天宝肿宁散醇提取物对不同细胞的生物学作用
作者：周俊 殷学军 刘德祥 仇东辉 张月明 闫浩
单位：周俊 殷学军 刘德祥 仇东辉(兰州军区乌鲁木齐总医院临床医学研究所 乌鲁木齐 830000)；张月明 闫浩(新疆医学院)
关键词：天宝肿宁散；细胞；生物学作用
浙江中西医结合杂志000503 摘要 目的：观察“天宝肿宁散”方剂对小鼠成纤维细胞(3T3)和人膀胱癌细胞(EJ)、人喉癌细胞(Hep-2)、人胃癌细胞(MGC-803)、人肝癌细胞(Q3)以及人肺癌细胞(Spc-A-1)等肿瘤细胞生物学作用。方法：采用体外细胞培养法。结果：显示该方剂具有抑制以上癌细胞的细胞增殖和蛋白质代谢，而且可致这些癌细胞的生长形态发生改变，但对小鼠(3T3)细胞无明显抑制作用。结论：该方剂对癌细胞和正常细胞存在不同的生物学作用。
Studies on the Biological Effects of Alcohol Extraction of Tian Bao Zhong Ning San on Different cell lines
, http://www.100md.com
Zhou jun Zhang yueming Yan hao
(Urumqi General Hospital，Lanzhou Military Command，Urumqi 830000)
Abstract Objective：To explore the biological effects of Tian Bao Zhong Ning San on different cell lines. Methods：Cell culture in vitro was used to investigate the effects of Chinese medicinal heabs Tian Bao Zhong Ning San on mouse fibroblast，bladder carcinoma cell lines (EJ)，throat carcinoma cell lines (Hep2)，stomach carcinoma cell lines (MGC-803)，hepatic carcinoma cell lines (Q3) and lung carcinoma cell lines (Spc-A-1). Results：The prescription proved to be effective in inhibiting the survival and protein metabolism of the cancer cells，inducing the morphalogical changes of the cultured cells. But no such effect was observed on mouse cell 3T3，suggesting that the prescription had different regulating effects on cancer cells and normal cells. Conclusion：Tian Bao Zhong Ning San had the effects of inhibiting growth of cancer cells.
, 百拇医药
Key words chinese medicinal herbs cell culture biological effects
复方中药“天宝肿宁散”主要包括山豆根、补骨脂、当归、枸杞子、白术、鹿茸等多味中药。这些中药具有一定的抗肿瘤/增强机体抵抗力的作用。“天宝肿宁散”运用于肿瘤临床已取得一定的疗效。为了进一步肯定该方剂的临床功效，探索其作用机制，为寻找新的有效的抗肿瘤药物研究提供资料，本课题对该药进行了癌细胞生物学的实验研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 小鼠成纤维细胞(3T3)、人喉癌细胞(Hep-2)、人肝癌细胞(Q3)均由上海肿瘤研究所提供，人肺癌细胞(Spc-A-1)由第四军医大学提供，人低分化粘液腺胃癌细胞(MGC-803)、人膀胱癌细胞(EJ)由西安肿瘤研究所提供。
, 百拇医药
1.1.2 天宝肿宁散 由新疆医学院肿瘤附属医院提供。
1.1.3 试剂 RPMI 1640，小牛血清(Fcs)，二甲基亚砜(DMSO)，环磷酰胺(CP)等。
1.2 方法
1.2.1 样品处理 制备天宝肿宁散醇提液，用50%乙醇搅拌浸泡48小时后离心，上清液过滤，沸水浴浓缩后加DMSO溶解至1g/ml(生药浓度)，抽滤除菌后置-20℃保存。
1.2.2 人癌细胞杀伤实验 细胞培养方法参照文献[1]。细胞复苏后在5%CO2 37℃条件下培养至浓度4～5×105个/ml，取100μl细胞液接种于96孔培养板，过夜。次日加入受试物100μl，使孔中作用浓度依次为0.5×10-4g/ml，0.5×10-3g/ml，0.5×10-2g/ml，0.5×10-1g/ml，0.5g/ml 5个浓度继续培养，阴性对照组加入同体积水/DMSO、阳性对照组加CP(作用浓度10μg/ml)，设4个平行孔，分别于作用第24小时、第48小时和第72小时检测：①倒置显微镜下观察细胞形态，分级标准参照文献[2]；②细胞存活量，用ELISA-结晶紫染色法[3]，用Σ960型酶标仪，560nm波长测OD值，该OD值与细胞存活量成正相关。并计算生长抑制率IR[4]；
, 百拇医药
③用BRADFORD蛋白测定法测活细胞含量[5，6]。
2 结 果
2.1 方剂对细胞存活量的影响
醇提液可显著抑制Hep-2、MGC-803、Spc-A-1、EJ和Q3等肿瘤细胞的生长(P<0.01，P<0.05)，抑制率可分别高达85.7%(72h)、89.7%(24h)、75%(24h)、72%(24h)和50%(48h)。以浓度0.5×10-2g/ml较稳定，各浓度组的抑制率见表1。而对小鼠3T3细胞作用则未见明显抑制作用(P<0.05)。
表1 方剂醇提液对各细胞存活数量的影响(
±s) 时间
/h
, 百拇医药
浓度
/(g/ml)
EJ细胞
Hep-2细胞
MGC-803细胞
Q3细胞
Spc-A-1细胞
3T3细胞
〗
0.5×10-4
0.038±0.00
0.054±0.00*
, 百拇医药
0.012±0.00*
0.074±0.01
0.024±0.00*
0.090±0.01
0.5×10-3
0.028±0.00*
0.069±0.01*
0.008±0.00*
0.058±0.01**
0.020±0.00*
, 百拇医药
0.098±0.00
24
0.5×10-2
0.016±0.00**
0.061±0.01*
0.005±0.00**
0.060±0.00**
0.013±0.00**
0.090±0.00
0.5×10-1
, 百拇医药
0.014±0.00**
0.060±0.01*
0.014±0.00
0.047±0.00**
0.014±0.00**
0.084±0.01
0.5×100
0.038±0.01
0.083±0.01*
0.032±0.01
, http://www.100md.com
0.078±0.00
0.032±0.00
0.090±0.02
对照
0.050×0.00
0.097±0.01
0.035±0.01
0.092±0.01
0.052±0.01
0.092±0.00
0.5×10-4
, http://www.100md.com
0.036±0.01*
0.048±0.00**
0.016±0.00**
0.037±0.00
0.026±0.00*
0.056±0.00
0.5×10-3
0.026±0.00**
0.045±0.00**
0.014±0.00**
, 百拇医药
0.028±0.00**
0.027±0.00*
0.058±0.02
48
0.5×10-2
0.022±0.00**
0.048±0.00**
0.020±0.00*
0.030±0.00**
0.019±0.00**
, 百拇医药
0.056±0.00
0.5×10-1
0.028±0.01**
0.058±0.00*
0.024±0.00
0.036±0.00*
0.013±0.00**
0.061±0.00
0.5×100
0.060±0.01
, 百拇医药
0.102±0.02
0.032±0.01
0.042±0.00
0.046±0.00
0.054±0.00
对照
0.075±0.01
0.104±0.01
0.035±0.01
0.056±0.01
0.051±0.00
0.054±0.00
, http://www.100md.com
0.5×10-4
0.024±0.00
0.103±0.03
0.020±0.01**
0.047±0.00
0.035±0.00
0.060±0.01
0.5×10-3
0.018±0.00*
0.037±0.01*
, 百拇医药
0.021±0.00**
0.046±0.01
0.022±0.00**
0.059±0.00
72
0.5×10-2
0.014±0.00**
0.012±0.00**
0.017±0.00**
0.057±0.00
, 百拇医药
0.016±0.00**
0.062±0.00
0.5×10-1
0.016±0.00**
0.099±0.02*
0.017±0.00**
0.043±0.00*
0.022±0.00*
0.062±0.00
0.5×100
, 百拇医药
0.028±0.00
0.104±0.01
0.049±0.01*
0.070±0.01
0.037±0.00
0.061±0.00
对照
0.035×0.00
0.116±0.03
0.060±0.01
0.072±0.01
, 百拇医药
0.042±0.01
0.060±0.00
2.2 方剂对细胞蛋白质代谢的影响
醇提液对五株人癌细胞的蛋白质代谢在不同浓度、不同时点均出现不同程度的抑制作用，活细胞蛋白质含量显著降低(P<0.01，P<0.05)，见表2～3。3T3细胞蛋白质含量则未见下降。
2.3 方剂对肿瘤细胞形态分级的影响
方剂醇提液对Hep-2、EJ、Spc-A-1、MGC-803和Q3细胞株有一定的细胞毒作用，表现为形态改变、颗粒和空泡增多、细胞悬浮等，除以上改变外，还出现细胞呈团或片状聚集、细胞碎片等现象，见图1～2。表2 方剂醇提液对各株细胞生长的抑制率% 时间
/h
, 百拇医药
浓度
/(g/ml)
EJ细胞
Hep-2细胞
MGC-803细胞
Q3细胞
Spc-A-1细胞
3T3细胞
0.5×10-4
24.0
44.3
65.7
, 百拇医药
19.6
50.0
2.2
0.5×10-3
44.0
28.9
77.1
37.0
61.5
-6.5
24
0.5×10-2
, http://www.100md.com
68.0
37.1
89.7
34.8
75.0
2.2
0.5×10-1
72.0
38.1
60.6
48.9
73.1
8.7
, http://www.100md.com
0.5×100
24.0
14.4
8.6
15.3
38.0
2.2
0.5×10-4
52.0
53.8
54.3
33.9
, http://www.100md.com
49.0
-3.7
0.5×10-3
65.3
56.7
60.0
50.0
47.1
-7.5
48
0.5×10-2
70.7
, 百拇医药
53.8
42.9
46.4
62.7
-3.7
0.5×10-1
62.7
44.2
30.0
35.7
74.5
-13.0
0.5×100
, http://www.100md.com
20.0
19.0
8.6
25.0
9.8
0
0.5×10-4
31.40
11.2
66.7
34.7
16.7
0
, 百拇医药
0.5×10-3
48.6
68.1
65.0
36.1
47.6
1.7
72
0.5×10-2
60.0
85.7
71.7
, http://www.100md.com
20.8
61.9
-3.3
0.5×10-1
54.3
14.7
71.7
40.3
47.6
-3.3
0.5×100
20.0
, http://www.100md.com
10.3
18.3
2.8
10.0
-1.7
表3 方剂醇提液对各细胞蛋白质含量(OD)值的影响(±s)
时间
/h
浓度
/(g/ml)
EJ细胞
, http://www.100md.com
Hep-2细胞
MGC-803细胞
Q3细胞
Spc-A-1细胞
3T3细胞
0.5×10-4
0.308±0.01
0.318±0.05
0.246±0.02
0.365±0.01
0.341±0.00**
, 百拇医药
0.304±0.01
0.5×10-3
0.212±0.00*
0.315±0.01
0.243±0.06
0.362±0.01
0.195±0.00**
0.308±0.02
24
0.5×10-2
0.210±0.01**
, 百拇医药
0.262±0.01*
0.213±0.02
0.340±0.00
0.184±0.01**
0.298±0.00
0.5×10-1
0.241±0.00
0.251±0.04*
0.184±0.02*
0.324±0.00
, 百拇医药
0.312±0.01**
0.296±0.01
0.5×100
0.305±0.01
0.337±0.02
0.206±0.00
0.378±0.01
0.349±0.01*
0.318±0.01
对照
0.324±0.01
, 百拇医药
0.357±0.01
0.257±0.00
0.384±0.01
0.411±0.01
0.320±0.02
0.5×10-4
0.242±0.00*
0.375±0.02
0.266±0.09
0.308±0.08
0.234±0.01
, http://www.100md.com
0.328±0.01
0.5×10-3
0.267±0.01*
0.315±0.03
0.222±0.03
0.319±0.02
0.229±0.01*
0.352±0.02
48
0.5×10-2
0.249±0.00*
, 百拇医药
0.285±0.00*
0.178±0.05*
0.323±0.04
0.218±0.00**
0.321±0.01
0.5×10-1
0.254±0.00*
0.260±0.04*
0.165±0.05*
0.256±0.02*
, http://www.100md.com
0.188±0.00**
0.340±0.01
0.5×100
0.338±0.00
0.380±0.01
0.212±0.03
0.330±0.00
0.388±0.02
0.346±0.01
对照
0.362±0.01
, http://www.100md.com
0.385±0.05
0.272±0.07
0.350±0.03
0.394±0.04
0.342±0.02
0.5×10-4
0.274±0.01*
0.369±0.03
0.314±0.05
0.276±0.03**
0.176±0.00**
, http://www.100md.com
0.343±0.01
0.5×10-3
0.247±0.00*
0.270±0.05**
0.356±0.04
0.234±0.00**
0.264±0.02**
0.341±0.01
72
0.5×10-2
, 百拇医药
0.218±0.00**
0.294±0.00*
0.309±0.00
0.252±0.01**
0.189±0.01**
0.319±0.02
0.5×10-1
0.246±0.00*
0.275±0.01**
0.330±0.01
, 百拇医药
0.240±0.01**
0.301±0.00
0.354±0.02
0.5×100
0.367±0.00
0.360±0.02
0.364±0.01
0.340±0.02
0.303±0.05
0.355±0.01
对照
, 百拇医药
0.461±0.04
0.385±0.05
0.382±0.04
0.347±0.03
0.342±0.04
0.331±0.01
与空白对照组相比*P<0.05，**P<0.01
图1 方剂醇提液(0.5×10-2g/ml)
对MGc-803细胞形态的影响
, 百拇医药
图2 方剂醇提液(0.5×10-2g/ml)
对Spc-A-1细胞形态的影响
3 讨 论
实验结果提示，“天宝肿宁散”方剂具有体外抗肿瘤作用，对膀胱癌(EJ)等五种人癌细胞有较强的直接杀伤和生长抑制作用，形态学观察到癌细胞发生明显核固缩，胞膜破裂，胞质外溢，并可见较多裸核细胞。推测具有诱导癌细胞凋亡作用[7]。而对小鼠成纤维细胞未见明显影响，提示其对正常细胞与人癌细胞呈不同生物学作用。同时，实验结果还显示方剂对不同肿瘤株抑制有一定的选择性，作用强弱存在差异。MGc-803。EJ、Spc-A-1对该药更为敏感，浓度高低也有影响，以作用浓度0.5×10-2g/ml为最佳，随剂量增长，抑制作用呈现出类似抛物线的趋势，但经曲线拟合分析，拟合度欠佳。说明该剂量区域非最佳有效区域，但可作为临床应用时的参考。
, 百拇医药
该药抗癌功能体现在对癌细胞形态的改变、细胞增殖和蛋白质代谢的抑制，其作用机理可能是通过对机体的免疫调节作用，增强细胞的抗原性的作用，抑制DNA复制，影响癌细胞代谢等来实现的。具体的抗肿瘤机制，仍需做进一步的实验研究。
已有文献报道：山豆根具有升白和抗肿瘤作用，对宫颈癌细胞、白血病细胞有抑制作用；补骨脂含有黄酮类化合物，具有升白和促粒细胞生长作用，并能抑制小鼠腹水癌细胞(S180)和宫颈癌细胞生长；当归含有多种有机酸和留醇类化合物，能促进非特异性免疫功能，增强单核巨噬细胞的吞噬功能，还可促进人的淋巴细胞转化；白术含有苍术醇、苍术酮等物质，可以增强荷瘤动物的细胞免疫功能，明显提高血清IgG，并具有一定的升白和抗肿瘤作用；鹿茸可明显提高机体免疫功能，促进红细胞、血红蛋白和网织红细胞的生成，也具升白作用等等[8]。由此可见，“天宝肿宁散”的抗肿瘤作用是方中诸药协同作用的结果。
本项目是由新疆维吾尔自治区科委科研基金资助，项目编号：G9531008
, 百拇医药
参考文献
1，鄂征主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1988.
2，章静波主编.细胞生物学实用方法与技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995.53
3，Jeffrey Parsonnet and zoe A Gillis.Production of Tumor Necrosis Factor by Haman monocytes in Response to Toxic-shock-Syndrome Toxin-1. The Journal of infections diseases，1988，158(5)：1026
4，刘宗潮，谢冰芳，潘启超，等.毛叶茶提取物对不同细胞生长的影响及体内协同抗瘤作用.癌症，1996，15(3)：164～166
5，Bradfoad M，et al.Anal Biochem，1976，72：248
6，胡卓逸，孙承琦.蛋白质定量方法的进展.生物化学与生物物理进展，1990，17(1)：23～26
7，迟永春，万方，王石鳞，等.硒甲祛邪方的抗癌机理与诱导细胞凋亡.中日友好医院学报，1996，10(4)：283～286
8，江苏药学院编.中药大辞典.上海：上海科学技术出版社，1986，6
收稿日期：1999-12-14, http://www.100md.com
单位：周俊 殷学军 刘德祥 仇东辉(兰州军区乌鲁木齐总医院临床医学研究所 乌鲁木齐 830000)；张月明 闫浩(新疆医学院)
关键词：天宝肿宁散；细胞；生物学作用
浙江中西医结合杂志000503 摘要 目的：观察“天宝肿宁散”方剂对小鼠成纤维细胞(3T3)和人膀胱癌细胞(EJ)、人喉癌细胞(Hep-2)、人胃癌细胞(MGC-803)、人肝癌细胞(Q3)以及人肺癌细胞(Spc-A-1)等肿瘤细胞生物学作用。方法：采用体外细胞培养法。结果：显示该方剂具有抑制以上癌细胞的细胞增殖和蛋白质代谢，而且可致这些癌细胞的生长形态发生改变，但对小鼠(3T3)细胞无明显抑制作用。结论：该方剂对癌细胞和正常细胞存在不同的生物学作用。
Studies on the Biological Effects of Alcohol Extraction of Tian Bao Zhong Ning San on Different cell lines
, http://www.100md.com
Zhou jun Zhang yueming Yan hao
(Urumqi General Hospital，Lanzhou Military Command，Urumqi 830000)
Abstract Objective：To explore the biological effects of Tian Bao Zhong Ning San on different cell lines. Methods：Cell culture in vitro was used to investigate the effects of Chinese medicinal heabs Tian Bao Zhong Ning San on mouse fibroblast，bladder carcinoma cell lines (EJ)，throat carcinoma cell lines (Hep2)，stomach carcinoma cell lines (MGC-803)，hepatic carcinoma cell lines (Q3) and lung carcinoma cell lines (Spc-A-1). Results：The prescription proved to be effective in inhibiting the survival and protein metabolism of the cancer cells，inducing the morphalogical changes of the cultured cells. But no such effect was observed on mouse cell 3T3，suggesting that the prescription had different regulating effects on cancer cells and normal cells. Conclusion：Tian Bao Zhong Ning San had the effects of inhibiting growth of cancer cells.
, 百拇医药
Key words chinese medicinal herbs cell culture biological effects
复方中药“天宝肿宁散”主要包括山豆根、补骨脂、当归、枸杞子、白术、鹿茸等多味中药。这些中药具有一定的抗肿瘤/增强机体抵抗力的作用。“天宝肿宁散”运用于肿瘤临床已取得一定的疗效。为了进一步肯定该方剂的临床功效，探索其作用机制，为寻找新的有效的抗肿瘤药物研究提供资料，本课题对该药进行了癌细胞生物学的实验研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 小鼠成纤维细胞(3T3)、人喉癌细胞(Hep-2)、人肝癌细胞(Q3)均由上海肿瘤研究所提供，人肺癌细胞(Spc-A-1)由第四军医大学提供，人低分化粘液腺胃癌细胞(MGC-803)、人膀胱癌细胞(EJ)由西安肿瘤研究所提供。
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1.1.2 天宝肿宁散 由新疆医学院肿瘤附属医院提供。
1.1.3 试剂 RPMI 1640，小牛血清(Fcs)，二甲基亚砜(DMSO)，环磷酰胺(CP)等。
1.2 方法
1.2.1 样品处理 制备天宝肿宁散醇提液，用50%乙醇搅拌浸泡48小时后离心，上清液过滤，沸水浴浓缩后加DMSO溶解至1g/ml(生药浓度)，抽滤除菌后置-20℃保存。
1.2.2 人癌细胞杀伤实验 细胞培养方法参照文献[1]。细胞复苏后在5%CO2 37℃条件下培养至浓度4～5×105个/ml，取100μl细胞液接种于96孔培养板，过夜。次日加入受试物100μl，使孔中作用浓度依次为0.5×10-4g/ml，0.5×10-3g/ml，0.5×10-2g/ml，0.5×10-1g/ml，0.5g/ml 5个浓度继续培养，阴性对照组加入同体积水/DMSO、阳性对照组加CP(作用浓度10μg/ml)，设4个平行孔，分别于作用第24小时、第48小时和第72小时检测：①倒置显微镜下观察细胞形态，分级标准参照文献[2]；②细胞存活量，用ELISA-结晶紫染色法[3]，用Σ960型酶标仪，560nm波长测OD值，该OD值与细胞存活量成正相关。并计算生长抑制率IR[4]；
, 百拇医药
③用BRADFORD蛋白测定法测活细胞含量[5，6]。
2 结 果
2.1 方剂对细胞存活量的影响
醇提液可显著抑制Hep-2、MGC-803、Spc-A-1、EJ和Q3等肿瘤细胞的生长(P<0.01，P<0.05)，抑制率可分别高达85.7%(72h)、89.7%(24h)、75%(24h)、72%(24h)和50%(48h)。以浓度0.5×10-2g/ml较稳定，各浓度组的抑制率见表1。而对小鼠3T3细胞作用则未见明显抑制作用(P<0.05)。
表1 方剂醇提液对各细胞存活数量的影响(
±s) 时间/h
, 百拇医药
浓度
/(g/ml)
EJ细胞
Hep-2细胞
MGC-803细胞
Q3细胞
Spc-A-1细胞
3T3细胞
〗
0.5×10-4
0.038±0.00
0.054±0.00*
, 百拇医药
0.012±0.00*
0.074±0.01
0.024±0.00*
0.090±0.01
0.5×10-3
0.028±0.00*
0.069±0.01*
0.008±0.00*
0.058±0.01**
0.020±0.00*
, 百拇医药
0.098±0.00
24
0.5×10-2
0.016±0.00**
0.061±0.01*
0.005±0.00**
0.060±0.00**
0.013±0.00**
0.090±0.00
0.5×10-1
, 百拇医药
0.014±0.00**
0.060±0.01*
0.014±0.00
0.047±0.00**
0.014±0.00**
0.084±0.01
0.5×100
0.038±0.01
0.083±0.01*
0.032±0.01
, http://www.100md.com
0.078±0.00
0.032±0.00
0.090±0.02
对照
0.050×0.00
0.097±0.01
0.035±0.01
0.092±0.01
0.052±0.01
0.092±0.00
0.5×10-4
, http://www.100md.com
0.036±0.01*
0.048±0.00**
0.016±0.00**
0.037±0.00
0.026±0.00*
0.056±0.00
0.5×10-3
0.026±0.00**
0.045±0.00**
0.014±0.00**
, 百拇医药
0.028±0.00**
0.027±0.00*
0.058±0.02
48
0.5×10-2
0.022±0.00**
0.048±0.00**
0.020±0.00*
0.030±0.00**
0.019±0.00**
, 百拇医药
0.056±0.00
0.5×10-1
0.028±0.01**
0.058±0.00*
0.024±0.00
0.036±0.00*
0.013±0.00**
0.061±0.00
0.5×100
0.060±0.01
, 百拇医药
0.102±0.02
0.032±0.01
0.042±0.00
0.046±0.00
0.054±0.00
对照
0.075±0.01
0.104±0.01
0.035±0.01
0.056±0.01
0.051±0.00
0.054±0.00
, http://www.100md.com
0.5×10-4
0.024±0.00
0.103±0.03
0.020±0.01**
0.047±0.00
0.035±0.00
0.060±0.01
0.5×10-3
0.018±0.00*
0.037±0.01*
, 百拇医药
0.021±0.00**
0.046±0.01
0.022±0.00**
0.059±0.00
72
0.5×10-2
0.014±0.00**
0.012±0.00**
0.017±0.00**
0.057±0.00
, 百拇医药
0.016±0.00**
0.062±0.00
0.5×10-1
0.016±0.00**
0.099±0.02*
0.017±0.00**
0.043±0.00*
0.022±0.00*
0.062±0.00
0.5×100
, 百拇医药
0.028±0.00
0.104±0.01
0.049±0.01*
0.070±0.01
0.037±0.00
0.061±0.00
对照
0.035×0.00
0.116±0.03
0.060±0.01
0.072±0.01
, 百拇医药
0.042±0.01
0.060±0.00
2.2 方剂对细胞蛋白质代谢的影响
醇提液对五株人癌细胞的蛋白质代谢在不同浓度、不同时点均出现不同程度的抑制作用，活细胞蛋白质含量显著降低(P<0.01，P<0.05)，见表2～3。3T3细胞蛋白质含量则未见下降。
2.3 方剂对肿瘤细胞形态分级的影响
方剂醇提液对Hep-2、EJ、Spc-A-1、MGC-803和Q3细胞株有一定的细胞毒作用，表现为形态改变、颗粒和空泡增多、细胞悬浮等，除以上改变外，还出现细胞呈团或片状聚集、细胞碎片等现象，见图1～2。表2 方剂醇提液对各株细胞生长的抑制率% 时间
/h
, 百拇医药
浓度
/(g/ml)
EJ细胞
Hep-2细胞
MGC-803细胞
Q3细胞
Spc-A-1细胞
3T3细胞
0.5×10-4
24.0
44.3
65.7
, 百拇医药
19.6
50.0
2.2
0.5×10-3
44.0
28.9
77.1
37.0
61.5
-6.5
24
0.5×10-2
, http://www.100md.com
68.0
37.1
89.7
34.8
75.0
2.2
0.5×10-1
72.0
38.1
60.6
48.9
73.1
8.7
, http://www.100md.com
0.5×100
24.0
14.4
8.6
15.3
38.0
2.2
0.5×10-4
52.0
53.8
54.3
33.9
, http://www.100md.com
49.0
-3.7
0.5×10-3
65.3
56.7
60.0
50.0
47.1
-7.5
48
0.5×10-2
70.7
, 百拇医药
53.8
42.9
46.4
62.7
-3.7
0.5×10-1
62.7
44.2
30.0
35.7
74.5
-13.0
0.5×100
, http://www.100md.com
20.0
19.0
8.6
25.0
9.8
0
0.5×10-4
31.40
11.2
66.7
34.7
16.7
0
, 百拇医药
0.5×10-3
48.6
68.1
65.0
36.1
47.6
1.7
72
0.5×10-2
60.0
85.7
71.7
, http://www.100md.com
20.8
61.9
-3.3
0.5×10-1
54.3
14.7
71.7
40.3
47.6
-3.3
0.5×100
20.0
, http://www.100md.com
10.3
18.3
2.8
10.0
-1.7
表3 方剂醇提液对各细胞蛋白质含量(OD)值的影响(
±s)时间
/h
浓度
/(g/ml)
EJ细胞
, http://www.100md.com
Hep-2细胞
MGC-803细胞
Q3细胞
Spc-A-1细胞
3T3细胞
0.5×10-4
0.308±0.01
0.318±0.05
0.246±0.02
0.365±0.01
0.341±0.00**
, 百拇医药
0.304±0.01
0.5×10-3
0.212±0.00*
0.315±0.01
0.243±0.06
0.362±0.01
0.195±0.00**
0.308±0.02
24
0.5×10-2
0.210±0.01**
, 百拇医药
0.262±0.01*
0.213±0.02
0.340±0.00
0.184±0.01**
0.298±0.00
0.5×10-1
0.241±0.00
0.251±0.04*
0.184±0.02*
0.324±0.00
, 百拇医药
0.312±0.01**
0.296±0.01
0.5×100
0.305±0.01
0.337±0.02
0.206±0.00
0.378±0.01
0.349±0.01*
0.318±0.01
对照
0.324±0.01
, 百拇医药
0.357±0.01
0.257±0.00
0.384±0.01
0.411±0.01
0.320±0.02
0.5×10-4
0.242±0.00*
0.375±0.02
0.266±0.09
0.308±0.08
0.234±0.01
, http://www.100md.com
0.328±0.01
0.5×10-3
0.267±0.01*
0.315±0.03
0.222±0.03
0.319±0.02
0.229±0.01*
0.352±0.02
48
0.5×10-2
0.249±0.00*
, 百拇医药
0.285±0.00*
0.178±0.05*
0.323±0.04
0.218±0.00**
0.321±0.01
0.5×10-1
0.254±0.00*
0.260±0.04*
0.165±0.05*
0.256±0.02*
, http://www.100md.com
0.188±0.00**
0.340±0.01
0.5×100
0.338±0.00
0.380±0.01
0.212±0.03
0.330±0.00
0.388±0.02
0.346±0.01
对照
0.362±0.01
, http://www.100md.com
0.385±0.05
0.272±0.07
0.350±0.03
0.394±0.04
0.342±0.02
0.5×10-4
0.274±0.01*
0.369±0.03
0.314±0.05
0.276±0.03**
0.176±0.00**
, http://www.100md.com
0.343±0.01
0.5×10-3
0.247±0.00*
0.270±0.05**
0.356±0.04
0.234±0.00**
0.264±0.02**
0.341±0.01
72
0.5×10-2
, 百拇医药
0.218±0.00**
0.294±0.00*
0.309±0.00
0.252±0.01**
0.189±0.01**
0.319±0.02
0.5×10-1
0.246±0.00*
0.275±0.01**
0.330±0.01
, 百拇医药
0.240±0.01**
0.301±0.00
0.354±0.02
0.5×100
0.367±0.00
0.360±0.02
0.364±0.01
0.340±0.02
0.303±0.05
0.355±0.01
对照
, 百拇医药
0.461±0.04
0.385±0.05
0.382±0.04
0.347±0.03
0.342±0.04
0.331±0.01
与空白对照组相比*P<0.05，**P<0.01
图1 方剂醇提液(0.5×10-2g/ml)
对MGc-803细胞形态的影响
, 百拇医药
图2 方剂醇提液(0.5×10-2g/ml)
对Spc-A-1细胞形态的影响
3 讨 论
实验结果提示，“天宝肿宁散”方剂具有体外抗肿瘤作用，对膀胱癌(EJ)等五种人癌细胞有较强的直接杀伤和生长抑制作用，形态学观察到癌细胞发生明显核固缩，胞膜破裂，胞质外溢，并可见较多裸核细胞。推测具有诱导癌细胞凋亡作用[7]。而对小鼠成纤维细胞未见明显影响，提示其对正常细胞与人癌细胞呈不同生物学作用。同时，实验结果还显示方剂对不同肿瘤株抑制有一定的选择性，作用强弱存在差异。MGc-803。EJ、Spc-A-1对该药更为敏感，浓度高低也有影响，以作用浓度0.5×10-2g/ml为最佳，随剂量增长，抑制作用呈现出类似抛物线的趋势，但经曲线拟合分析，拟合度欠佳。说明该剂量区域非最佳有效区域，但可作为临床应用时的参考。
, 百拇医药
该药抗癌功能体现在对癌细胞形态的改变、细胞增殖和蛋白质代谢的抑制，其作用机理可能是通过对机体的免疫调节作用，增强细胞的抗原性的作用，抑制DNA复制，影响癌细胞代谢等来实现的。具体的抗肿瘤机制，仍需做进一步的实验研究。
已有文献报道：山豆根具有升白和抗肿瘤作用，对宫颈癌细胞、白血病细胞有抑制作用；补骨脂含有黄酮类化合物，具有升白和促粒细胞生长作用，并能抑制小鼠腹水癌细胞(S180)和宫颈癌细胞生长；当归含有多种有机酸和留醇类化合物，能促进非特异性免疫功能，增强单核巨噬细胞的吞噬功能，还可促进人的淋巴细胞转化；白术含有苍术醇、苍术酮等物质，可以增强荷瘤动物的细胞免疫功能，明显提高血清IgG，并具有一定的升白和抗肿瘤作用；鹿茸可明显提高机体免疫功能，促进红细胞、血红蛋白和网织红细胞的生成，也具升白作用等等[8]。由此可见，“天宝肿宁散”的抗肿瘤作用是方中诸药协同作用的结果。
本项目是由新疆维吾尔自治区科委科研基金资助，项目编号：G9531008
, 百拇医药
参考文献
1，鄂征主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1988.
2，章静波主编.细胞生物学实用方法与技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995.53
3，Jeffrey Parsonnet and zoe A Gillis.Production of Tumor Necrosis Factor by Haman monocytes in Response to Toxic-shock-Syndrome Toxin-1. The Journal of infections diseases，1988，158(5)：1026
4，刘宗潮，谢冰芳，潘启超，等.毛叶茶提取物对不同细胞生长的影响及体内协同抗瘤作用.癌症，1996，15(3)：164～166
5，Bradfoad M，et al.Anal Biochem，1976，72：248
6，胡卓逸，孙承琦.蛋白质定量方法的进展.生物化学与生物物理进展，1990，17(1)：23～26
7，迟永春，万方，王石鳞，等.硒甲祛邪方的抗癌机理与诱导细胞凋亡.中日友好医院学报，1996，10(4)：283～286
8，江苏药学院编.中药大辞典.上海：上海科学技术出版社，1986，6
收稿日期：1999-12-14, http://www.100md.com