表(表1)。AD组ApoE等位基因频率分布与正常对照不同(χ2＝8.09，P<0.05)，AD患者中ε4基因频率增高，而ε2和ε3频率与正常对照间无差异。
2.2 ApoE 等位基因与AD相关分析 应用相对危险度(RR)分析分别计算ApoE 3个等位基因与AD的相关程度，表明ApoE ε4基因与AD发病有关联(表2)，而ε2和ε3与AD发病无关联(RR值分别为0.61、0.31，P>0.05)。
2.3 ApoE ε4基因剂量与AD发病的关系 因为ApoE 基因与AD发病有关联，我们将AD患者按不含ε4基因、含1个ε4基因和含2个ε4基因分为3组，分别计算了他们的患病率和发病年龄，进一步分析了不同ε4基因剂量在AD发病中的作用(表3)。分析表明随着ε4基因剂量增加，AD患病率增高，同时发病年龄降低。
, 百拇医药
表1 AD及正常人ApoE等位基因频率分布(%) 组别
例数
年龄(岁)
(ApoE)/()
ε2
ε3
ε4
AD
22
73.4±7.5
4.5
70.5
, http://www.100md.com 25.01)
正常对照
64
60.9±6.2
7.8
83.6
8.6
1)与正常对照比较，χ2＝7.90，P<0.05表2 ApoE ε4等位基因与AD发病的相关性分析 组别
例数
含ApoE ε4例数
RR值
, http://www.100md.com
U
P值
AD
22
9
3.74
2.45
<0.05
正常对照
64
10
表3 ApoE ε4基因剂量与AD发病的关系 组别
例数
, 百拇医药
AD例数
患病率(%)
发病年龄
不含ε4基因
67
13
19.4
73.8±6.8
含1个ε4基因
16
7
43.81)
65.8±8.42)
, http://www.100md.com
含2个ε4基因
3
2
66.71)
61.0±8.52)
1)与不含ε4者比较χ2检验，P<0.05；2)与不含ε4相比，t检验P<0.05
3 讨 论
AD是一种复杂的异质性神经失调，是老年性痴呆的最重要类型，发病与多种因素有关，其中遗传因素起着非常重要的作用。已发现与AD发病有关的基因位点有4个，分别位于第1、14、19和21号染色体上〔6〕。近年来研究发现人ApoE 基因位点的遗传存在不平衡现象。虽然AD患者中ApoE 基因型分布与正常人群趋势相似，但ε4等位基因频率增高。Fabian等〔7〕对澳大利亚50例经尸检证实为AD的回顾性研究发现ε4基因频率显著高于对照组，且50%为ε4纯合子，12%为ε4杂合子。我们分析中国散发性AD患者ApoE 等位基因频率，也发现其ε4频率较对照明显增高，ε2和ε3频率虽与对照组相比降低，但无统计学意义，与以往报道基本一致。
, 百拇医药
ApoE 对AD易感性的影响在许多种族和种群中已被证实，我们应用RR研究ApoE等位基因与AD相关性，也发现ε4基因与AD发病有显著关联，而ε2和ε3与AD发病无关，这与文献报道一致，再次证实ApoE ε4是散发性及晚发家族性AD生物学危险因子之一的观点。多年研究表明ε4基因增加AD发病危险，而ε2有保护作用，降低发病危险〔6〕。但有的带ApoE ε4基因甚至ε4纯合子的人到90岁仍未发生痴呆，提示其他因素在AD发病中也起重要作用。
因为ApoE ε4基因与AD发病有关联，我们进一步研究了不同ε4基因剂量在AD发病中的作用，发现随着ε4剂量递增，AD患病率增高，且发病年龄降低。有人报道晚发家族性AD患者中ε4拷贝数从0增至2个，AD患病率从20%增至90%〔8〕。也有研究认为ApoE ε4剂量作用在不同年龄阶段有差异，Murman等〔9〕也发现带有ε4基因者在55～75岁出现AD症状的可能性大一些，而在AD发病年龄的两端，非ApoE 因素更具有决定意义，这支持ApoE ε4基因不是早发家族性AD发病危险因子和AD发病机制中多因素相互作用的观点。
, 百拇医药
总之，通过对ApoE 等位基因和ε4基因剂量与AD的相关性研究表明ε4基因与AD发病密切相关。但ApoE 及其基因在AD发病中的确切机制尚不清楚，这也正是研究的热点。(编辑 曲 莉)
卫生部科研基金资助项目课题
作者简介：岳培彬，男，26岁，在读博士研究生
崔行，男，53岁，教授，硕士生导师，研究方向：老年性痴呆发病机理及早期诊断
参考文献
1，Weisgraber KH,Rall SC,Mahley RW.Human E apoprotein heterogeneity:Cystein-arginine interchanges in the amino acid sequence of the ApoE isoforms.J Biol Chem，1981；256(17)：9077
, 百拇医药
2，Gareia MA,Vazquez J,Gimenez C et al.Transcription factor AP-2 regulates human apolipoprotein E gene expression in astrocytoma cells.J Neurosci，1996；16(23)：7 550
3，Tapila T,Lehtovirta M,Ramberg J et al.CSF tau is related to apolipoprotein E genotype in early Alzheimer's disease.Neurology，1998；50：169
4，Metzger RE,LaDu MJ,Pan JB et al.Neurons of the human frontal cortex display apolipoprotein E immunoreactivity:Implication for Alzheimer's disease.J Neuropathol Exp Neurol，1996；55(3)：372
, 百拇医药
5，Hixson JE,Vernier DT.Restriction isotyping of human apolipoprotien E by gene amplification and cleavage with HhaI.J Lipid Res，1990；31：545
6，Pericak-Vance MA,Johnson CC,Rimmler JB et al.Alzheimer disease and apolipoprotein E-4 allele in an Amish population.Ann Neurol，1996；39(6)：700
7，Fabian VA,Jones TM,Wilton SD et al.Alzheimer's disease and apolipoprotein E genotype in western Australia:An autopsy-verified series.Med J Aust,1996；165(2)：77
, 百拇医药
8，Corder EH,Saunders AM,Strittmatter WJ et al.Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families.Science，1993；261：921
9，Murman DL,Foster NL,Kilgore SP et al.Apolipoprotein E and Alzheimer's disease:Strength of association is realted to age at onset.Dementia，1996；7(5)：251
收稿日期：1999-09-29, 百拇医药
单位：山东医科大学生物化学教研室，济南 250012
关键词：Alzheimer病；载脂蛋白E；基因型；多态性
中国老年学杂志000501摘 要 目的 研究中国老龄人群ApoE等位基因与Alzheimer病(AD)发病危险性的关系。方法 选取22例散发性AD患者和64例正常老年人做为研究对象，采用聚合酶链式反应(PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)方法鉴定载脂蛋白E(ApoE)基因型，分析ApoE等位基因及ε4基因剂量与AD发病的关系。结果 ApoE ε4等位基因与AD发病关系密切，AD患者中ε4基因频率较正常对照明显增高，且随着ε4基因剂量增加，AD患病率增高，发病年龄降低。结论 ApoE ε4等位基因与AD发病有关，是散发性AD发病的危险因子之一。
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Calcitonin gene-related peptide(CGRP) expression in plasma of the patients with cerebrovascular disorder
Chen Qinhui,Ren Hui,Jiang Ligang et al
(Department of Neurology,Second Affiliated Hospital,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130041)
Absract：Objective To explore the role of CGRP in the pathogenesis of cerebrovascular disorder(CVD).Methods The changes of plasma CGRP in patients with CVD were determined by radioimmunoassay.Results The levels of plasma CGRP in acute cerebral infarction(CI) group were significantly lower than those after recovery and controls(P<0.01),The levelsof CGRP in severe group were significantly lower than those in light and moderate groups(P<0.01),but were significantly higher with hypertension than those without hypertension(P<0.01); The levels of plasma CGRP in acute cerebra hemorrhage(CH) were significantly higher than those at recovery stage and the controls(P<0.01). The highest levels of CGRP were those with severe condition,but with difference between groups with or without hypertension.Conclusions CGRP is involved in pathophysiological course of CVD. The changes of CGRP can be used to judge the severity of CVD,the effects of intervention and the prognosis.
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Key words Cerebral infarction Cerebral hemorrhage Calcitonin gene-related peptide
人载脂蛋白E(ApoE)是含299个氨基酸残基的分泌性糖蛋白，其基因位于第19号染色体上，约3.7 kb，含4个外显子和3个内含子。ApoE基因呈现多态性，其3个等位基因ε2、ε3、ε4分别编码ApoE 3种主要异构体E2、E3和E4。这3种异构体多肽链第112位和第158位氨基酸残基不同，E2均为半胱氨酸(Cys)，E4均为精氨酸(Arg)，E3第112位为Cys，第158位为Arg。ApoE 3个等位基因组合产生6种基因型ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4、ε3/4，对应存在6种遗传表型E2/2、E3/3、E4/4、E2/3、E2/4、E3/4〔1〕。正常人群中的ApoE基因型分布以ε3/3最多，ε2/2或ε4/4最少。ApoE是血浆脂蛋白重要组分之一，主要在肝脏合成，中枢神经系统中主要由星形胶质细胞合成和分泌〔2〕，在体内脂质代谢和神经系统发育及损伤修复过程中均起着重要作用〔3，4〕。
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近年来研究发现ApoE及其基因与散发性及晚发家族性Alzheimer病(AD)发病有十分密切的关系，为此我们分析ApoE基因多态性，以研究中国人群中ApoE等位基因与AD发病的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象 根据美国精神疾病诊断和统计手册第3版修订版(DSM-Ⅲ-R)痴呆诊断标准和Folstein简短精神状态检查法(MMSE)作出痴呆诊断；根据病史和脑影像学检查排除脑血管病、外伤等其他病因；再根据NINCDS-ADRDA的Alzheimer病临床诊断标准作出AD的诊断。AD患者22例，随机选择，无血缘关系，经两名副主任以上临床医师共同诊断认定。其中男性9例，女性13例；平均年龄73.4±7.5岁，发病年龄70.1±8.5岁。选择64例与上述患者无血缘关系的正常老年人为对照组，其中男性32例，女性32例，平均年龄60.9±6.2岁。
1.2 基因组DNA的提取 取新鲜抗凝血，分离出淋巴细胞，按常规方法提取基因组DNA。
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1.3 聚合酶链式反应(PCR)扩增ApoE基因〔5〕 ApoE基因扩增采用如下引物序列：上游引物：5′-AGAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-3′和下游引物：5′-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3′，扩增ApoE基因第4外显子中含多态性位点的DNA片段，扩增产物长度244 bp。PCR反应体系50 μl，包括0.5 μg基因组DNA，4种dNTPs各250 μmol/L，引物各1 μmol/L，10%二甲亚砜，Taq DNA聚合酶2.5单位。反应体系用50 μl石蜡覆盖，94℃预变性4 min，然后按94℃变性1 min→65℃退火1 min→72℃延伸1 min进行35个循环，最后72℃再延伸7 min。
1.4 ApoE基因限制性片段长度多态性分析〔5〕 取扩增产物5 μl，用2%琼脂糖凝胶电泳检测目的DNA片段，剩余产物纯化后加入6单位HhaⅠ内切酶及其缓冲液，37℃消化4～5 h。然后用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物片段，溴化乙锭染色后在紫外透射反射仪下观察DNA带型，按照Hixson的方法进行ApoE基因分型(见图1)。
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图1 15%PAGE显示的6种ApoE基因型
限制性酶切片多态性
2 结 果
2.1 ApoE等位基因频率分布 根据ApoE基因型频数，利用基因计数方法统计AD患者和正常人ApoE 3种等位基因频率分布表(表1)。AD组ApoE等位基因频率分布与正常对照不同(χ2＝8.09，P<0.05)，AD患者中ε4基因频率增高，而ε2和ε3频率与正常对照间无差异。
2.2 ApoE 等位基因与AD相关分析 应用相对危险度(RR)分析分别计算ApoE 3个等位基因与AD的相关程度，表明ApoE ε4基因与AD发病有关联(表2)，而ε2和ε3与AD发病无关联(RR值分别为0.61、0.31，P>0.05)。
2.3 ApoE ε4基因剂量与AD发病的关系 因为ApoE 基因与AD发病有关联，我们将AD患者按不含ε4基因、含1个ε4基因和含2个ε4基因分为3组，分别计算了他们的患病率和发病年龄，进一步分析了不同ε4基因剂量在AD发病中的作用(表3)。分析表明随着ε4基因剂量增加，AD患病率增高，同时发病年龄降低。
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表1 AD及正常人ApoE等位基因频率分布(%) 组别
例数
年龄(岁)
(ApoE)/()
ε2
ε3
ε4
AD
22
73.4±7.5
4.5
70.5
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正常对照
64
60.9±6.2
7.8
83.6
8.6
1)与正常对照比较，χ2＝7.90，P<0.05表2 ApoE ε4等位基因与AD发病的相关性分析 组别
例数
含ApoE ε4例数
RR值
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U
P值
AD
22
9
3.74
2.45
<0.05
正常对照
64
10
表3 ApoE ε4基因剂量与AD发病的关系 组别
例数
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AD例数
患病率(%)
发病年龄
不含ε4基因
67
13
19.4
73.8±6.8
含1个ε4基因
16
7
43.81)
65.8±8.42)
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含2个ε4基因
3
2
66.71)
61.0±8.52)
1)与不含ε4者比较χ2检验，P<0.05；2)与不含ε4相比，t检验P<0.05
3 讨 论
AD是一种复杂的异质性神经失调，是老年性痴呆的最重要类型，发病与多种因素有关，其中遗传因素起着非常重要的作用。已发现与AD发病有关的基因位点有4个，分别位于第1、14、19和21号染色体上〔6〕。近年来研究发现人ApoE 基因位点的遗传存在不平衡现象。虽然AD患者中ApoE 基因型分布与正常人群趋势相似，但ε4等位基因频率增高。Fabian等〔7〕对澳大利亚50例经尸检证实为AD的回顾性研究发现ε4基因频率显著高于对照组，且50%为ε4纯合子，12%为ε4杂合子。我们分析中国散发性AD患者ApoE 等位基因频率，也发现其ε4频率较对照明显增高，ε2和ε3频率虽与对照组相比降低，但无统计学意义，与以往报道基本一致。
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ApoE 对AD易感性的影响在许多种族和种群中已被证实，我们应用RR研究ApoE等位基因与AD相关性，也发现ε4基因与AD发病有显著关联，而ε2和ε3与AD发病无关，这与文献报道一致，再次证实ApoE ε4是散发性及晚发家族性AD生物学危险因子之一的观点。多年研究表明ε4基因增加AD发病危险，而ε2有保护作用，降低发病危险〔6〕。但有的带ApoE ε4基因甚至ε4纯合子的人到90岁仍未发生痴呆，提示其他因素在AD发病中也起重要作用。
因为ApoE ε4基因与AD发病有关联，我们进一步研究了不同ε4基因剂量在AD发病中的作用，发现随着ε4剂量递增，AD患病率增高，且发病年龄降低。有人报道晚发家族性AD患者中ε4拷贝数从0增至2个，AD患病率从20%增至90%〔8〕。也有研究认为ApoE ε4剂量作用在不同年龄阶段有差异，Murman等〔9〕也发现带有ε4基因者在55～75岁出现AD症状的可能性大一些，而在AD发病年龄的两端，非ApoE 因素更具有决定意义，这支持ApoE ε4基因不是早发家族性AD发病危险因子和AD发病机制中多因素相互作用的观点。
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总之，通过对ApoE 等位基因和ε4基因剂量与AD的相关性研究表明ε4基因与AD发病密切相关。但ApoE 及其基因在AD发病中的确切机制尚不清楚，这也正是研究的热点。(编辑 曲 莉)
卫生部科研基金资助项目课题
作者简介：岳培彬，男，26岁，在读博士研究生
崔行，男，53岁，教授，硕士生导师，研究方向：老年性痴呆发病机理及早期诊断
参考文献
1，Weisgraber KH,Rall SC,Mahley RW.Human E apoprotein heterogeneity:Cystein-arginine interchanges in the amino acid sequence of the ApoE isoforms.J Biol Chem，1981；256(17)：9077
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2，Gareia MA,Vazquez J,Gimenez C et al.Transcription factor AP-2 regulates human apolipoprotein E gene expression in astrocytoma cells.J Neurosci，1996；16(23)：7 550
3，Tapila T,Lehtovirta M,Ramberg J et al.CSF tau is related to apolipoprotein E genotype in early Alzheimer's disease.Neurology，1998；50：169
4，Metzger RE,LaDu MJ,Pan JB et al.Neurons of the human frontal cortex display apolipoprotein E immunoreactivity:Implication for Alzheimer's disease.J Neuropathol Exp Neurol，1996；55(3)：372
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5，Hixson JE,Vernier DT.Restriction isotyping of human apolipoprotien E by gene amplification and cleavage with HhaI.J Lipid Res，1990；31：545
6，Pericak-Vance MA,Johnson CC,Rimmler JB et al.Alzheimer disease and apolipoprotein E-4 allele in an Amish population.Ann Neurol，1996；39(6)：700
7，Fabian VA,Jones TM,Wilton SD et al.Alzheimer's disease and apolipoprotein E genotype in western Australia:An autopsy-verified series.Med J Aust,1996；165(2)：77
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8，Corder EH,Saunders AM,Strittmatter WJ et al.Gene dose of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families.Science，1993；261：921
9，Murman DL,Foster NL,Kilgore SP et al.Apolipoprotein E and Alzheimer's disease:Strength of association is realted to age at onset.Dementia，1996；7(5)：251
收稿日期：1999-09-29, 百拇医药