人脑星形细胞瘤中增殖细胞核抗原、p53、p2lras及EGFR蛋白的表达
作者：陈礼刚 曾凡俊 李讯 匡永勤 杨立斌 张建民 卢敏
单位：成都军区总医院神经外科 610083
关键词：星形细胞瘤；基因表达；免疫组化
重庆医学000502 摘 要 目的 探讨人脑星形细胞瘤中多种基因蛋白异常表达及意义。方法 应用免疫组化技术检测102例手术切除人脑星形细胞瘤组织标本中增殖细胞核抗原(PCNA)及p53、p21ras及EGFR蛋白的表达。结果 星形细胞瘤组织PCNA标记指数(PCNALI)为55.6±15.5，p53、p2lras及EGFR蛋白的表达率分别为58.6%、52.3%、42%，均显著高于正常脑组织。PCNALI及EGFR蛋白表达与星形细胞瘤恶性程度相关(P<0.01)，p53、p21ras蛋白的表达与星形细胞瘤恶性程度无关(P>0.05)。星形细胞瘤中PCNALI与EGFR蛋白表达无明显相关(P>0.05)，而与p53、p21ras表达相关(P<0.05)。结论 p53、p21ras、EGFR异常表达与星形细胞瘤的发生发展相关，PCNALI是评估星形细胞瘤增殖活性良好指标。
, 百拇医药
Expcessions of PCNA,p53,p12and EGFR Protein in Human Gliomas
Chen Ligang,Zeng Fanjun, Li Xun, et al.
(Department of Neurosurgery,Chengdu General Hospital of PLA,Chengdu 610083)
Abstract Objective:To investigate the signiflcance of multiple genetic expressions in the development and progress of human gliomas.Methods:The expressions of PCNA,p53,p21ras,EGFR were detected in 102 surgically resected glioma specimens with immunohistochemical technique.Results:It was found that PCNALI in glioma was 55.6±15.5 and expressions of p53, p21ras,EGFR proteins were 38.6% 52.3%,and 42% respectively.The PCNALI and expressions EGFR were correlated with the degree of malignancy of gliomas(P<0.05).The PCNALI was correlated with expressions of p53 and p21ras (P<0.05)Conclusion:These findings suggested that the abnormal expressions of p53,p21ras,EGFR were correlated with development and progreos of glioma and PCNA could reflect the degree of malignancy to a certain extent.
, 百拇医药
Key words:Astrocytoma Gene expression Immunohistochemistry
作者用ABC免疫组化法在同一张病理切片中对星形细胞瘤中增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、p53、p21ras、EGFR蛋白表达进行分析，探讨这些基因表达与星形细胞瘤发生发展的关系。
1 材料与方法
1.1 组织标本 收集本院1990～1997年手术切除星形细胞瘤标本的102例，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色并经病理诊断证实星形细胞瘤无疑(按WBO脑瘤分类)。另取14例正常脑细胞为对照。
1.2 试剂与染色方法 鼠抗人PCNA单克隆抗体为美国ZYMed公司产品，鼠抗人p53(D-1)、p21ras单克隆抗体为Dako公司产品，EGFR多克隆抗体为美国SANTA CRUZ公司产品，ABC试剂为Sigma公司产品。免疫组化参照文献[1]进行，具体染色步骤，石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱水，0.3%H2O2-甲醛阻断内源酶；将切片置0.01mol/L、pH6.0柠檬酸缓冲液中，于微波炉Defrost挡修复抗原15分钟，正常血清封闭，消除非特异性染色；加一抗(PCNA 1：180、p53 1:40、p21ras1:80、EGFR1：120)4℃过夜，再分别加入二抗及ABC复合物，室温反应1.5小时，DAB呈色。对照试验：阳性对照，用已知阳性片重复染色；阴性对照，正常脑组织片染色；替代对照，用正常羊血清替代一抗。
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1.3 结果判断 对照文献[2、3、4]和病理科医师一起判断PCNA、p53、p21ras及EGFR阳性细胞。其中PCNA阳性结果采用标记指数(Labeling index,LI)表达，以百分率表示，即随机计数1000个细胞中阳性细胞所占的百分比。
2 结 果
2.1 人星形细胞瘤中PCNA、p53、p21ras、EGFR表达 星形细胞瘤组织中PCNALI为55.6±15.5；p53、p21ras、EGFR蛋白阳性表达率分别为58.6%、52.3%、42%，正常脑组织中未发现确切的PCNA、p53、p21ras、EGFR阳性细胞，与文献报道相近。
2.2 PCNA、p53、p21ras及EGFR蛋白的表达与病理类型的关系 等级相关分析表明，PCNALI、EGFR与星形细胞瘤的级别呈正相关，见表1。
, 百拇医药
表1 正常脑组织、星形细胞瘤PCNA、p53、p21ras及EGFR的表达与病理分型(按WHO标准)的关系 病理类型
病例数
PCNALI 1)
P53
P21ras
EGFR2)
NB
14
0
0%
0%
0%
, 百拇医药
Ⅰ级
26
28.64±13.75
52.4%
49.5%
15.3%
Ⅱ级
28
45.7±22.1
57.8%
55.6%
38.7%
Ⅲ级
, http://www.100md.com
23
64.38±19.17
60.7%
48.7%
63.6%
Ⅳ级
25
83.7±6.99
62.8%
51.2%
72.2%
2.3 p53、p21ras、EGFR蛋白表达与PCNA的关系，见表2。
, 百拇医药
2.4 p53、p21ras、EGFR蛋白表达的相互关系 102例星形细胞瘤中，32例同时检出2和/或3中癌基因蛋白表达，其中同时表达p53、EGFR蛋白者24例，同时表达p53和p21ras蛋白10例，同时表达EGFR蛋白和p21ras蛋白14例，经配对计数资料x2 检验，以上3种蛋白无显著相关性(P>0.05)。
表2 p53、p21ras、EGFR蛋白表达与PCNA的关系 项 目
蛋白表达
例 数
PCNALI
p53
+
38
, 百拇医药
66.8±14.50 1)
-
64
41.9±17.50
p21ras
+
18
66.2±22.50 2)
-
11
48.6±18.8
EGFR
+
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70
52.3±19.9 3)
-
32
48.8±22.2
注：与相对应表达阴性比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01，(3)P<0.05
3 讨 论
癌基因和抑癌基因突变与表达是星形细胞瘤的研究热点之一，但其结果和意义有争议[3、4]。本研究发现，星形细胞瘤中既存在抑癌基因p53的失活，又存在癌基因p21ras激活，也存在PCNA及EGFR的表达异常。而且近1/3病例同时存在2种以上癌基因蛋白的表达，提示多种基因异常的逐渐累积可能与星形细胞瘤发生发展密切相关。
, 百拇医药
PCNA是存在于细胞核内的酸性蛋白，目前已将它视为S期细胞的标志物，用于细胞增殖动力学研究[5]。作者的研究发现，星形细胞瘤瘤细胞增殖活性显著高于正常脑组织，并且与星形细胞瘤恶性程度密切相关。本研究还发现p53、p21ras蛋白染色阳性组PCNALI显著高于染色阴性组(在p53、p21ras阳性的星形细胞瘤中，PCNA高表达率分别为66.8±14.5和66.0±22.5，显著高于阴性病例表达)，提示p53、p21ras蛋白的表达与细胞增殖密切相关。
EGFR基因扩展增作为胶质瘤最常见的遗传学异常之一，我们的研究也显示了其高表达率，且与恶性程度有关，与Pigott(1993)等[6]报道相似。作者研究还发现，EGFR表达与PCNA无明显相关，说明EGFR不是主要的促有丝分裂因子。但鉴于其表达与星形细胞瘤发生过程的密切相关性，一方面可以以基因工程手段封闭EGFR的mRNA表达，从而阻止星形细胞瘤后的恶性进展，这可能有助于星形细胞瘤的治疗。
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同步检测星形细胞瘤p53、p21ras、EGFR蛋白表达研究，目前鲜见报道[3、4、5、6]。本研究发现部分病例同时存在2种或3种上述蛋白表达，但经统计提示，三者表达并无显著相关性，说明三者的表达异常是相互独立的改变，各自通过不同途径在星形细胞瘤的发生发展中起作用。
上述结果提示，p53、p21ras、EGFR异常表达与星形细胞瘤的发生发展相关，PCNALI是评估星形细胞瘤增殖的良好指标。
参考文献
1，Haerslev T, Jacobsen GK.Microwave processing for immunohistochemical demonstration of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue.Apmis,1994,102(5):395
, 百拇医药
2，Vigliani MC,Chio A,Pezzulo T,et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in low grade astrocytomas:its prognostic significant.Tumori,1994,80:295
3，Van Meyll DJ,Ramsay DA, Casson AG,et al.p53 mutation,expression,and DNA ploidy in evolving gliomas:evidence for two pathways of progression.J Natl Cancer Inst,1994,86:1011
4，Mashigama S,Murakami Y,Yoshimoto T,et al.Detection of p53 gene mutation in human brain tumors by single strand contformation analysis of polymerase chain reaction produce.Oncogene,1991,6:1313
5，Kolodzieijcgzyk P,Yao TT,Oya M,et al.Long term follow-up study of patients with gastric adenomas with malignant transformation.Cancer,1994,74(11):2896
6，Pigott TT,Robson DK,Palmer J,et al.Expression of epidermal growth ractor receptor in human glioblastom multiforme.Br J Neurosurg,1993,7:261, http://www.100md.com
单位：成都军区总医院神经外科 610083
关键词：星形细胞瘤；基因表达；免疫组化
重庆医学000502 摘 要 目的 探讨人脑星形细胞瘤中多种基因蛋白异常表达及意义。方法 应用免疫组化技术检测102例手术切除人脑星形细胞瘤组织标本中增殖细胞核抗原(PCNA)及p53、p21ras及EGFR蛋白的表达。结果 星形细胞瘤组织PCNA标记指数(PCNALI)为55.6±15.5，p53、p2lras及EGFR蛋白的表达率分别为58.6%、52.3%、42%，均显著高于正常脑组织。PCNALI及EGFR蛋白表达与星形细胞瘤恶性程度相关(P<0.01)，p53、p21ras蛋白的表达与星形细胞瘤恶性程度无关(P>0.05)。星形细胞瘤中PCNALI与EGFR蛋白表达无明显相关(P>0.05)，而与p53、p21ras表达相关(P<0.05)。结论 p53、p21ras、EGFR异常表达与星形细胞瘤的发生发展相关，PCNALI是评估星形细胞瘤增殖活性良好指标。
, 百拇医药
Expcessions of PCNA,p53,p12and EGFR Protein in Human Gliomas
Chen Ligang,Zeng Fanjun, Li Xun, et al.
(Department of Neurosurgery,Chengdu General Hospital of PLA,Chengdu 610083)
Abstract Objective:To investigate the signiflcance of multiple genetic expressions in the development and progress of human gliomas.Methods:The expressions of PCNA,p53,p21ras,EGFR were detected in 102 surgically resected glioma specimens with immunohistochemical technique.Results:It was found that PCNALI in glioma was 55.6±15.5 and expressions of p53, p21ras,EGFR proteins were 38.6% 52.3%,and 42% respectively.The PCNALI and expressions EGFR were correlated with the degree of malignancy of gliomas(P<0.05).The PCNALI was correlated with expressions of p53 and p21ras (P<0.05)Conclusion:These findings suggested that the abnormal expressions of p53,p21ras,EGFR were correlated with development and progreos of glioma and PCNA could reflect the degree of malignancy to a certain extent.
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Key words:Astrocytoma Gene expression Immunohistochemistry
作者用ABC免疫组化法在同一张病理切片中对星形细胞瘤中增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、p53、p21ras、EGFR蛋白表达进行分析，探讨这些基因表达与星形细胞瘤发生发展的关系。
1 材料与方法
1.1 组织标本 收集本院1990～1997年手术切除星形细胞瘤标本的102例，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色并经病理诊断证实星形细胞瘤无疑(按WBO脑瘤分类)。另取14例正常脑细胞为对照。
1.2 试剂与染色方法 鼠抗人PCNA单克隆抗体为美国ZYMed公司产品，鼠抗人p53(D-1)、p21ras单克隆抗体为Dako公司产品，EGFR多克隆抗体为美国SANTA CRUZ公司产品，ABC试剂为Sigma公司产品。免疫组化参照文献[1]进行，具体染色步骤，石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱水，0.3%H2O2-甲醛阻断内源酶；将切片置0.01mol/L、pH6.0柠檬酸缓冲液中，于微波炉Defrost挡修复抗原15分钟，正常血清封闭，消除非特异性染色；加一抗(PCNA 1：180、p53 1:40、p21ras1:80、EGFR1：120)4℃过夜，再分别加入二抗及ABC复合物，室温反应1.5小时，DAB呈色。对照试验：阳性对照，用已知阳性片重复染色；阴性对照，正常脑组织片染色；替代对照，用正常羊血清替代一抗。
, http://www.100md.com
1.3 结果判断 对照文献[2、3、4]和病理科医师一起判断PCNA、p53、p21ras及EGFR阳性细胞。其中PCNA阳性结果采用标记指数(Labeling index,LI)表达，以百分率表示，即随机计数1000个细胞中阳性细胞所占的百分比。
2 结 果
2.1 人星形细胞瘤中PCNA、p53、p21ras、EGFR表达 星形细胞瘤组织中PCNALI为55.6±15.5；p53、p21ras、EGFR蛋白阳性表达率分别为58.6%、52.3%、42%，正常脑组织中未发现确切的PCNA、p53、p21ras、EGFR阳性细胞，与文献报道相近。
2.2 PCNA、p53、p21ras及EGFR蛋白的表达与病理类型的关系 等级相关分析表明，PCNALI、EGFR与星形细胞瘤的级别呈正相关，见表1。
, 百拇医药
表1 正常脑组织、星形细胞瘤PCNA、p53、p21ras及EGFR的表达与病理分型(按WHO标准)的关系 病理类型
病例数
PCNALI 1)
P53
P21ras
EGFR2)
NB
14
0
0%
0%
0%
, 百拇医药
Ⅰ级
26
28.64±13.75
52.4%
49.5%
15.3%
Ⅱ级
28
45.7±22.1
57.8%
55.6%
38.7%
Ⅲ级
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23
64.38±19.17
60.7%
48.7%
63.6%
Ⅳ级
25
83.7±6.99
62.8%
51.2%
72.2%
2.3 p53、p21ras、EGFR蛋白表达与PCNA的关系，见表2。
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2.4 p53、p21ras、EGFR蛋白表达的相互关系 102例星形细胞瘤中，32例同时检出2和/或3中癌基因蛋白表达，其中同时表达p53、EGFR蛋白者24例，同时表达p53和p21ras蛋白10例，同时表达EGFR蛋白和p21ras蛋白14例，经配对计数资料x2 检验，以上3种蛋白无显著相关性(P>0.05)。
表2 p53、p21ras、EGFR蛋白表达与PCNA的关系 项 目
蛋白表达
例 数
PCNALI
p53
+
38
, 百拇医药
66.8±14.50 1)
-
64
41.9±17.50
p21ras
+
18
66.2±22.50 2)
-
11
48.6±18.8
EGFR
+
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70
52.3±19.9 3)
-
32
48.8±22.2
注：与相对应表达阴性比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01，(3)P<0.05
3 讨 论
癌基因和抑癌基因突变与表达是星形细胞瘤的研究热点之一，但其结果和意义有争议[3、4]。本研究发现，星形细胞瘤中既存在抑癌基因p53的失活，又存在癌基因p21ras激活，也存在PCNA及EGFR的表达异常。而且近1/3病例同时存在2种以上癌基因蛋白的表达，提示多种基因异常的逐渐累积可能与星形细胞瘤发生发展密切相关。
, 百拇医药
PCNA是存在于细胞核内的酸性蛋白，目前已将它视为S期细胞的标志物，用于细胞增殖动力学研究[5]。作者的研究发现，星形细胞瘤瘤细胞增殖活性显著高于正常脑组织，并且与星形细胞瘤恶性程度密切相关。本研究还发现p53、p21ras蛋白染色阳性组PCNALI显著高于染色阴性组(在p53、p21ras阳性的星形细胞瘤中，PCNA高表达率分别为66.8±14.5和66.0±22.5，显著高于阴性病例表达)，提示p53、p21ras蛋白的表达与细胞增殖密切相关。
EGFR基因扩展增作为胶质瘤最常见的遗传学异常之一，我们的研究也显示了其高表达率，且与恶性程度有关，与Pigott(1993)等[6]报道相似。作者研究还发现，EGFR表达与PCNA无明显相关，说明EGFR不是主要的促有丝分裂因子。但鉴于其表达与星形细胞瘤发生过程的密切相关性，一方面可以以基因工程手段封闭EGFR的mRNA表达，从而阻止星形细胞瘤后的恶性进展，这可能有助于星形细胞瘤的治疗。
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同步检测星形细胞瘤p53、p21ras、EGFR蛋白表达研究，目前鲜见报道[3、4、5、6]。本研究发现部分病例同时存在2种或3种上述蛋白表达，但经统计提示，三者表达并无显著相关性，说明三者的表达异常是相互独立的改变，各自通过不同途径在星形细胞瘤的发生发展中起作用。
上述结果提示，p53、p21ras、EGFR异常表达与星形细胞瘤的发生发展相关，PCNALI是评估星形细胞瘤增殖的良好指标。
参考文献
1，Haerslev T, Jacobsen GK.Microwave processing for immunohistochemical demonstration of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue.Apmis,1994,102(5):395
, 百拇医药
2，Vigliani MC,Chio A,Pezzulo T,et al. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in low grade astrocytomas:its prognostic significant.Tumori,1994,80:295
3，Van Meyll DJ,Ramsay DA, Casson AG,et al.p53 mutation,expression,and DNA ploidy in evolving gliomas:evidence for two pathways of progression.J Natl Cancer Inst,1994,86:1011
4，Mashigama S,Murakami Y,Yoshimoto T,et al.Detection of p53 gene mutation in human brain tumors by single strand contformation analysis of polymerase chain reaction produce.Oncogene,1991,6:1313
5，Kolodzieijcgzyk P,Yao TT,Oya M,et al.Long term follow-up study of patients with gastric adenomas with malignant transformation.Cancer,1994,74(11):2896
6，Pigott TT,Robson DK,Palmer J,et al.Expression of epidermal growth ractor receptor in human glioblastom multiforme.Br J Neurosurg,1993,7:261, http://www.100md.com