丹参对人成骨细胞缺血-再灌注损伤的保护作用
作者：王福生 王立德 谷玲 宋淑云 洪新 李素凤
单位：王福生 王立德 谷玲 宋淑云 洪新(大连医科大学基础医学院骨科 116027)；李素凤(辽阳市辽阳县中医院 111200)
关键词：丹参；成骨细胞；缺血-再灌注损伤
中国现代医学杂志000501 目的：观察丹参对成骨细胞缺血-再灌注损伤的保护作用。方法：以人髂骨骨膜为材料进行成骨细胞的体外培养，经丹参预处理后，行模拟缺血-再灌注采用噻唑蓝比色法测定细胞的存活率。结果：预处理组成骨细胞的存活率明显高于对照组。结论：丹参对人成骨细胞缺血-再灌注有明显的保护作用。
分类号 R363.2
EXPERIMENTAL STUDY ON RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE
, http://www.100md.com
(RSM) FOR THE PROTECTION OF HUMAN OSTEOBLAST AGAINST
ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY IN VITRO
Wang Fusheng, Wang Lide, Gu Ling
First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011
Song Shuyun, Hong Xin
Basic Medical College of Dalian Medical University, Dalian 116027
, http://www.100md.com Li Shufeng
Traditional Chinese Medicine Hospital of Liaoyang Country Town, Lianyang 111200
[Abstract] Objective: To observe the effects of RSM precondition on human osteoblast being injuried by ischemia-reperfusion. Methods: Human osteoblasts were obtained by explanting the iliac periostenum cultured in DMEM media. Cultured osteoblasts were exposed to mimicking ischemia-reperfusion after a short time of RSM preconditioning. The cellular survival rate was determined with MTT method. Results: In preconditioning group, the osteoblast survival rate was significantly increased. Conclusion: RSM preconditioning can protect osteoblast against its ischemia-reperfusion injury.
, http://www.100md.com
Key words: Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM); Human osteoblast; Ischemia-reperfusion
骨坏死是临床常见的疑难病症之一，特别是创伤性骨坏死更为常见，其主要发病机制为缺血性损伤，而细胞的缺血性损伤是复杂的病理过程。缺血纠正后，细胞的损伤仍在继续[1，2]，这表明，缺氧再给氧存在更为严重的损伤，即缺血-再灌注损伤，我们制备了成骨细胞的缺血-再灌注损伤模型，观察了丹参预处理对成骨细胞缺血-再灌注损伤后成骨细胞存活率的影响。
1 材料与方法
1.1 骨膜源性成骨细胞的体外培养及细胞学鉴定[3～5]
以人髂骨骨膜为材料，采用植块培养法进行细胞培养，细胞经形态学观察，碱性磷酸酶(AKP)染色，上清液中骨钙素(BGP)放免分析证实为成骨细胞后用于实验。
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1.2 成骨细胞缺血-再灌注损伤模型的建立[6]
去除原培养液，换以混合氮气(95%N2+5%CO2)饱和的无糖Hank液，测PO2<0.7kPa。培养3h复制“缺血”模型，复灌时换用以混和空气饱和的DEME培养液，测PO2>17.0kPa，于CO2孵箱中培养。
1.3 实验分组与方法
取生长活跃的第3代成骨细胞，0.25%胰酶消化10min制成细胞悬液，按每孔104/ml接种于24孔培养板培养3d后用于实验。
实验随机分成3组：常规培养：按上述方法继续培养；缺血-再灌注损伤：常规培养4h后，行模拟缺血-再灌注损伤；丹参+缺血-再灌注损伤组：经0.4%浓度的丹参预处理4h后模拟缺血-再灌注损伤。
, 百拇医药
1.4 标本处理与指标测定
各组均于再灌注3h后进行细胞结果测定，细胞的增殖情况以噻唑蓝比色法测定的OD值(光吸收值)来表示，结果以
±s表示。
首先向每孔加入5mg/ml MTT[3-(4,5-二甲基-2噻唑-2，5-二苯基溴化四唑，Sigma公司]100μl。培养3h后，吸去孔内培养液，每孔加入500μl MTT溶解液使结晶溶解，2h后用自动酶标测定仪(测定波长570nm)测定各孔光吸收值。
1.5 统计学方法
实验结果借助于SPSS软件采用单因素方差分析的方法进行组间显著性比较。
2 结果
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2.1 用骨膜分离培养的成骨细胞形态特点
骨膜块培养5～7d即有新生细胞长出，为成纤维细胞型，贴壁生长，初时细胞形态多样化，但多为梭形，带有粗大突起，有些则为三角形、多角形，数日后变为长梭形、条索状，融合成片，分界较为模糊。细胞经传代后，形态与原代细胞无明显差异。HE染色细胞轮廓清晰，核内可见2～3个核仁(见图1)。
图1 人成骨细胞的HE染色 10×10
2.2 成骨细胞碱性磷酸酶的细胞化学染色
经AKP孵育液孵育及中性红复染后，多数细胞的胞质中可见棕褐色的细小颗粒，此为AKP阳性细胞，阴性细胞则胞质均匀一致，未见棕褐色颗粒物质。第3、5代细胞的AKP染色，其阳性率均在80%以上(见图2)。
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图2 人成骨细胞的AKP染色 10×1000
2.3 骨钙素的放免测定结果
A组(实验组)：BGP浓度为(17.9±11.12)ng/ml，培养72h后上清液中可检出较高浓度的BGP。B组(空白对照组)：未检测出BGP。
2.4 丹参预处理对成骨细胞缺血-再灌注损伤的保护作用
A组OD值为0.136±0.002，B组为0.072±0.001，C组为0.101±0.004。
统计学分析结果表明：A组与B、C组的细胞存活率有显著性差异(P<0.05)，亦即成骨细胞缺血-再灌注损伤模型可靠。B、C组成骨细胞的存活率有显著性差异(P<0.05)，亦即经丹参(0.4%)预处理后对成骨细胞缺血-再灌注损伤有明显的保护作用。
, 百拇医药
3 讨论
3.1 骨膜源性成骨细胞的体外培养及细胞学鉴定
骨外膜分为内外二层，外层较厚，由致密的结缔组织构成，细胞较少；内层疏松，含有较多的骨原细胞和成骨细胞为生发层，可以通过长期培养分离出成骨细胞[7]。本研究培养的细胞呈贴壁型生长，形态均匀一致，均为梭形或多角形，胞质透明颗粒少，单个核，核仁2～3个，具有多数学者报道的成骨细胞的形态特征[8，9]。本实验用骨膜分离培养出的细胞除具有典型的成骨细胞形态特征外，还具有较高的AKP活性及BGP特性，AKP是成骨细胞的标记酶，BGP是成骨细胞分泌的主要非胶原蛋白，二者均是成骨细胞的标记物，是成骨细胞的重要特征，因此从形态及功能上符合了成骨细胞生物学行为。
3.2 丹参预处理对成骨细胞缺血性损伤的保护作用
丹参注射液因对创伤组织具有活血化瘀作用而被广泛应用于临床，而且在体外实验中也观察到丹参能明显增加MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶(Alpase)活性，但对各生长期分化期的MC3T3-E1细胞内DNA合成均无影响[11]。徐荣辉等[12]也在丹参注射对鸡胚额骨分离细胞培养生长的影响实验中观察到丹参能促进成骨细胞样成熟，分泌胶原性物质和AKP，并使钙盐在胶原基质上沉积，形成骨小结节。但是过高浓度的丹参能导致成骨细胞生长的抑制，本实验观察到0.4%浓度的丹参对成骨细胞的缺血-再灌注损伤有明显的保护作用。
, 百拇医药
细胞的缺血性损伤是一个复杂的病理过程，有许多因素参与，包括缺氧和高能磷酸化合物的聚集。缺血纠正后，代谢趋向正常，而细胞损伤仍在继续[13，14]。这表明，在缺氧后再给氧，出现了更为严重的损伤，即缺血与再灌注损伤。缺血-再灌注损伤的发生机制尚未彻底阐明，目前认为自由基的作用和细胞内钙超负荷是缺血-再灌注损伤的重要发病环节[1，15]。通过自由基引发的脂质过氧化反应引起细胞死亡，而细胞内钙浓度与细胞受损程度密切相关，细胞内钙超负荷同样引起细胞严重的损伤。丹参不仅具有活血化瘀，改善微循环的作用，而被广泛应用于临床，而且研究表明其还有明显的“钙拮抗作用”[2，16]，可以阻止细胞外的Ca++进入细胞内。此外，许多实验还表明，丹参的多种成分对自由基有清除作用，特别是对氧自由基有很强的清除作用。因此推测本实验中丹参对成骨细胞缺血性损伤的保护机制可能为：钙离子拮抗作用；对氧自由基的清除作用。
骨坏死是临床常见病症，也是骨外科的疑难病症之一。特别是创伤性骨坏死更为常见，其主要发病机制为缺血性损伤。而且已有实验证明氧自由基代谢也参与了骨坏死的发病过程[17]。因此，将丹参应用于临床对骨坏死将起到一定的预防和治疗作用。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Rusell PC.再灌注损伤和氧自由基.国外医学创伤与外科基本问题分册，1989：10：209
2 Brilla CG,Zhou G,Masubarn L,et al.Collagen Metabolism in Cnltural aclult rat cardiac fibroblasts:Response to Argiotensin Ⅱ and Aldosterone.J mel cell cardial,1994;26:809～820
3 Nakahara H,Bruder SP,Goldberg VM,et al.In vivo osteochondrondrogenic potential of culture cell derived from the periosteum.Clin Orthop,1990;259:223
, http://www.100md.com
4 Nakara H,Bruder SP,Haynesworth SE,et al.Bone and cartilage formation in diffusion chambers by sulcultured cell derived from the periosteum.Bone,1990;11:181
5 杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1940：42
6 乌立晖，张宝仁，朱家麟，等.预处理对培养乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的机制.中华实验外科杂志，1998；5(15)：3，246～247
7 Marie PJ,Lomri A,Sabbagh A.et al.Culture and behavior of asteoblastic cells isolated from normal trabecular bone surface.In Vitro Cellular & Developmental Biology,1989;25:373
, http://www.100md.com
8 Marie PJ,Abderrahimomri,Aymansabbagin culture and behavior of osteoblastic cells normal trabecular bone surface.In Vitro,1989
9 Bettina Auf'mkolk.Hauschka PV.Schwar characterization of human bone cells in culture Tissue Int,1985;37:228
10 马述壮，王石麟.骨髂系统的结构与形态.见刘忠厚主编.骨质疏松学.北京：科学出版社，1998：121～123
11 丁 寅，相马俊一，山本照子，等.丹参对克隆化成骨细胞株MC3T3-E1细胞影响的实验研究.第四军医大学学报，1996；17(4)：261～263
, 百拇医药
12 徐荣辉，柴本甫，朱雅萍.丹参注射液对鸡胚额骨分离细胞培养生长影响的组织化学观察.中西医结合杂志，1991；11(11)：668～670
13 Perry MO,et al.Cellalar changes with gracled limb ischemia and reperfusion.J Vasc Surg,1984;1:536
14 Strock PE,et al.Microvascular changes in acutely ischemic rat muscle.Surg Gynecel Obstet,1969;129:1213
15 张万年.缺血-再灌注损伤的发生机制.见金惠铭主编.病理生理学.第4版.北京：人民卫生出版社，1997：146～150
16 Elios G,Eleftheriades MD,Alam G,et al.Cyclosporine A has nodirect eflect on collagen metabolism by cardiac fibroblasts in vivo.Circulntion,1993;86:1377～13863
17 郑召民，董天华.第七届国际骨坏死会议纪要.中华骨科杂志，1997；11(17):11,725, 百拇医药
单位：王福生 王立德 谷玲 宋淑云 洪新(大连医科大学基础医学院骨科 116027)；李素凤(辽阳市辽阳县中医院 111200)
关键词：丹参；成骨细胞；缺血-再灌注损伤
中国现代医学杂志000501 目的：观察丹参对成骨细胞缺血-再灌注损伤的保护作用。方法：以人髂骨骨膜为材料进行成骨细胞的体外培养，经丹参预处理后，行模拟缺血-再灌注采用噻唑蓝比色法测定细胞的存活率。结果：预处理组成骨细胞的存活率明显高于对照组。结论：丹参对人成骨细胞缺血-再灌注有明显的保护作用。
分类号 R363.2
EXPERIMENTAL STUDY ON RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE
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(RSM) FOR THE PROTECTION OF HUMAN OSTEOBLAST AGAINST
ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY IN VITRO
Wang Fusheng, Wang Lide, Gu Ling
First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011
Song Shuyun, Hong Xin
Basic Medical College of Dalian Medical University, Dalian 116027
, http://www.100md.com Li Shufeng
Traditional Chinese Medicine Hospital of Liaoyang Country Town, Lianyang 111200
[Abstract] Objective: To observe the effects of RSM precondition on human osteoblast being injuried by ischemia-reperfusion. Methods: Human osteoblasts were obtained by explanting the iliac periostenum cultured in DMEM media. Cultured osteoblasts were exposed to mimicking ischemia-reperfusion after a short time of RSM preconditioning. The cellular survival rate was determined with MTT method. Results: In preconditioning group, the osteoblast survival rate was significantly increased. Conclusion: RSM preconditioning can protect osteoblast against its ischemia-reperfusion injury.
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Key words: Radix Salviae Miltiorrhizae (RSM); Human osteoblast; Ischemia-reperfusion
骨坏死是临床常见的疑难病症之一，特别是创伤性骨坏死更为常见，其主要发病机制为缺血性损伤，而细胞的缺血性损伤是复杂的病理过程。缺血纠正后，细胞的损伤仍在继续[1，2]，这表明，缺氧再给氧存在更为严重的损伤，即缺血-再灌注损伤，我们制备了成骨细胞的缺血-再灌注损伤模型，观察了丹参预处理对成骨细胞缺血-再灌注损伤后成骨细胞存活率的影响。
1 材料与方法
1.1 骨膜源性成骨细胞的体外培养及细胞学鉴定[3～5]
以人髂骨骨膜为材料，采用植块培养法进行细胞培养，细胞经形态学观察，碱性磷酸酶(AKP)染色，上清液中骨钙素(BGP)放免分析证实为成骨细胞后用于实验。
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1.2 成骨细胞缺血-再灌注损伤模型的建立[6]
去除原培养液，换以混合氮气(95%N2+5%CO2)饱和的无糖Hank液，测PO2<0.7kPa。培养3h复制“缺血”模型，复灌时换用以混和空气饱和的DEME培养液，测PO2>17.0kPa，于CO2孵箱中培养。
1.3 实验分组与方法
取生长活跃的第3代成骨细胞，0.25%胰酶消化10min制成细胞悬液，按每孔104/ml接种于24孔培养板培养3d后用于实验。
实验随机分成3组：常规培养：按上述方法继续培养；缺血-再灌注损伤：常规培养4h后，行模拟缺血-再灌注损伤；丹参+缺血-再灌注损伤组：经0.4%浓度的丹参预处理4h后模拟缺血-再灌注损伤。
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1.4 标本处理与指标测定
各组均于再灌注3h后进行细胞结果测定，细胞的增殖情况以噻唑蓝比色法测定的OD值(光吸收值)来表示，结果以
±s表示。首先向每孔加入5mg/ml MTT[3-(4,5-二甲基-2噻唑-2，5-二苯基溴化四唑，Sigma公司]100μl。培养3h后，吸去孔内培养液，每孔加入500μl MTT溶解液使结晶溶解，2h后用自动酶标测定仪(测定波长570nm)测定各孔光吸收值。
1.5 统计学方法
实验结果借助于SPSS软件采用单因素方差分析的方法进行组间显著性比较。
2 结果
, http://www.100md.com
2.1 用骨膜分离培养的成骨细胞形态特点
骨膜块培养5～7d即有新生细胞长出，为成纤维细胞型，贴壁生长，初时细胞形态多样化，但多为梭形，带有粗大突起，有些则为三角形、多角形，数日后变为长梭形、条索状，融合成片，分界较为模糊。细胞经传代后，形态与原代细胞无明显差异。HE染色细胞轮廓清晰，核内可见2～3个核仁(见图1)。
图1 人成骨细胞的HE染色 10×10
2.2 成骨细胞碱性磷酸酶的细胞化学染色
经AKP孵育液孵育及中性红复染后，多数细胞的胞质中可见棕褐色的细小颗粒，此为AKP阳性细胞，阴性细胞则胞质均匀一致，未见棕褐色颗粒物质。第3、5代细胞的AKP染色，其阳性率均在80%以上(见图2)。
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图2 人成骨细胞的AKP染色 10×1000
2.3 骨钙素的放免测定结果
A组(实验组)：BGP浓度为(17.9±11.12)ng/ml，培养72h后上清液中可检出较高浓度的BGP。B组(空白对照组)：未检测出BGP。
2.4 丹参预处理对成骨细胞缺血-再灌注损伤的保护作用
A组OD值为0.136±0.002，B组为0.072±0.001，C组为0.101±0.004。
统计学分析结果表明：A组与B、C组的细胞存活率有显著性差异(P<0.05)，亦即成骨细胞缺血-再灌注损伤模型可靠。B、C组成骨细胞的存活率有显著性差异(P<0.05)，亦即经丹参(0.4%)预处理后对成骨细胞缺血-再灌注损伤有明显的保护作用。
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3 讨论
3.1 骨膜源性成骨细胞的体外培养及细胞学鉴定
骨外膜分为内外二层，外层较厚，由致密的结缔组织构成，细胞较少；内层疏松，含有较多的骨原细胞和成骨细胞为生发层，可以通过长期培养分离出成骨细胞[7]。本研究培养的细胞呈贴壁型生长，形态均匀一致，均为梭形或多角形，胞质透明颗粒少，单个核，核仁2～3个，具有多数学者报道的成骨细胞的形态特征[8，9]。本实验用骨膜分离培养出的细胞除具有典型的成骨细胞形态特征外，还具有较高的AKP活性及BGP特性，AKP是成骨细胞的标记酶，BGP是成骨细胞分泌的主要非胶原蛋白，二者均是成骨细胞的标记物，是成骨细胞的重要特征，因此从形态及功能上符合了成骨细胞生物学行为。
3.2 丹参预处理对成骨细胞缺血性损伤的保护作用
丹参注射液因对创伤组织具有活血化瘀作用而被广泛应用于临床，而且在体外实验中也观察到丹参能明显增加MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶(Alpase)活性，但对各生长期分化期的MC3T3-E1细胞内DNA合成均无影响[11]。徐荣辉等[12]也在丹参注射对鸡胚额骨分离细胞培养生长的影响实验中观察到丹参能促进成骨细胞样成熟，分泌胶原性物质和AKP，并使钙盐在胶原基质上沉积，形成骨小结节。但是过高浓度的丹参能导致成骨细胞生长的抑制，本实验观察到0.4%浓度的丹参对成骨细胞的缺血-再灌注损伤有明显的保护作用。
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细胞的缺血性损伤是一个复杂的病理过程，有许多因素参与，包括缺氧和高能磷酸化合物的聚集。缺血纠正后，代谢趋向正常，而细胞损伤仍在继续[13，14]。这表明，在缺氧后再给氧，出现了更为严重的损伤，即缺血与再灌注损伤。缺血-再灌注损伤的发生机制尚未彻底阐明，目前认为自由基的作用和细胞内钙超负荷是缺血-再灌注损伤的重要发病环节[1，15]。通过自由基引发的脂质过氧化反应引起细胞死亡，而细胞内钙浓度与细胞受损程度密切相关，细胞内钙超负荷同样引起细胞严重的损伤。丹参不仅具有活血化瘀，改善微循环的作用，而被广泛应用于临床，而且研究表明其还有明显的“钙拮抗作用”[2，16]，可以阻止细胞外的Ca++进入细胞内。此外，许多实验还表明，丹参的多种成分对自由基有清除作用，特别是对氧自由基有很强的清除作用。因此推测本实验中丹参对成骨细胞缺血性损伤的保护机制可能为：钙离子拮抗作用；对氧自由基的清除作用。
骨坏死是临床常见病症，也是骨外科的疑难病症之一。特别是创伤性骨坏死更为常见，其主要发病机制为缺血性损伤。而且已有实验证明氧自由基代谢也参与了骨坏死的发病过程[17]。因此，将丹参应用于临床对骨坏死将起到一定的预防和治疗作用。
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参 考 文 献
1 Rusell PC.再灌注损伤和氧自由基.国外医学创伤与外科基本问题分册，1989：10：209
2 Brilla CG,Zhou G,Masubarn L,et al.Collagen Metabolism in Cnltural aclult rat cardiac fibroblasts:Response to Argiotensin Ⅱ and Aldosterone.J mel cell cardial,1994;26:809～820
3 Nakahara H,Bruder SP,Goldberg VM,et al.In vivo osteochondrondrogenic potential of culture cell derived from the periosteum.Clin Orthop,1990;259:223
, http://www.100md.com
4 Nakara H,Bruder SP,Haynesworth SE,et al.Bone and cartilage formation in diffusion chambers by sulcultured cell derived from the periosteum.Bone,1990;11:181
5 杨景山.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1940：42
6 乌立晖，张宝仁，朱家麟，等.预处理对培养乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用的机制.中华实验外科杂志，1998；5(15)：3，246～247
7 Marie PJ,Lomri A,Sabbagh A.et al.Culture and behavior of asteoblastic cells isolated from normal trabecular bone surface.In Vitro Cellular & Developmental Biology,1989;25:373
, http://www.100md.com
8 Marie PJ,Abderrahimomri,Aymansabbagin culture and behavior of osteoblastic cells normal trabecular bone surface.In Vitro,1989
9 Bettina Auf'mkolk.Hauschka PV.Schwar characterization of human bone cells in culture Tissue Int,1985;37:228
10 马述壮，王石麟.骨髂系统的结构与形态.见刘忠厚主编.骨质疏松学.北京：科学出版社，1998：121～123
11 丁 寅，相马俊一，山本照子，等.丹参对克隆化成骨细胞株MC3T3-E1细胞影响的实验研究.第四军医大学学报，1996；17(4)：261～263
, 百拇医药
12 徐荣辉，柴本甫，朱雅萍.丹参注射液对鸡胚额骨分离细胞培养生长影响的组织化学观察.中西医结合杂志，1991；11(11)：668～670
13 Perry MO,et al.Cellalar changes with gracled limb ischemia and reperfusion.J Vasc Surg,1984;1:536
14 Strock PE,et al.Microvascular changes in acutely ischemic rat muscle.Surg Gynecel Obstet,1969;129:1213
15 张万年.缺血-再灌注损伤的发生机制.见金惠铭主编.病理生理学.第4版.北京：人民卫生出版社，1997：146～150
16 Elios G,Eleftheriades MD,Alam G,et al.Cyclosporine A has nodirect eflect on collagen metabolism by cardiac fibroblasts in vivo.Circulntion,1993;86:1377～13863
17 郑召民，董天华.第七届国际骨坏死会议纪要.中华骨科杂志，1997；11(17):11,725, 百拇医药