消化道肿瘤多药耐药机制研究进展
作者：韩雨生 梁力建 黄洁夫
单位：510080 广州市，中山医科大学附属第一医院肝胆外科
关键词：
实用医学杂志000544 化疗是消化道肿瘤术后或晚期肿瘤的重要治疗手段之一。由于多药耐药(multidrug resistance，MDR)基因的高表达使消化道肿瘤对大多化疗药耐药，近年对消化道肿瘤MDR基因调控表达的实验和临床研究为消化道肿瘤的化疗开辟了新的领域。本文就近几年在消化道肿瘤中耐药机制的研究进展作一综述。
1 P-糖蛋白在消化道正常组织及肿瘤组织中的表达及功能
许多ATP结合的运输超家族，即MDR1基因产物P-糖蛋白(P-gp)，常表达于各种不同的组织，从高到中度地表达在胆管肝细胞、小肠粘膜细胞、胰小管及胃肠的上皮细胞，因此认为P-gp对化疗的耐药作为细胞浆的解毒作用与其正常的生理功能交叉。有可能P-糖蛋白与内源性代谢产物和外菌素的跨上皮转运相关，特别是小肠，作为一种屏障防止毒性产物的摄取。而且，从最近体外实验观察提示，P-gp的其它特殊的功能，包括：亚细胞药物分布、容量调节和ATP通道的活动[1]。
, 百拇医药
由于正常结肠、胰腺和肝脏组织表达P-糖蛋白，因此这些组织分化的肿瘤相对耐受化疗。殷丽明等[2]采用RT-PCR检测胃及贲门癌，食管癌，大肠癌，乳腺癌，甲状腺癌，肺癌中MDR1基因表达情况，阳性表达率分别为33.3%，37.0%，31.3%，13.2%，40.0%，55.5%。作者认为临床上常见MDR1基因在恶性实性肿瘤组织中有较高的原发性表达，提示化疗时要区别对待，合理选药。Huang[3]用狭线杂交法分析6例已治疗和10例未治疗肝癌患者，其MDR1 mRNA水平在肿瘤组织比正常组织高，5例(占治疗83%)患者曾用丝裂霉素、阿霉素化疗后在临床上对其它化疗产生耐药。
2 MDR1基因及基因产物P-gp的表达调控
2.1 癌基因与抑癌基因 对于癌基因和抑癌基因在MDR1的表达调控机制到目前尚未完全弄清，但倾向于认为细胞发展耐药性的早期有糖蛋白的过度表达即没有明显的基因扩增和典型的细胞遗传学改变。基因激活比基因扩增更是耐药性增加的机制。Thottassery等[4]报道了p53调节MDR1基因的表达引起选择性的化疗耐药。因此，认为在癌症中p53功能的失活因其上调MDR1基因的表达导致选择性对化疗药耐药。癌基因mdm2作为p53基因的拮抗基因，可通过抑制p53基因产物的转录激活功能，使之失去抑制肿瘤发生发展的能力。已经发现在很少发生p53基因点突变的恶性肿瘤患者，常有较高比率的mdm2基因的高表达。由此推测，mdm2基因可能与MDR1基因的活化有关[5]。
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2.2 转录因子 启动子缺失分析表明，包含GC盒和Y盒的-110下游序列影响基本启动子活性[6]。体外转录结果也表明，转录起始点附近+5～+127的区域影响MDR1启动子的转录效率。研究表明：转录激活因子SP-1和EGR-1与启动子下游(-61～-43)GC盒的特异结合部位重叠，而且SP-1能够激活MDR1启动子。Y盒结合蛋白是一类高度保守的蛋白，参与转录和翻译的调节，但其功能仍很不清楚。YB-1作为Y盒结合蛋白的一员，在环境应激的培养细胞中YB-1 mRN水平上调，认为YB-1参与调节MDR1基因的表达[7]。上述结果表明，与MDR1转录起始序列、GC盒、Y盒、CCAT盒结合的转录因子是转录调控研究的热点，而且这些转录因子通过与其他上游调节子和增强子的作用，在控制MDR1组织特异性表达中可能起关键作用。
2.3 蛋白激酶 蛋白激酶在MDR1表达调控机制中的作用应给予极大关注。蛋白激酶可被二酰基甘油(DAG)、三磷酸肌醇(1P3)、钙离子(Ca2+)、佛波酯(TPA)和磷脂等激活，并转位到膜或细胞核，转位后能继续保持磷酸化活性，同时PKC可使其下游底物磷酸化和活化。Cheng等[8]发现在临床上可使用浓度2.5μ M的三苯氧胺显示增加红霉素对Hep3B细胞的细胞毒及凋亡作用。然而，在这种浓度的三苯氧胺协同的细胞毒效应并不由MDR基因的抑制物调节。相反，通过Western印迹和免疫荧光研究，三苯氧胺抑制胞浆膜蛋白激酶-α的转位。TPA能重建蛋白激酶-α的膜转位，并阻断三苯氧胺的协同细胞毒性作用。作者也提示三苯氧胺并不直接影响蛋白激酶-α的酶活性，而且，其它膜结合蛋白，如Ras蛋白的膜转位可相似的被三苯氧胺抑制，但并不被加入TPA重建。这些资料显示：三苯氧胺作用于胞浆膜，并由此抑制蛋白激酶-α的膜转位，而膜转位使蛋白激酶-α激活。因此认为通过蛋白激酶生物化学的调节作为一种措施提高肝癌的全身化疗值得进一步研究。
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2.4 药物逆转 在消化道肿瘤中化学药物对MDR调控的实验研究和临床应用比较多的是环孢菌素(CsA)和三苯氧胺，这些药物作为对MDR逆转剂起作用。Zacherl等[9]采用流式细胞分析技术研究了CsA，VER和PSC 833逆转高度耐药的肠腺癌HCT-8细胞株耐药的效果，发现PSC 833在较低浓度时(10 μ g/ml)仍具有抑制P-gp介导的将抗肿瘤药物排出细胞的功能，且CsA和PSC 833的逆转作用不受细胞内酸性低氧环境的影响。当pH值为6.8时，0.9 mmol/L的CsA和20.9 mmol/L PSC 833抑制抗肿瘤药物排出细胞的抑制率分别为52%和60%。而RS-VER和R-VER逆转耐药作用受pH值影响，当pH为6.8时，其抑制率为35%和23%，而当pH为7.5时，抑制率为50%和43%。Cheng等[8]认为口服VP 16加三苯氧胺治疗晚期肝癌副作用不大，约1/4患者有姑息治疗作用。
3 非典型多药耐药途径
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MDR基因的过度表达是导致多药耐药性的主要原因，但是体外细胞培养和体内模型研究发现存在其他的耐药机制，包括无P-gp增高的多药耐药，又称为非典型MDR，迄今发现谷胱甘肽解毒酶系统、DNA拓扑异构酶Ⅱ、多药抗药性相关蛋白、肺抗药性相关蛋白、金属硫蛋白等与消化道肿瘤的多药耐药有关。Takebayashi[10]报道食管鳞状上皮细胞癌MRP表达的阳性率比胃腺癌和大肠腺癌高；分化良好的癌症MRP表达的阳性率明显高于分化差的癌症。Peters等[11]发现表达P-gp的结肠癌伴有谷胱甘肽-S-转移酶表达增加。因为采用非MDR作用底物的5-FU化疗，在晚期病人有35%反应率，因此考虑有谷胱甘肽-S-转移酶耐药机制参与。
4 目前存在问题及展望
化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段，肿瘤细胞的耐药是导致化疗失败从而影响肿瘤疗效和预后的主要原因。已证明MDR1基因过度表达致P-gp主动泵出细胞内聚集的药物从而降低细胞内药物浓度是多药耐药性产生的主要机制。多药耐药逆转剂对消化道肿瘤的临床治疗效果并不理想，这一方面与常用的逆转剂有较大的毒副作用，以致于很难在体内达到有效的治疗浓度有关。另一方面与消化道肿瘤对当前使用的化疗药高度耐药有关，也可能与消化道正常组织表达P-gp有关。
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P-gp表达的增高可能随相关药物耐受的其它基因的表达而升高，因此可能存在对自然产物耐受的其它原因，包括拓扑异构酶Ⅱ和谷胱甘肽解毒酶等的表达，需要进一步的研究阐述它们的机制。
恶性肿瘤的形成及进展是一种牵涉到多种基因改变的复杂过程，虽然多药耐药和肿瘤进展的关系仍未完全清楚，但是有证据证明：数种基因改变和MDR1基因之间的相互作用可能是恶性肿瘤的内在组成部分。对于MDR基因表达调控机制的深入研究，特别是对MDR启动因子调控起作用的转录因子的研究，将会为治疗多药耐药肿瘤提供新的策略。
参考文献
1，Abraham EH,Prat AG,Gerweck L,et al. The multidrug resistance(mrdl)gene product functions as an ATP channel. Proc Natl Acad Sci,1993,90:312～316.
, 百拇医药
2，殷丽明，陈克能，李殿发，等. 常见恶性肿瘤新鲜组织中原发性多药耐药基因表达的初步研究. 中华肿瘤杂志，1997，19(6)：420～422.
3，Huang C,Wu M,Xu Q,et al. Overrexpression of the MDR1 gene and p-glycoprotein in human hepatocellular carcinoma. J Natl Cancer Inst,1992,84:262～265.
4，Thottassery JV,Zambetti GP,Arimori K,et al. p53-dependent regulation of MDR1 gene expression causes selective resistance to chemotherapeutic agents. Proc Natl Acad Sci,1997,94:11037～11042.
, 百拇医药
5，Bueso-Ramos CE,Yang Y,de Leon E,et al. The human mdm-2 oncogene is overexpressec in leukemias. Blood,1993,82(9):2617～2623.
6，Goldsmith ME,Madden MJ,Morrow CS,et al. A Y-box consensus sequence is required for basal expression of the human multidrug resistance gene. J Biol Chem,1993,268(8):5856～5860.
7，Ohga T,Uchiumi T,Makino Y，et al. Direct involvement of the Y-box binding pretein YB-1 in genotoxic stress-induced activation of the human multidrug resistance 1 gene. J Biol Chem,1998,273(11);5997～6000.
, http://www.100md.com
8，Cheng AL,Chuang SE,Fine RL,et al. Inhibition of the membrane translocation and activation of protein kinase C,and potentiation of doxorubicin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by tamoxifen. Biochem Pharmacol，1998,55(4):523～531.
9，Zacherl J,Hamilton G,Thalhammer T,et al. Inhibition of P-glycoprotein-mediated vinblastine transport across HCT-8 intestinal carcinoma monolayers by verapamil,cyclsporine A and SDZ PSC 833 in dependence on extracellular pH. Cancer Chemo Pharm,1994,34(2):125～132.
, 百拇医药
10，Takebayashi Y,Akiyama SI,Natsugoe S,et al. The expression of multidrug resistance protein in human gastrointestinal tract carcinomas. Cancer,1998,82(4):661～666.
11，Peters WHM,Boon CEW,Roelofs HMJ,et al. Expression of drug-metabolizing enzymes and p-170 glycoprotein in colorectal carcinoma and normal mucosa. Gastroenterology,1992,103:488., 百拇医药
单位：510080 广州市，中山医科大学附属第一医院肝胆外科
关键词：
实用医学杂志000544 化疗是消化道肿瘤术后或晚期肿瘤的重要治疗手段之一。由于多药耐药(multidrug resistance，MDR)基因的高表达使消化道肿瘤对大多化疗药耐药，近年对消化道肿瘤MDR基因调控表达的实验和临床研究为消化道肿瘤的化疗开辟了新的领域。本文就近几年在消化道肿瘤中耐药机制的研究进展作一综述。
1 P-糖蛋白在消化道正常组织及肿瘤组织中的表达及功能
许多ATP结合的运输超家族，即MDR1基因产物P-糖蛋白(P-gp)，常表达于各种不同的组织，从高到中度地表达在胆管肝细胞、小肠粘膜细胞、胰小管及胃肠的上皮细胞，因此认为P-gp对化疗的耐药作为细胞浆的解毒作用与其正常的生理功能交叉。有可能P-糖蛋白与内源性代谢产物和外菌素的跨上皮转运相关，特别是小肠，作为一种屏障防止毒性产物的摄取。而且，从最近体外实验观察提示，P-gp的其它特殊的功能，包括：亚细胞药物分布、容量调节和ATP通道的活动[1]。
, 百拇医药
由于正常结肠、胰腺和肝脏组织表达P-糖蛋白，因此这些组织分化的肿瘤相对耐受化疗。殷丽明等[2]采用RT-PCR检测胃及贲门癌，食管癌，大肠癌，乳腺癌，甲状腺癌，肺癌中MDR1基因表达情况，阳性表达率分别为33.3%，37.0%，31.3%，13.2%，40.0%，55.5%。作者认为临床上常见MDR1基因在恶性实性肿瘤组织中有较高的原发性表达，提示化疗时要区别对待，合理选药。Huang[3]用狭线杂交法分析6例已治疗和10例未治疗肝癌患者，其MDR1 mRNA水平在肿瘤组织比正常组织高，5例(占治疗83%)患者曾用丝裂霉素、阿霉素化疗后在临床上对其它化疗产生耐药。
2 MDR1基因及基因产物P-gp的表达调控
2.1 癌基因与抑癌基因 对于癌基因和抑癌基因在MDR1的表达调控机制到目前尚未完全弄清，但倾向于认为细胞发展耐药性的早期有糖蛋白的过度表达即没有明显的基因扩增和典型的细胞遗传学改变。基因激活比基因扩增更是耐药性增加的机制。Thottassery等[4]报道了p53调节MDR1基因的表达引起选择性的化疗耐药。因此，认为在癌症中p53功能的失活因其上调MDR1基因的表达导致选择性对化疗药耐药。癌基因mdm2作为p53基因的拮抗基因，可通过抑制p53基因产物的转录激活功能，使之失去抑制肿瘤发生发展的能力。已经发现在很少发生p53基因点突变的恶性肿瘤患者，常有较高比率的mdm2基因的高表达。由此推测，mdm2基因可能与MDR1基因的活化有关[5]。
, 百拇医药
2.2 转录因子 启动子缺失分析表明，包含GC盒和Y盒的-110下游序列影响基本启动子活性[6]。体外转录结果也表明，转录起始点附近+5～+127的区域影响MDR1启动子的转录效率。研究表明：转录激活因子SP-1和EGR-1与启动子下游(-61～-43)GC盒的特异结合部位重叠，而且SP-1能够激活MDR1启动子。Y盒结合蛋白是一类高度保守的蛋白，参与转录和翻译的调节，但其功能仍很不清楚。YB-1作为Y盒结合蛋白的一员，在环境应激的培养细胞中YB-1 mRN水平上调，认为YB-1参与调节MDR1基因的表达[7]。上述结果表明，与MDR1转录起始序列、GC盒、Y盒、CCAT盒结合的转录因子是转录调控研究的热点，而且这些转录因子通过与其他上游调节子和增强子的作用，在控制MDR1组织特异性表达中可能起关键作用。
2.3 蛋白激酶 蛋白激酶在MDR1表达调控机制中的作用应给予极大关注。蛋白激酶可被二酰基甘油(DAG)、三磷酸肌醇(1P3)、钙离子(Ca2+)、佛波酯(TPA)和磷脂等激活，并转位到膜或细胞核，转位后能继续保持磷酸化活性，同时PKC可使其下游底物磷酸化和活化。Cheng等[8]发现在临床上可使用浓度2.5μ M的三苯氧胺显示增加红霉素对Hep3B细胞的细胞毒及凋亡作用。然而，在这种浓度的三苯氧胺协同的细胞毒效应并不由MDR基因的抑制物调节。相反，通过Western印迹和免疫荧光研究，三苯氧胺抑制胞浆膜蛋白激酶-α的转位。TPA能重建蛋白激酶-α的膜转位，并阻断三苯氧胺的协同细胞毒性作用。作者也提示三苯氧胺并不直接影响蛋白激酶-α的酶活性，而且，其它膜结合蛋白，如Ras蛋白的膜转位可相似的被三苯氧胺抑制，但并不被加入TPA重建。这些资料显示：三苯氧胺作用于胞浆膜，并由此抑制蛋白激酶-α的膜转位，而膜转位使蛋白激酶-α激活。因此认为通过蛋白激酶生物化学的调节作为一种措施提高肝癌的全身化疗值得进一步研究。
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2.4 药物逆转 在消化道肿瘤中化学药物对MDR调控的实验研究和临床应用比较多的是环孢菌素(CsA)和三苯氧胺，这些药物作为对MDR逆转剂起作用。Zacherl等[9]采用流式细胞分析技术研究了CsA，VER和PSC 833逆转高度耐药的肠腺癌HCT-8细胞株耐药的效果，发现PSC 833在较低浓度时(10 μ g/ml)仍具有抑制P-gp介导的将抗肿瘤药物排出细胞的功能，且CsA和PSC 833的逆转作用不受细胞内酸性低氧环境的影响。当pH值为6.8时，0.9 mmol/L的CsA和20.9 mmol/L PSC 833抑制抗肿瘤药物排出细胞的抑制率分别为52%和60%。而RS-VER和R-VER逆转耐药作用受pH值影响，当pH为6.8时，其抑制率为35%和23%，而当pH为7.5时，抑制率为50%和43%。Cheng等[8]认为口服VP 16加三苯氧胺治疗晚期肝癌副作用不大，约1/4患者有姑息治疗作用。
3 非典型多药耐药途径
, http://www.100md.com
MDR基因的过度表达是导致多药耐药性的主要原因，但是体外细胞培养和体内模型研究发现存在其他的耐药机制，包括无P-gp增高的多药耐药，又称为非典型MDR，迄今发现谷胱甘肽解毒酶系统、DNA拓扑异构酶Ⅱ、多药抗药性相关蛋白、肺抗药性相关蛋白、金属硫蛋白等与消化道肿瘤的多药耐药有关。Takebayashi[10]报道食管鳞状上皮细胞癌MRP表达的阳性率比胃腺癌和大肠腺癌高；分化良好的癌症MRP表达的阳性率明显高于分化差的癌症。Peters等[11]发现表达P-gp的结肠癌伴有谷胱甘肽-S-转移酶表达增加。因为采用非MDR作用底物的5-FU化疗，在晚期病人有35%反应率，因此考虑有谷胱甘肽-S-转移酶耐药机制参与。
4 目前存在问题及展望
化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段，肿瘤细胞的耐药是导致化疗失败从而影响肿瘤疗效和预后的主要原因。已证明MDR1基因过度表达致P-gp主动泵出细胞内聚集的药物从而降低细胞内药物浓度是多药耐药性产生的主要机制。多药耐药逆转剂对消化道肿瘤的临床治疗效果并不理想，这一方面与常用的逆转剂有较大的毒副作用，以致于很难在体内达到有效的治疗浓度有关。另一方面与消化道肿瘤对当前使用的化疗药高度耐药有关，也可能与消化道正常组织表达P-gp有关。
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P-gp表达的增高可能随相关药物耐受的其它基因的表达而升高，因此可能存在对自然产物耐受的其它原因，包括拓扑异构酶Ⅱ和谷胱甘肽解毒酶等的表达，需要进一步的研究阐述它们的机制。
恶性肿瘤的形成及进展是一种牵涉到多种基因改变的复杂过程，虽然多药耐药和肿瘤进展的关系仍未完全清楚，但是有证据证明：数种基因改变和MDR1基因之间的相互作用可能是恶性肿瘤的内在组成部分。对于MDR基因表达调控机制的深入研究，特别是对MDR启动因子调控起作用的转录因子的研究，将会为治疗多药耐药肿瘤提供新的策略。
参考文献
1，Abraham EH,Prat AG,Gerweck L,et al. The multidrug resistance(mrdl)gene product functions as an ATP channel. Proc Natl Acad Sci,1993,90:312～316.
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2，殷丽明，陈克能，李殿发，等. 常见恶性肿瘤新鲜组织中原发性多药耐药基因表达的初步研究. 中华肿瘤杂志，1997，19(6)：420～422.
3，Huang C,Wu M,Xu Q,et al. Overrexpression of the MDR1 gene and p-glycoprotein in human hepatocellular carcinoma. J Natl Cancer Inst,1992,84:262～265.
4，Thottassery JV,Zambetti GP,Arimori K,et al. p53-dependent regulation of MDR1 gene expression causes selective resistance to chemotherapeutic agents. Proc Natl Acad Sci,1997,94:11037～11042.
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5，Bueso-Ramos CE,Yang Y,de Leon E,et al. The human mdm-2 oncogene is overexpressec in leukemias. Blood,1993,82(9):2617～2623.
6，Goldsmith ME,Madden MJ,Morrow CS,et al. A Y-box consensus sequence is required for basal expression of the human multidrug resistance gene. J Biol Chem,1993,268(8):5856～5860.
7，Ohga T,Uchiumi T,Makino Y，et al. Direct involvement of the Y-box binding pretein YB-1 in genotoxic stress-induced activation of the human multidrug resistance 1 gene. J Biol Chem,1998,273(11);5997～6000.
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8，Cheng AL,Chuang SE,Fine RL,et al. Inhibition of the membrane translocation and activation of protein kinase C,and potentiation of doxorubicin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by tamoxifen. Biochem Pharmacol，1998,55(4):523～531.
9，Zacherl J,Hamilton G,Thalhammer T,et al. Inhibition of P-glycoprotein-mediated vinblastine transport across HCT-8 intestinal carcinoma monolayers by verapamil,cyclsporine A and SDZ PSC 833 in dependence on extracellular pH. Cancer Chemo Pharm,1994,34(2):125～132.
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10，Takebayashi Y,Akiyama SI,Natsugoe S,et al. The expression of multidrug resistance protein in human gastrointestinal tract carcinomas. Cancer,1998,82(4):661～666.
11，Peters WHM,Boon CEW,Roelofs HMJ,et al. Expression of drug-metabolizing enzymes and p-170 glycoprotein in colorectal carcinoma and normal mucosa. Gastroenterology,1992,103:488., 百拇医药