全自动Hb琼脂糖凝胶电泳与Hb-F碱变性试验对Hb-F含量测定的比较分析
作者：何雅军 陈辉 黄玉华 杨小华 马福广
单位：510220 广州市红十字会医院检验科
关键词：血蛋白电泳；血红蛋白类；电泳，琼脂凝胶
实用医学杂志000541 摘 要 目的：比较全自动Hb电泳法与Hb-F碱变性试验法对Hb-F含量的检测结果，探讨全自动电泳法对Hb-F定量检测的意义。方法：采用全自动Hb琼脂糖凝胶电泳与Hb-F碱变性试验分别同时对同一标本进行Hb-F含量测定，比较二种方法对Hb-F含量的检测结果。结果：采用全自动Hb电泳法进行Hb-F测定，对于6个月以内的婴儿，完全可以分辨出清晰的Hb-F区带，且扫描定量与Hb-F碱变性试验相符。对于成人，如Hb-F碱变性试验Hb-F测定稍高者(含量>3.1%)，电泳仍隐约可辨Hb-F区带，扫描定量Hb-F含量与Hb-F碱变性试验基本一致；如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量在正常范围者(1.0%～3.0%)，电泳便分辨不出Hb-F区带，与Hb-A一起组成Hb-(A+F)区带。结论：全自动Hb琼脂糖凝胶电泳法能够分辨出Hb-F含量异常者，为地中海贫血的诊断提供重要数据。
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电泳分析是诊断和分离异常血红蛋白的有效方法，是诊断血红蛋白分子病不可缺少的手段[1]，但应用常规的醋酸纤维素薄膜在Hb电泳中，对Hb-F分辨力有一定的限制[2]。因而在进行Hb分析时往往需同时进行Hb-F碱变性试验来检测Hb-F含量，作为提供诊断地中海贫血的重要指标。我们实验室在引进美国Helena公司REP型全自动电泳分析系统对Hb做琼脂糖凝胶电泳时，发现其对Hb-F分辨力大为提高，在同时对同一样本做Hb-F碱变性试验，测定Hb-F含量异常时，全自动Hb电泳法可以分辨出Hb-F区带，并可扫描定量准确给出Hb-F含量。电泳扫描定量Hb-F含量与Hb-F碱变性试验结果相符。现将实验结果报道如下。
1 对象与方法
1.1 对象 为本院门诊、住院病人及体检血常规正常者，其中6个月以内婴儿70例，6个月以上至成人120例。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 仪器和试剂 全自动电泳分析系统REP型：由美国Helena公司生产，包括全自动光密度扫描仪EDC型。Hb电泳试剂：由美国Helena公司配套提供，按试剂操作说明使用。Hb-F碱变性试验用试剂：0.083 mol/L NaOH(pH 12.7)和半饱和硫酸铵溶液。
1.2.2 取血样本 按中华人民共和国卫生部医政司的《全国临床检验操作规程》中介绍的常规法制备Hb液。
1.2.3 全自动Hb电泳 按仪器操作进行，点样前，将制备好的Hb液经适当稀释(调整Hb含量8～12 g/L)后，分别加至加样杯中，由仪器定量加样于加样孔中，于仪器上20℃，500V电泳25 min，电泳完毕及时取出，置于仪器染色部位，选择相应程序后，由仪器全自动完成冲洗、染色、脱色及烘干等全过程。完后，电泳胶片直接在全自动密度扫描仪上(狭缝4 nm，波长595 nm)对各成份进行扫描定量，给出扫描图谱。
, http://www.100md.com 1.2.4 Hb-F碱变性试验 同时对电泳的每一份标本按《全国临床检验操作规程》进行Hb-F含量测定。
2 结果
6个月以内婴儿，由于Hb-F含量较高，电泳胶片上可看到Hb-A稍后的一条清晰的Hb-F区带(见电泳图谱示6)3，Hb-F扫描定量与Hb-F碱变性试验相符，见表1。如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量极度升高时，电泳胶片上也可见Hb-A稍后的一条清晰的Hb-F区带，见电泳图谱示5，Hb-F扫描定量与Hb-F碱变性试验相符，见表1。
成人中，如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量稍高于正常(超过3.1%)时，电泳胶片上仍隐约可见Hb-A稍后的Hb-F区带，且可扫描定量出Hb-F含量，结果与Hb-F碱变性试验相符，见电泳图谱示3，4及表1。如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量为正常时(参考范围1.0%～3.1%)，不管Hb-A2含量是否升高，电泳法都分辨不出Hb-F区带，与Hb-F一起组成Hb-(A+F)区带，见电泳图谱示1，2。
, 百拇医药
注：示1 正常成人Hb-A2正常，无Hb-F区带
示2 成人中Hb-A2升高，Hb-F碱变性试验Hb-F含量正常，图谱中分辨不出Hb-F区带
示3 成人中Hb-A2升高，Hb-F碱变性试验Hb-F含量稍高于正常，图谱中见一稍浅染Hb-F区带
示4 成人中Hb-A2升高，Hb-F碱变性试验Hb-F含量高于正常，图谱中见一浅染Hb-F区带
示5 成人中Hb-A2升高，Hb-F碱变性试验Hb-F含量极度增高，图谱中有一清晰Hb-F区带
示6 正常6个月以内婴儿，Hb-F区带清晰
, 百拇医药 3 讨论
Hb-F碱变性试验是测定Hb-F最常用的确证实验[4]，它是利用Hb-F抗碱能力比Hb-A强，在碱性溶液中，Hb-F不易变性沉淀，其它Hb在碱性溶液中可变性而被沉淀剂沉淀、过滤，测定滤液中Hb含量，即Hb-F含量，因而微量Hb-F都可测定出来。电泳法是根据不同Hb分子所带电荷不同，在电场中迁移率不同而达到分离Hb不同成份目的。经染色、脱色、固定，在一定波长下可扫描定量出各成份。在碱性pH条件下，用醋酸纤维素、琼脂糖凝胶等为载体，可电泳分离出正常Hb中Hb-A、A2和F成份。由于Hb-F与Hb-A等电点接近，通常与Hb-F分不开，但如果含量较大，与同时电泳的正常成人Hb比较，可以看出在Hb-A稍后的Hb-F区带。有文献报道，醋酸纤维素薄膜电泳法对Hb-F含量的敏感度大约在7.0%，而Hb-F含量少于6.5%时，醋酸纤维素薄膜电泳法时Hb-F含量的分析就失去意义了。我们采用Helena公司全自动琼脂糖凝胶电泳法在pH 8.6条件下对Hb电泳，发现其对Hb-F分辨力大为提高。对6个月以内的婴儿，由于其Hb中Hb-F较高，电泳中Hb-F区带清晰，且扫描定量与Hb-F碱变性试验相符。对于成人，如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量极度升高时，电泳中Hb-F区带象6个月以内婴儿的Hb-F区带，清晰可辨。如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量稍高于正常时，仍隐约可见Hb-A稍后的Hb-F区带，并可扫描定量，与Hb-F碱变性试验结果相符，测定出Hb-F含量增高。因为Hb-F含量增高是诊断地中海贫血的重要指标，因而实验中发现如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量在正常范围内时(含量1.0%～3.1%)，虽然电泳胶片上分辨不出Hb-F区带，与Hb-A一起组成Hb(A+F)区带，不能扫描定量给出Hb-F含量，但不影响Hb-F分析的临床意义。据此，我们认为采用全自动Hb琼脂糖凝胶电泳法基本可以代替Hb-F碱变性实验用于Hb-F含量增高时对地中海贫血的综合分析，使Hb分析简便、快捷。
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表1 全自动Hb电泳法与Hb-F碱变性试验测得的Hb-F含量的结果 Hb电泳图谱
示1
示2
示3
示4
示5
示6
Hb-F碱变性试验
2.4%
3.0%
3.2%
10.0%
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48.5%
68%
全自动Hb-F电泳法定量
不能定量
不能定量
3.6%
9.9%
49.8%
68.9%
图谱分析
分辨不出
Hb-F区带
分辨不出
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Hb-F区带
见一稍浅染
Hb-F区带
见一浅染
Hb-F区带
见一深染
Hb-F区带
见一深染
Hb-F区带
参考文献
1，朱忠勇，主编. 实用医学检验学. 北京：人民卫生出版社，1992. 87～105.
2，卢焕兴. 血红蛋白电泳法和Hb-F碱变性试验对Hb-F含量检测的对比分析. 医学检验进修杂志，1998，5(3)：110.
3，叶应妩，王毓三，主编. 全国临床检验操作规程. 第2版. 南京：东南大学出版社，1997. 58～63.
4，林其燧，文庆成，主译校. 临床化学诊断大全. 北京：北京大学出版社，1990. 1054., http://www.100md.com
单位：510220 广州市红十字会医院检验科
关键词：血蛋白电泳；血红蛋白类；电泳，琼脂凝胶
实用医学杂志000541 摘 要 目的：比较全自动Hb电泳法与Hb-F碱变性试验法对Hb-F含量的检测结果，探讨全自动电泳法对Hb-F定量检测的意义。方法：采用全自动Hb琼脂糖凝胶电泳与Hb-F碱变性试验分别同时对同一标本进行Hb-F含量测定，比较二种方法对Hb-F含量的检测结果。结果：采用全自动Hb电泳法进行Hb-F测定，对于6个月以内的婴儿，完全可以分辨出清晰的Hb-F区带，且扫描定量与Hb-F碱变性试验相符。对于成人，如Hb-F碱变性试验Hb-F测定稍高者(含量>3.1%)，电泳仍隐约可辨Hb-F区带，扫描定量Hb-F含量与Hb-F碱变性试验基本一致；如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量在正常范围者(1.0%～3.0%)，电泳便分辨不出Hb-F区带，与Hb-A一起组成Hb-(A+F)区带。结论：全自动Hb琼脂糖凝胶电泳法能够分辨出Hb-F含量异常者，为地中海贫血的诊断提供重要数据。
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电泳分析是诊断和分离异常血红蛋白的有效方法，是诊断血红蛋白分子病不可缺少的手段[1]，但应用常规的醋酸纤维素薄膜在Hb电泳中，对Hb-F分辨力有一定的限制[2]。因而在进行Hb分析时往往需同时进行Hb-F碱变性试验来检测Hb-F含量，作为提供诊断地中海贫血的重要指标。我们实验室在引进美国Helena公司REP型全自动电泳分析系统对Hb做琼脂糖凝胶电泳时，发现其对Hb-F分辨力大为提高，在同时对同一样本做Hb-F碱变性试验，测定Hb-F含量异常时，全自动Hb电泳法可以分辨出Hb-F区带，并可扫描定量准确给出Hb-F含量。电泳扫描定量Hb-F含量与Hb-F碱变性试验结果相符。现将实验结果报道如下。
1 对象与方法
1.1 对象 为本院门诊、住院病人及体检血常规正常者，其中6个月以内婴儿70例，6个月以上至成人120例。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 仪器和试剂 全自动电泳分析系统REP型：由美国Helena公司生产，包括全自动光密度扫描仪EDC型。Hb电泳试剂：由美国Helena公司配套提供，按试剂操作说明使用。Hb-F碱变性试验用试剂：0.083 mol/L NaOH(pH 12.7)和半饱和硫酸铵溶液。
1.2.2 取血样本 按中华人民共和国卫生部医政司的《全国临床检验操作规程》中介绍的常规法制备Hb液。
1.2.3 全自动Hb电泳 按仪器操作进行，点样前，将制备好的Hb液经适当稀释(调整Hb含量8～12 g/L)后，分别加至加样杯中，由仪器定量加样于加样孔中，于仪器上20℃，500V电泳25 min，电泳完毕及时取出，置于仪器染色部位，选择相应程序后，由仪器全自动完成冲洗、染色、脱色及烘干等全过程。完后，电泳胶片直接在全自动密度扫描仪上(狭缝4 nm，波长595 nm)对各成份进行扫描定量，给出扫描图谱。
, http://www.100md.com 1.2.4 Hb-F碱变性试验 同时对电泳的每一份标本按《全国临床检验操作规程》进行Hb-F含量测定。
2 结果
6个月以内婴儿，由于Hb-F含量较高，电泳胶片上可看到Hb-A稍后的一条清晰的Hb-F区带(见电泳图谱示6)3，Hb-F扫描定量与Hb-F碱变性试验相符，见表1。如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量极度升高时，电泳胶片上也可见Hb-A稍后的一条清晰的Hb-F区带，见电泳图谱示5，Hb-F扫描定量与Hb-F碱变性试验相符，见表1。
成人中，如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量稍高于正常(超过3.1%)时，电泳胶片上仍隐约可见Hb-A稍后的Hb-F区带，且可扫描定量出Hb-F含量，结果与Hb-F碱变性试验相符，见电泳图谱示3，4及表1。如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量为正常时(参考范围1.0%～3.1%)，不管Hb-A2含量是否升高，电泳法都分辨不出Hb-F区带，与Hb-F一起组成Hb-(A+F)区带，见电泳图谱示1，2。
, 百拇医药
注：示1 正常成人Hb-A2正常，无Hb-F区带
示2 成人中Hb-A2升高，Hb-F碱变性试验Hb-F含量正常，图谱中分辨不出Hb-F区带
示3 成人中Hb-A2升高，Hb-F碱变性试验Hb-F含量稍高于正常，图谱中见一稍浅染Hb-F区带
示4 成人中Hb-A2升高，Hb-F碱变性试验Hb-F含量高于正常，图谱中见一浅染Hb-F区带
示5 成人中Hb-A2升高，Hb-F碱变性试验Hb-F含量极度增高，图谱中有一清晰Hb-F区带
示6 正常6个月以内婴儿，Hb-F区带清晰
, 百拇医药 3 讨论
Hb-F碱变性试验是测定Hb-F最常用的确证实验[4]，它是利用Hb-F抗碱能力比Hb-A强，在碱性溶液中，Hb-F不易变性沉淀，其它Hb在碱性溶液中可变性而被沉淀剂沉淀、过滤，测定滤液中Hb含量，即Hb-F含量，因而微量Hb-F都可测定出来。电泳法是根据不同Hb分子所带电荷不同，在电场中迁移率不同而达到分离Hb不同成份目的。经染色、脱色、固定，在一定波长下可扫描定量出各成份。在碱性pH条件下，用醋酸纤维素、琼脂糖凝胶等为载体，可电泳分离出正常Hb中Hb-A、A2和F成份。由于Hb-F与Hb-A等电点接近，通常与Hb-F分不开，但如果含量较大，与同时电泳的正常成人Hb比较，可以看出在Hb-A稍后的Hb-F区带。有文献报道，醋酸纤维素薄膜电泳法对Hb-F含量的敏感度大约在7.0%，而Hb-F含量少于6.5%时，醋酸纤维素薄膜电泳法时Hb-F含量的分析就失去意义了。我们采用Helena公司全自动琼脂糖凝胶电泳法在pH 8.6条件下对Hb电泳，发现其对Hb-F分辨力大为提高。对6个月以内的婴儿，由于其Hb中Hb-F较高，电泳中Hb-F区带清晰，且扫描定量与Hb-F碱变性试验相符。对于成人，如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量极度升高时，电泳中Hb-F区带象6个月以内婴儿的Hb-F区带，清晰可辨。如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量稍高于正常时，仍隐约可见Hb-A稍后的Hb-F区带，并可扫描定量，与Hb-F碱变性试验结果相符，测定出Hb-F含量增高。因为Hb-F含量增高是诊断地中海贫血的重要指标，因而实验中发现如Hb-F碱变性试验测定Hb-F含量在正常范围内时(含量1.0%～3.1%)，虽然电泳胶片上分辨不出Hb-F区带，与Hb-A一起组成Hb(A+F)区带，不能扫描定量给出Hb-F含量，但不影响Hb-F分析的临床意义。据此，我们认为采用全自动Hb琼脂糖凝胶电泳法基本可以代替Hb-F碱变性实验用于Hb-F含量增高时对地中海贫血的综合分析，使Hb分析简便、快捷。
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表1 全自动Hb电泳法与Hb-F碱变性试验测得的Hb-F含量的结果 Hb电泳图谱
示1
示2
示3
示4
示5
示6
Hb-F碱变性试验
2.4%
3.0%
3.2%
10.0%
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48.5%
68%
全自动Hb-F电泳法定量
不能定量
不能定量
3.6%
9.9%
49.8%
68.9%
图谱分析
分辨不出
Hb-F区带
分辨不出
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Hb-F区带
见一稍浅染
Hb-F区带
见一浅染
Hb-F区带
见一深染
Hb-F区带
见一深染
Hb-F区带
参考文献
1，朱忠勇，主编. 实用医学检验学. 北京：人民卫生出版社，1992. 87～105.
2，卢焕兴. 血红蛋白电泳法和Hb-F碱变性试验对Hb-F含量检测的对比分析. 医学检验进修杂志，1998，5(3)：110.
3，叶应妩，王毓三，主编. 全国临床检验操作规程. 第2版. 南京：东南大学出版社，1997. 58～63.
4，林其燧，文庆成，主译校. 临床化学诊断大全. 北京：北京大学出版社，1990. 1054., http://www.100md.com