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编号:10220352
收缩和骨骼蛋白在培养LAM细胞的免疫组化学研究
http://www.100md.com 《中国地方病学杂志》 2000年第5期
     作者:于心语 于祖熙 于维汉

    单位:于心语(美国马里兰大学 生命科学学院,美国 20742);于祖熙(美国国立卫生研究院 心、肺、血液研究所 病理研究室,美国 20892-1518);于维汉(哈尔滨医科大学 克山病研究所,黑龙江 哈尔滨 150086)

    关键词:淋巴管肌脂瘤病;细胞培养;共聚焦显微镜

    中国地方病学杂志000501 [摘要] 目的 从形态学上判定淋巴管肌脂瘤病(Lymphangioleiomyomastosis,LAM)细胞与平滑肌细胞的关联性。方法 用荧光抗体染色法和激光共焦显微镜观察收缩蛋白在LAM细胞的分布。结果 α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chains,SMHC)、结蛋白(desmin)和非肌性肌球蛋白重链ⅡB(nonmuscle myosin heavy chain ⅡB,NMHC-ⅡB)存在于LAM细胞。结论 LAM细胞属平滑肌细胞类型。这为进一步研究激素及其它药物对LAM细胞收缩蛋白产生的影响奠定了基础。
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    [中图分类号] R733 [文献标识码] A [文章编号]1000-4955(2000)05-321-03

    Immunohistochemical study of contractile proteins in cultured Lymphangioleiomyomatosis cells

    YU Xin-yu,YU Zu-xi,YU Wei-han

    (College of Life Scienses University of Maryland,College park,MD 20742,USA)

    Abstract: Objective The purpose of this investigate was to analyze the morphology of Lymphangioleiomyomastosis (LAM) cells grown in culture and to identify the correlation between LAM cell and smooth muscle cell.Methods Fluorescence staining and confocal microscopy were used to study the distribution of contractile proteins in LAM cell.Results The results obtained showed the α-smooth muscle actin,smooth muscle myosin heavy chains,nonmuscle myosin heavy chain ⅡB,and desmin were present in LAM cells.Conclusions The results confirm the identification of LAM cells as smooth muscle cell and will help to serve as a base for comparisons with alterations that may be produced in these proteins by exposure of cultured LAM cells to hormones and other drugs.
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    Key words: Lymphangioleiomyomatosis; Cell culture; Confocal microscopy

    淋巴管肌脂瘤病(Lymphangioleiomyomatosis,LAM)为一种主要发生于哺乳期妇女的少见疾病,本病以肺部罹患为主,临床表现为慢性进展,肺组织多发性结节样变性及空洞形成,导致肺功能低下及气胸。肺以外器官淋巴系统亦可见本病发生,并常伴有血管肌脂瘤(angiomyolipomao)。本病的发病机制尚不清楚,多被认为与女性激素有关,病理组织学特征为类平滑肌细胞LAM细胞的异常增生[1]。目前治疗法为平衡女性激素和肺移植。

    近年来对本病的病因及治疗研究方面有许多进展,其中包括成功的在肺移植病人的肺组织中分离和培养出LAM细胞。LAM细胞株可被用在不同的培养状态下探讨病变的发生与发展以及对药物作用的反应。鉴于LAM细胞的分类和特征尚未阐明,做为上述研究的一部分,本文从LAM细胞的骨骼和收缩蛋白的表达入手,应用多重荧光免疫标记和激光共聚焦显微镜技术探讨其与正常平滑肌的关系,因此,这也是首次用分离培养的LAM细胞研究其收缩和骨骼蛋白。
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    1 材料与方法

    1.1 LAM细胞 利用种植培养法从2名女性病人肺移植手术中取得的肺组织里分离出LAM细胞,经培养达近单层状时,以4%福尔马林固定后,进行几种收缩蛋白的检测。

    1.2 荧光染色

    1.2.1 本实验应用间接荧光标记法进行免疫染色,所用第一抗体见表1。

    表1 第一抗体来源 第一抗体

    类型

    来源

    工作浓度(μg/ml)

    α-SMA

    SMHC
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    NMHC-ⅡB

    Desmin

    MM

    RP

    RP

    MM

    DAKO

    DAKO

    NHLBI

    BAKO

    20

    20

    10
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    20

    注:MM:鼠抗人单克隆抗体;RP:兔抗鼠多克隆抗体

    1.2.2 第二抗体为FITC(绿色荧光)标记的马抗鼠或羊抗兔IgG及Texas red(红色荧光)标记的羊抗兔IgG,均由Vector公司生产。核染为4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI,蓝色荧光),由Sigma公司生产。

    1.3 平滑肌肌动蛋白质染色 用与F-肌丝特异结合的Rhodamine-Phalloididn[2]标记(10 U/ml,Mo-

    lecular probes公司)LAM细胞,室温反应5 min,10 μg/ml的DAPI核染15 min,PBS清洗后,Vector Shiled(Vector)封片。

    1.4 免疫单荧光染色 固定后单层培养的LAM细胞,洗净后与5%正常马(用于α-SMA和Desmin)或羊(用于SMHC和NMHC-ⅡB)血清室温反应30 min,拭去组织上多余液体,加工作浓度的第一抗体于4℃过夜。用0.01mol/L pH 7.4的PBS清洗后(5 min,重复3次),与10 μg/ml第二抗体室温反应2 h,PBS清洗(5 min,重复3次),PBS清洗后核染、封片。
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    阴性对照用1 μg/ml的正常鼠或兔IgG代替第一抗体,操作程序相同。

    1.5 双重荧光染色 固定好的LAM细胞经PBS清洗后,加混合好的5%正常马和羊血清室温反应30 min,再与混合好的工作浓度的第一抗体(α-SMA和Desmin、α-SMA和NMHC-ⅡB、α-SMA和SMH-

    C)于4℃过夜。PBS清洗后,与混合好的终浓度为10 μg/ml的FITC标记的马抗鼠IgG和Texas red标记的羊抗兔IgG第二抗体室温反应2 h,PBS清洗,DAPI核染,Vector Shield封片(详细步骤同上)。

    Rhodamine-phalloidin和α-SMA的双重荧光染色时,先进行α-SMA单荧光染色,然后进行phalloidin直接标记法染色,DAPI复染,Vector Shiled封片。

    1.6 激光共聚焦显微镜观察 应用激光扫描共聚焦显微镜(Leica TCS-4D DMIRBE,装备有紫外和可视光氩氪混合气体激光光源)观察荧光染色结果。受检收缩蛋白与标记有荧光染料的特殊抗体结合后,共聚焦显微镜可以清晰记录512×512像素的数字化图像,特异地显示该蛋白质的形态、结构和定位。应用不同荧光染料的双重荧光染色和计算机图像重叠技术可以比较同一细胞的2种蛋白的共同定位级差异。另外,亦可在不同焦点层次进行连续扫描,利用计算机图像重组方法显示细胞不同区域的蛋白三维定位差异。
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    2 结果

    2.1 LAM细胞常规形态学 Nomarski相差显微镜观察LAM细胞常规形态结果显示,LAM细胞延展性贴壁生长,呈三角形或多角形(图1)。可能因为细胞在培养皿表面伸展生长,所以培养的细胞比在体细胞长,其长度在20~80 μm之间。LAM细胞通常有一个细胞核,由于细胞部分收缩可见核扭曲。培养的LAM细胞呈不规则排列,细胞之间的接触明显,长时间培养亦可呈多层状。本实验所用培养细胞均在接近成层状态下进行。

    2.2 F-肌丝染色 Rhodamine-phalloidin直接标记法染色结果显示,肌动蛋白在LAM细胞浆内沿细胞长轴呈带状分布,这些条带可能是肌动蛋白细丝的组合,电子显微镜可以直接观察到这些细丝。另外,细胞浆内束状纤维之间的很多区域可见较弱的阳性染色。这些条带通常沿细胞周膜分布,与细胞长轴平行(图2)。在部分LAM细胞中,这些条带呈交错状或重叠的交叉排列,在细胞核周围可呈现聚集或放射样分布。
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    2.3 单荧光染色

    2.3.1 α-SMA 与phalloidin直接染色结果相似,但α-SMA染色结果显示比直接标记法更强的荧光强度,肌动蛋白条带的形态和分布图形与直接标记法结果一致(图3)。

    2.3.2 SMHC SMHC蛋白染色不象肌动蛋白那样清晰,分布弥散,荧光强度弱,偶见与α-SMA蛋白相似的带状排列结构(图4)。

    2.3.3 NMHC-ⅡB NMHC-ⅡB蛋白在LAM细胞浆内呈弥散状,蛋白集中的区域可见与α-SMA染色相似的带状结构(图5)。

    2.3.4 Desmin Desmin蛋白在LAM细胞浆内呈现蛛丝网状分布,主要定位于细胞膜下和细胞核周围(图6)。

    正常IgG对照荧光染色显示阴性结果,提示本实验所见为特异反应,且所用第二抗体与LAM细胞无非特异性结合,但部分LAM细胞核周围可见少量的呈现黄色自显荧光的颗粒(图7和图8)。
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    2.4 双重荧光染色

    2.4.1 Rhodamine-Phalloidin和α-SMA 双重染色结果显示,2种蛋白在很多区域定位一致,部分区域只有phalloidin小的束状的阳性染色,长束状结构通常呈现2种荧光同时标记(图9)。

    2.4.2 SMHC和α-SMA α-SMA蛋白定位与SMHC蛋白基本一致,但SMHC蛋白定位更弥散,荧光强度弱。并常在无α-SMA标记区域内可见SMHC的阳性染色(图10)。

    2.4.3 NMHC-ⅡB和α-SMA 染色结果与SMHC和α-SMA双重染色结果相似,即NMHC-ⅡB呈弥散型染色,偶有与α-SMA共同标记(图11)。

    2.4.4 Desmin和α-SMA 这2种蛋白无共同染色,分布区域明显不同,Desmin常在α-SMA染色阳性纤维之间(图12)。
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    2.5 连续扫描 不同焦点层次连续扫描加计算机图像重组结果可见LAM细胞浆内收缩蛋白的三维排列结构,肌动蛋白条带为很细的圆柱样结构,在细胞浆内它们伸展的距离相对较短,但这些收缩蛋白的密度不完全相同,通常表现为斜对角线方向。

    3 讨论

    美国国立卫生研究院心、肺和血液研究所的研究者成功地分离和确定了LAM细胞株[3],在此基础上,本实验采用Rhodamine-Phalloidin标记技术和特异性抗平滑肌肌动蛋白的单克隆抗体免疫荧光染色技术证明,LAM细胞含有大量的肌动蛋白,phalloidin染色结果显示,LAM细胞浆中可见很强的阳性荧光,表明细胞内有大量的肌动蛋白的存在。值得一提的是,phalloidin标记技术尽管不能区分心肌、骨骼肌和平滑肌的F-肌动蛋白(filamentous actin)[2],但其可直接标记该蛋白,为十分敏感的方法,又因抗平滑肌肌动蛋白抗体不能标记心肌和骨骼肌的肌动蛋白,所以,本实验证实在LAM细胞中含有丰富的平滑肌细胞特有的F-肌动蛋白。
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    本实验结果还显示,LAM细胞中有平滑肌肌球蛋白的表达,该蛋白可能通过与肌动蛋白的相互作用而调解LAM细胞的舒缩运动。如同电子显微镜观察心肌和骨骼肌所见,在平滑肌中,肌球蛋白不形成粗丝[4],其排列形式还是目前比较有争议性的题目。但无论如何LAM细胞中亦有平滑肌肌球蛋白重链蛋白的表达。

    在LAM细胞中,还有NMHC-ⅡB蛋白的表达,该蛋白并非特异性存在于LAM细胞中,也可以在其它很多种细胞中表达,包括非肌性细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞等,参与细胞增殖、分裂及运动[5]。相对于NMHC-ⅡB的广泛的非特异性表达,Desmin蛋白被认为只定位于心肌、骨骼肌和平滑肌细胞浆中[6],该蛋白是肌细胞骨架结构的主要成分,在细胞中被认为起支架作用,但在不同类型的肌细胞中,该蛋白的表达无明显差别。

    综上所述,本实验应用免疫荧光染色技术和激光扫描共聚焦显微镜方法观察证实,LAM细胞浆中有Desmin蛋白的表达,表明LAM细胞是一种肌细胞;同时,该细胞中还有α-SMA、平滑肌肌球蛋白和肌动蛋白的清晰的表达,表明LAM细胞是一种源自平滑肌细胞异常增殖细胞。本实验结果还提示,LAM细胞的成功培养可以在本病发生、发展的影响及其它基础实验研究工作中提供可行性的模型,并可以用于研究女性激素和其它药物对LAM细胞的作用,从而指导临床治疗。
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    图示说明

    图1为相差显微镜照片;图2-8为荧光单染色结果;图9-12为双重荧光染色结果.所有荧光染色均用DAPI细胞核复染(蓝色荧光)(×800).图1显示培养LAM细胞的呈扁平的三角开多角形贴壁生长形态(×600).图2;图1中显示的LAM细胞rhodamine-phalloidin直接标记(红色荧光)后,可见细胞浆内交错排列的肌动蛋白束.图3;α-SMA免疫荧光染色结果显示@平滑肌肌动蛋白(绿色荧光)带状分布于LAM细胞浆内.图4:SMHC染色结果显示,多数细胞浆内可见弥散的阳性染色(红色荧光),在细胞的边缘可见小的带状染色.核周围可见呈现自显荧光的颗粒.图5 NMHC-HB染色结果显示NMHC-IIB蛋白(红色荧光)弥散性分布于LAM细胞浆中,可见少数带状荧光.图6:Desmin染色(红色荧光)结果显示,Desmin蛋白呈蛛丝网状分上于LAM细胞浆中,以细胞核周围和细胞边缘明显.

    图7和图8正常鼠(图7)和兔(图8)IgG对照染色呈现阴性结果,核周围可见有自显荧光的颗粒(箭头)图9α-SMA(绿色荧光)和rdodamine-phalloiin(红色荧光)双重荧光染色结果显示,同一细胞中可见两种荧光叠加在一起的束状黄色荧光,但有的细胞只可见phallodin阳性条索(箭头)(×800)图10α-SMA(绿色荧光)和SMHC(红色荧光:有些细胞可见两种蛋白部分染色叠加在一起的黄色荧光纤维,但其它细胞浆内只可见弥散的SMHC红色荧光(×800)图11α-SMA(绿色荧光)和NMHC-IIB(红色荧光);NMHC-IIB蛋白弥散性分布于细胞浆内,可见两种信号叠加在一起的粗的束状黄色荧光(×850)图12α-SMA(绿色荧光(和Desmin(红色荧光)α-SMA呈束状分布于细胞浆内,Desmin呈蛛丝网状分布于α-SMA染色区域之间@未见共同荧光标记(×850)
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    (对哈尔滨医科大学钱素娟博士在中文翻译上的帮助表示感谢)

    [作者简介]于心语(1981-),男,学生。

    [参考文献]

    [1] Travis WD,Usuki J,Horiba K,et al.Histopathologic Studies on Lymphangioleiomyomatosis.In:LAM and other diseases characterized by smooth muscle proliferation[M].Ed by J.Moss.Marcel Dekker,Inc,New York,1999.171-217.

    [2] De La Cruz E,Pollard TD.Transient kinetic analysis of rhodamine phalloidin binding to actin filaments[J].Biochemistry,1994,33:14387-14392.
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    [3] Yu ZX,Pacheco-Rodriguez G,Takeda K,et al.Isoloation of HMB-45 positive smooth muscle cells (LAM cells) from lung tissue from patients of lymphangioleiomyomatosis[J].Am J Respir Critic Care Med,2000,161:A376.

    [4] Ghadially FN.Intracytoplasmic filaments.In Ultrastructural pathology of the cell and matrix[M].3rd Edition.Butterworths,Wellington,1988.839-845.

    [5] Sellers JR.Myosin[M].2nd Edition.Oxford University Press,Oxford,1998.

    [6] Fuchs E,Weber K.Intermediate filaments:structure,dynamics,function,and disease[J].Annu Rev Biochem,1994,63:345-382.

    [收稿日期]2000-04-30

    [修订日期]2000-07-06, http://www.100md.com