D17S5 VNTR位点在原发性移行细胞癌的诊断意义
作者：孔庆胜 孔令斌 蒋滢
单位：孔庆胜 孔令斌(济宁医学院附属医院,山东济宁272013)；蒋滢(苏州医学院,江苏苏州215000)
关键词：D17S5 VNTR；膀胱移行细胞癌
癌症000532
中图分类号：R737.14文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)05-0494-01
本文拟通过对原发性膀胱移行细胞癌D17S5可变数目串联重复序列(VNTR)位点的遗传多态性观察，探讨该位点遗传多态性与原发性膀胱移行细胞癌发病的关系，评估其做为基因诊断指标的可能性。
1材料和方法
, http://www.100md.com
标本：21例膀胱肿瘤组织来自苏州医学院第一、二附院外科手术切除标本，病理分型均为膀胱移行细胞癌，其中男13例，女8例，年龄45～64岁。对照组为苏州市正常人群，男42例，女32例，年龄45～63岁。
DNA定量：将组织DNA提取后[1]，用紫外分光光度法重复测DNA浓度和纯度。直至OD260/OD280=1.8时，表明DNA的纯度已达标准。
DNA样品浓度的计算：OD260×核酸稀释倍数×0.05，最后测得的DNA浓度为250ng/ml。
D17S5VNTR位点的扩增：据NakamuraY等[2]设计引物，引物由美国Research公司合成，引物1与VNTR第一个重复单位5端互补，引物2与最后重复单位3端互补。PCR反应体积为20μl，内含5～500ngDNA和3.2μldNTP(1.25mmol/L),MgCl21.2μl(25mmol/L)，primer10.6μl(12.5mmol/L)，primer20.6μl(12.5mmol/L)，Taq酶0.5U,10×缓冲液20μl。PCR扩增程序为95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分20秒，循环30次后，72℃保持7分钟。每次实验设有阴性和阳性对照。扩增产物4℃保存。
, http://www.100md.com
统计方法：组间率的比较采用χ2检验，a水平定为0.05。所有计算均用SAS6.04软件进行处理。
2结果
本组21例中发现D17S5VNTR位点有9个，片段大小在168～868bp之间，其频率分布在0.0192～0.2308之间，结果见表1。对膀胱移行细胞癌和正常对照者的D17S5VNTR位点频率进行比较，两者差异具有显著性，在膀胱移行细胞癌中，A3、A4、A5为最常见的位点，其DNA长度介于308～448之间，而对照组A6、A7为最常见的位点。
74例正常人群中有D17S5VNTR位点杂合子63人，纯合子11人，与膀胱移行细胞癌比较，其纯合子频率显著低于病例组(P=0.034)。进一步分析膀胱移行细胞癌中D17S5VNTR位点的频率，结果不符合Hardy-Weiberg平衡(P<0.001)。
, http://www.100md.com 表1D17S5VNTR位点频率 标记
病例
正常人群
n
频率
n
频率
A1
5
0.0962
A2
4
0.0769
, 百拇医药
A3
11
0.2115
8
0.0308
A4
12
0.2308
23
0.0085
A5
10
0.1923
, 百拇医药
2
0.0078
A6
5
0.0962
31
0.1192
A7
2
0.0385
92
0.3583
A8
, 百拇医药
1
0.0192
9
0.0346
A9
1
0.0192
23
0.0885
A10
20
0.0769
A11
, 百拇医药
1
0.0192
16
0.0615
A12
19
0.07361
A13
8
0.0308
A14
5
0.0192
, 百拇医药
A15
4
0.0154
3讨论
在正常人群中，D17S5VNTR位点是以孟德尔遗传规律传递，其频率分布符合Hardy-Weiberg平衡[3]。
本研究结果显示，膀胱移行细胞癌中D17S5VNTR位点的频率分布与正常人群不同，在膀胱移行细胞癌中该位点主要为相对较短的A3、A4、A5等位基因，而正常人群的主要为中等长度的A6、A7和A9。而且膀胱移行细胞癌中纯合子频率明显高于正常人群，膀胱移行细胞癌中频率分布不符合Hardy-Weiberg平衡，且D17S5VNTR位点的频率分布与正常人群之间存在显著性差异，膀胱癌中纯合子的频率高于正常人群。表明D17S5VNTR位点可作为原发性膀胱移行细胞癌基因诊断的一个有价值的参考指标。至于D17S5VNTR中的纯合子增高的原因，可能是因为D17S5VNTR的部分纯合子的一些杂合性丢失引起的，部分频率的丢失可能导致了D17S5VNTR位点频率分布的异常。
, 百拇医药
基金项目：本课题受江苏省卫生厅基金(No.)资助
[参考文献]
1，孙乃恩，孙东旭，朱德煦，等.分子遗传学[M].南京：南京大学出版社，1990：218～220.
2，Nakamura Y, Leppert M, O｀ Connell P, et al. A mapped set of DNA markers for human chromosome 17 [J]. Genomics, 1988,2： 302～ 309.
3，Giorgetti R,Tagliabracci A,Cingolani M, et al. Use of DNA amplification by PCR in the study of the hypervariable region(VITR)in a forensic medicine setting. Experience with 2 systems： Apo B and YNZ 22 [J]. Boll Soc Ital Biol Sper, 1991,67(1)：25～30.
收稿日期：1999-08-11；修回日期：2000-01-18, 百拇医药
单位：孔庆胜 孔令斌(济宁医学院附属医院,山东济宁272013)；蒋滢(苏州医学院,江苏苏州215000)
关键词：D17S5 VNTR；膀胱移行细胞癌
癌症000532
中图分类号：R737.14文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)05-0494-01
本文拟通过对原发性膀胱移行细胞癌D17S5可变数目串联重复序列(VNTR)位点的遗传多态性观察，探讨该位点遗传多态性与原发性膀胱移行细胞癌发病的关系，评估其做为基因诊断指标的可能性。
1材料和方法
, http://www.100md.com
标本：21例膀胱肿瘤组织来自苏州医学院第一、二附院外科手术切除标本，病理分型均为膀胱移行细胞癌，其中男13例，女8例，年龄45～64岁。对照组为苏州市正常人群，男42例，女32例，年龄45～63岁。
DNA定量：将组织DNA提取后[1]，用紫外分光光度法重复测DNA浓度和纯度。直至OD260/OD280=1.8时，表明DNA的纯度已达标准。
DNA样品浓度的计算：OD260×核酸稀释倍数×0.05，最后测得的DNA浓度为250ng/ml。
D17S5VNTR位点的扩增：据NakamuraY等[2]设计引物，引物由美国Research公司合成，引物1与VNTR第一个重复单位5端互补，引物2与最后重复单位3端互补。PCR反应体积为20μl，内含5～500ngDNA和3.2μldNTP(1.25mmol/L),MgCl21.2μl(25mmol/L)，primer10.6μl(12.5mmol/L)，primer20.6μl(12.5mmol/L)，Taq酶0.5U,10×缓冲液20μl。PCR扩增程序为95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分20秒，循环30次后，72℃保持7分钟。每次实验设有阴性和阳性对照。扩增产物4℃保存。
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统计方法：组间率的比较采用χ2检验，a水平定为0.05。所有计算均用SAS6.04软件进行处理。
2结果
本组21例中发现D17S5VNTR位点有9个，片段大小在168～868bp之间，其频率分布在0.0192～0.2308之间，结果见表1。对膀胱移行细胞癌和正常对照者的D17S5VNTR位点频率进行比较，两者差异具有显著性，在膀胱移行细胞癌中，A3、A4、A5为最常见的位点，其DNA长度介于308～448之间，而对照组A6、A7为最常见的位点。
74例正常人群中有D17S5VNTR位点杂合子63人，纯合子11人，与膀胱移行细胞癌比较，其纯合子频率显著低于病例组(P=0.034)。进一步分析膀胱移行细胞癌中D17S5VNTR位点的频率，结果不符合Hardy-Weiberg平衡(P<0.001)。
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病例
正常人群
n
频率
n
频率
A1
5
0.0962
A2
4
0.0769
, 百拇医药
A3
11
0.2115
8
0.0308
A4
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0.2308
23
0.0085
A5
10
0.1923
, 百拇医药
2
0.0078
A6
5
0.0962
31
0.1192
A7
2
0.0385
92
0.3583
A8
, 百拇医药
1
0.0192
9
0.0346
A9
1
0.0192
23
0.0885
A10
20
0.0769
A11
, 百拇医药
1
0.0192
16
0.0615
A12
19
0.07361
A13
8
0.0308
A14
5
0.0192
, 百拇医药
A15
4
0.0154
3讨论
在正常人群中，D17S5VNTR位点是以孟德尔遗传规律传递，其频率分布符合Hardy-Weiberg平衡[3]。
本研究结果显示，膀胱移行细胞癌中D17S5VNTR位点的频率分布与正常人群不同，在膀胱移行细胞癌中该位点主要为相对较短的A3、A4、A5等位基因，而正常人群的主要为中等长度的A6、A7和A9。而且膀胱移行细胞癌中纯合子频率明显高于正常人群，膀胱移行细胞癌中频率分布不符合Hardy-Weiberg平衡，且D17S5VNTR位点的频率分布与正常人群之间存在显著性差异，膀胱癌中纯合子的频率高于正常人群。表明D17S5VNTR位点可作为原发性膀胱移行细胞癌基因诊断的一个有价值的参考指标。至于D17S5VNTR中的纯合子增高的原因，可能是因为D17S5VNTR的部分纯合子的一些杂合性丢失引起的，部分频率的丢失可能导致了D17S5VNTR位点频率分布的异常。
, 百拇医药
基金项目：本课题受江苏省卫生厅基金(No.)资助
[参考文献]
1，孙乃恩，孙东旭，朱德煦，等.分子遗传学[M].南京：南京大学出版社，1990：218～220.
2，Nakamura Y, Leppert M, O｀ Connell P, et al. A mapped set of DNA markers for human chromosome 17 [J]. Genomics, 1988,2： 302～ 309.
3，Giorgetti R,Tagliabracci A,Cingolani M, et al. Use of DNA amplification by PCR in the study of the hypervariable region(VITR)in a forensic medicine setting. Experience with 2 systems： Apo B and YNZ 22 [J]. Boll Soc Ital Biol Sper, 1991,67(1)：25～30.
收稿日期：1999-08-11；修回日期：2000-01-18, 百拇医药