P53 mRNA及P53蛋白在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达及意义
作者：高颖 张孝斌 陈必良 马向东 郭慧玲
单位：高颖 张孝斌(湖北医科大学附属第一医院泌尿外科 武汉，430061)；陈必良 马向东 郭慧玲(第四军医大学西京医院)
关键词：嗜铬细胞瘤；P53基因；P53蛋白；肾上腺肿瘤
临床泌尿外科杂志000513 摘要 目的：研究抑癌基因P53及其表达产物P53蛋白在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达，比较P53 mRNA的表达与P53蛋白的表达关系。方法：应用免疫组织化学方法及核酸分子原位杂交方法检测P53 mRNA及P53蛋白的表达情况。结果：原位杂交显示，P53 mRNA在肾上腺嗜铬细胞瘤中表达为24.1%(7/29)，在肾上腺恶性嗜铬细胞瘤中表达为14.3%(1/7)；免疫组织化学显示，P53蛋白在肾上腺嗜铬细胞瘤中表达为79.3%(23/29)，在肾上腺恶性嗜铬细胞瘤中表达为71.4%(5/7)。结论：在肾上腺嗜铬细胞瘤中，存在P53基因突变，推测P53基因与肾上腺嗜铬细胞瘤的发生发展有显著相关性。
, http://www.100md.com
Expression of antioncogene P53 mRNA and its protein in human adrenal pheochromocytoma
GAO Ying ZHANG Xiao-bing
(Department of Urology,Frist Hospital,Hubei Medical University,Wuhan,430060 )
CHEN Bi-liang MA Xiang-dong GUO Hui-ling
(Xijing Hospital,Fourth Military Medical University)
Abstract Purpose:To investigate the expression and mechanism of antioncogene P53 mRNA and its protein in human adrenal pheochromocytoma.Methods:In situ hybridizaiton (ISH) was employed to detect P53 mRNA in pheochromocytoma.P53 protein was examined by SP immunohistochemistry.Results:ISH showed the expression of P53 mRNA in 29 cases of pheochromocytomas was 24.1% (7/29) and in 7 cases of malignant pheochomocytomas was 14.3% (1/7).The expression of P53 protein in 29 cases of pheochromocytomas was 79.3% (23/29) and in 7 cases of malignant pheochromocytomas was 71.4% (5/7).Conclusions:The mutation of P53 gene might be very important in and responsible for pathogenesis of pheochromocytoma.
, 百拇医药
Key words Pheochromocytoma P53 genes P53 protein Adrenal gland neoplasms
肾上腺嗜铬细胞瘤发生发展的机制目前并不清楚，在分子水平上的发病机制还没有完全建立，本研究拟通过对肾上腺嗜铬细胞瘤中抑癌基因P53 mRNA及其表达产物P53蛋白的检测，探讨抑癌基因P53及其表达产物在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达规律及意义，以及与肾上腺嗜铬细胞瘤发生发展的关系。
1 材料与方法
1.1 标本
选用1988～1999年湖北医科大学附属第一医院及第四军医大学西京医院经病理证实为肾上腺嗜铬细胞瘤存档石蜡包埋标本29例，恶性嗜铬细胞瘤7例，共36例。标本作5 μm厚连续切片。
1.2 试剂
, 百拇医药
P53原位杂交探针及P53蛋白抗体均购于武汉博士德公司，用德国Boehringer Mannheim公司地高辛检测试剂盒进行探针标记和检测；SP(链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶)免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒为美国Zymed公司产品。
1.3 SP免疫组织化学方法
切片常规脱蜡至水，柠檬酸溶液微波炉抗原修复，免疫组织化学检测过程均按说明书严格操作。
1.4 P53 mRNA原位杂交
①切片烤片；②组织切片梯度乙醇脱蜡至水；③40 mg/L多聚甲醛固定，0.2 ml/L DEPC室温10 min，5 mg/L蛋白酶K 37℃消化10 min，甘氨酸液浸10 min，终止反应；④杂交：滴加预杂交液42℃孵育30 min，杂交探针100℃变性10 min，-20℃ 3 min，滴加于组织切片上，2×SSC 温盒内42℃杂交过夜；⑤洗涤、显色：2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、Buffer Ⅰ充分洗涤，正常山羊血清封闭30 min，Dig-Ap(1∶500) 37℃孵育2 h。Buffer Ⅱ洗涤，Buffer Ⅲ平衡组织，NBT/BCIP避光充分显色，Buffer Ⅴ终止反应，脱水，透明，封片。
, 百拇医药
1.5 结果判定
免疫组织化学检测以细胞核或细胞质中出现棕黄色为阳性。原位杂交结果以细胞质内出现蓝紫色颗粒为阳性，设RNase消化为阴性对照，不含探针的预杂交液代替杂交液为空白对照。结果行χ2检验。
2 结果
2.1 免疫组织化学检测
用P53单抗对肾上腺嗜铬细胞瘤组织中的P53蛋白进行免疫组织化学检测，29例肾上腺嗜铬细胞瘤中有23例出现阳性表达，7例肾上腺恶性嗜铬细胞瘤中有5例出现阳性表达(表1)。
表1 P53免疫组织化学检测表达情况 标本
例数
P53蛋白表达
, http://www.100md.com
阳性率
/%
P值
+
-
肾上腺嗜铬
细胞瘤
29
23
6
79.3
>0.05
肾上腺恶性
, http://www.100md.com 嗜铬细胞瘤
7
5
2
71.4
2.2 原位杂交
应用P53 cDNA探针，对肾上腺嗜铬细胞瘤组织中P53 mRNA进行原位杂交检测，29例肾上腺嗜铬细胞瘤中有7例表达，阳性率为24.1%(7/29)，在7例肾上腺恶性嗜铬细胞瘤中仅1例有表达，阳性率为14.3%(表2)。表2 P53原位杂交表达情况 标本
例数
P53 mRNA表达
阳性率
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/%
P值
+
-
肾上腺嗜铬
细胞瘤
29
7
22
24.1
>0.05
肾上腺恶性
嗜铬细胞瘤
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7
1
6
14.3
3 讨论
野生型P53基因是1979年被发现的，全长16 200，人的P53基因位于17号染色体上，有11个外显子和10个内含子〔1〕。P53基因被称做“分子警察”，是一种细胞生长的负调节因子，通过调节细胞生长，监护细胞DNA完整性，诱导DNA受损又未能修复的细胞发生程序性死亡，阻止基因突变，阻止有癌变倾向的细胞产生，从而发挥其抑癌作用〔2〕。在细胞的分裂过程中，发生DNA损伤、缺氧、癌基因过度表达等情况时，P53基因被激活，P53蛋白含量明显增加，通过顺序性特异性转录激活P21，使P21蛋白合成增加，从而抑制各cyclin-CDK复合物的作用，使细胞滞留于原分裂期，以使细胞有充分的时间进行修复，若修复失败则发生凋亡〔3〕。
, http://www.100md.com
当野生型P53基因在某种因素作用下发生突变失活，P53的抑癌作用便丧失，突变型P53基因表达的P53蛋白有与野生型P53蛋白相反的作用，即其具有促进细胞增殖和肿瘤形成的作用〔4〕。在免疫组织化学检测中，野生型P53蛋白由于不稳定，易水解，半衰期短等原因而不能被检测出，而P53单抗在免疫组织化学检测中出现阳性表达时是突变型P53基因表达的结果，说明P53基因已经发生突变〔1〕。在本组实验中，P53蛋白在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达阳性率为79.3%，在肾上腺恶性嗜铬细胞瘤中阳性率为71.4%，说明P53基因突变在肾上腺嗜铬细胞瘤发生发展中有非常重要的意义。
用P53核酸探针对本组肾上腺嗜铬细胞瘤进行P53 mRNA原位杂交检测，发现在肿瘤细胞中，P53 mRNA表达的阳性率较低，结合突变型P53蛋白在本组标本中的高表达，可以推测在肾上腺嗜铬细胞瘤的分子发病机制中，P53基因的突变和异常表达起着非常重要的作用。
, 百拇医药 P53蛋白与P53 mRAN在肾上腺良性、恶性嗜铬细胞瘤中各自的表达率无明显差异，故我们认为用检测P53基因表达进行肾上腺嗜铬细胞瘤的良、恶性鉴别是不合适的。
参考文献
[1]Levine A J.The P53 tumor suppresor gene.Nature,1991,351:453～453
[2]Lane D P.Guardian of the genome.Nature,1992,358:15～15
[3]Jacks T,Robert A,Weinberg.Cell-cycle control and its watchman.Nature,1996,381:643～643
[4]Mars J.Cell death studies yield cancer clues.Science,1993,159:760～760
(收稿 1999-07-15), 百拇医药
单位：高颖 张孝斌(湖北医科大学附属第一医院泌尿外科 武汉，430061)；陈必良 马向东 郭慧玲(第四军医大学西京医院)
关键词：嗜铬细胞瘤；P53基因；P53蛋白；肾上腺肿瘤
临床泌尿外科杂志000513 摘要 目的：研究抑癌基因P53及其表达产物P53蛋白在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达，比较P53 mRNA的表达与P53蛋白的表达关系。方法：应用免疫组织化学方法及核酸分子原位杂交方法检测P53 mRNA及P53蛋白的表达情况。结果：原位杂交显示，P53 mRNA在肾上腺嗜铬细胞瘤中表达为24.1%(7/29)，在肾上腺恶性嗜铬细胞瘤中表达为14.3%(1/7)；免疫组织化学显示，P53蛋白在肾上腺嗜铬细胞瘤中表达为79.3%(23/29)，在肾上腺恶性嗜铬细胞瘤中表达为71.4%(5/7)。结论：在肾上腺嗜铬细胞瘤中，存在P53基因突变，推测P53基因与肾上腺嗜铬细胞瘤的发生发展有显著相关性。
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Expression of antioncogene P53 mRNA and its protein in human adrenal pheochromocytoma
GAO Ying ZHANG Xiao-bing
(Department of Urology,Frist Hospital,Hubei Medical University,Wuhan,430060 )
CHEN Bi-liang MA Xiang-dong GUO Hui-ling
(Xijing Hospital,Fourth Military Medical University)
Abstract Purpose:To investigate the expression and mechanism of antioncogene P53 mRNA and its protein in human adrenal pheochromocytoma.Methods:In situ hybridizaiton (ISH) was employed to detect P53 mRNA in pheochromocytoma.P53 protein was examined by SP immunohistochemistry.Results:ISH showed the expression of P53 mRNA in 29 cases of pheochromocytomas was 24.1% (7/29) and in 7 cases of malignant pheochomocytomas was 14.3% (1/7).The expression of P53 protein in 29 cases of pheochromocytomas was 79.3% (23/29) and in 7 cases of malignant pheochromocytomas was 71.4% (5/7).Conclusions:The mutation of P53 gene might be very important in and responsible for pathogenesis of pheochromocytoma.
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Key words Pheochromocytoma P53 genes P53 protein Adrenal gland neoplasms
肾上腺嗜铬细胞瘤发生发展的机制目前并不清楚，在分子水平上的发病机制还没有完全建立，本研究拟通过对肾上腺嗜铬细胞瘤中抑癌基因P53 mRNA及其表达产物P53蛋白的检测，探讨抑癌基因P53及其表达产物在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达规律及意义，以及与肾上腺嗜铬细胞瘤发生发展的关系。
1 材料与方法
1.1 标本
选用1988～1999年湖北医科大学附属第一医院及第四军医大学西京医院经病理证实为肾上腺嗜铬细胞瘤存档石蜡包埋标本29例，恶性嗜铬细胞瘤7例，共36例。标本作5 μm厚连续切片。
1.2 试剂
, 百拇医药
P53原位杂交探针及P53蛋白抗体均购于武汉博士德公司，用德国Boehringer Mannheim公司地高辛检测试剂盒进行探针标记和检测；SP(链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶)免疫组织化学试剂盒，DAB显色试剂盒为美国Zymed公司产品。
1.3 SP免疫组织化学方法
切片常规脱蜡至水，柠檬酸溶液微波炉抗原修复，免疫组织化学检测过程均按说明书严格操作。
1.4 P53 mRNA原位杂交
①切片烤片；②组织切片梯度乙醇脱蜡至水；③40 mg/L多聚甲醛固定，0.2 ml/L DEPC室温10 min，5 mg/L蛋白酶K 37℃消化10 min，甘氨酸液浸10 min，终止反应；④杂交：滴加预杂交液42℃孵育30 min，杂交探针100℃变性10 min，-20℃ 3 min，滴加于组织切片上，2×SSC 温盒内42℃杂交过夜；⑤洗涤、显色：2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、Buffer Ⅰ充分洗涤，正常山羊血清封闭30 min，Dig-Ap(1∶500) 37℃孵育2 h。Buffer Ⅱ洗涤，Buffer Ⅲ平衡组织，NBT/BCIP避光充分显色，Buffer Ⅴ终止反应，脱水，透明，封片。
, 百拇医药
1.5 结果判定
免疫组织化学检测以细胞核或细胞质中出现棕黄色为阳性。原位杂交结果以细胞质内出现蓝紫色颗粒为阳性，设RNase消化为阴性对照，不含探针的预杂交液代替杂交液为空白对照。结果行χ2检验。
2 结果
2.1 免疫组织化学检测
用P53单抗对肾上腺嗜铬细胞瘤组织中的P53蛋白进行免疫组织化学检测，29例肾上腺嗜铬细胞瘤中有23例出现阳性表达，7例肾上腺恶性嗜铬细胞瘤中有5例出现阳性表达(表1)。
表1 P53免疫组织化学检测表达情况 标本
例数
P53蛋白表达
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阳性率
/%
P值
+
-
肾上腺嗜铬
细胞瘤
29
23
6
79.3
>0.05
肾上腺恶性
, http://www.100md.com 嗜铬细胞瘤
7
5
2
71.4
2.2 原位杂交
应用P53 cDNA探针，对肾上腺嗜铬细胞瘤组织中P53 mRNA进行原位杂交检测，29例肾上腺嗜铬细胞瘤中有7例表达，阳性率为24.1%(7/29)，在7例肾上腺恶性嗜铬细胞瘤中仅1例有表达，阳性率为14.3%(表2)。表2 P53原位杂交表达情况 标本
例数
P53 mRNA表达
阳性率
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肾上腺嗜铬
细胞瘤
29
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>0.05
肾上腺恶性
嗜铬细胞瘤
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3 讨论
野生型P53基因是1979年被发现的，全长16 200，人的P53基因位于17号染色体上，有11个外显子和10个内含子〔1〕。P53基因被称做“分子警察”，是一种细胞生长的负调节因子，通过调节细胞生长，监护细胞DNA完整性，诱导DNA受损又未能修复的细胞发生程序性死亡，阻止基因突变，阻止有癌变倾向的细胞产生，从而发挥其抑癌作用〔2〕。在细胞的分裂过程中，发生DNA损伤、缺氧、癌基因过度表达等情况时，P53基因被激活，P53蛋白含量明显增加，通过顺序性特异性转录激活P21，使P21蛋白合成增加，从而抑制各cyclin-CDK复合物的作用，使细胞滞留于原分裂期，以使细胞有充分的时间进行修复，若修复失败则发生凋亡〔3〕。
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当野生型P53基因在某种因素作用下发生突变失活，P53的抑癌作用便丧失，突变型P53基因表达的P53蛋白有与野生型P53蛋白相反的作用，即其具有促进细胞增殖和肿瘤形成的作用〔4〕。在免疫组织化学检测中，野生型P53蛋白由于不稳定，易水解，半衰期短等原因而不能被检测出，而P53单抗在免疫组织化学检测中出现阳性表达时是突变型P53基因表达的结果，说明P53基因已经发生突变〔1〕。在本组实验中，P53蛋白在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达阳性率为79.3%，在肾上腺恶性嗜铬细胞瘤中阳性率为71.4%，说明P53基因突变在肾上腺嗜铬细胞瘤发生发展中有非常重要的意义。
用P53核酸探针对本组肾上腺嗜铬细胞瘤进行P53 mRNA原位杂交检测，发现在肿瘤细胞中，P53 mRNA表达的阳性率较低，结合突变型P53蛋白在本组标本中的高表达，可以推测在肾上腺嗜铬细胞瘤的分子发病机制中，P53基因的突变和异常表达起着非常重要的作用。
, 百拇医药 P53蛋白与P53 mRAN在肾上腺良性、恶性嗜铬细胞瘤中各自的表达率无明显差异，故我们认为用检测P53基因表达进行肾上腺嗜铬细胞瘤的良、恶性鉴别是不合适的。
参考文献
[1]Levine A J.The P53 tumor suppresor gene.Nature,1991,351:453～453
[2]Lane D P.Guardian of the genome.Nature,1992,358:15～15
[3]Jacks T,Robert A,Weinberg.Cell-cycle control and its watchman.Nature,1996,381:643～643
[4]Mars J.Cell death studies yield cancer clues.Science,1993,159:760～760
(收稿 1999-07-15), 百拇医药