荧光原位杂交技术检测c-erbB-2和p53基因在胃癌中的表达
作者：彭文明 麦卫阳 郑秀玲 周敏能 方云光 黄锐明 钟慕贞 刘少颜
单位：彭文明 麦卫阳 郑秀玲 周敏能 方云光 黄锐明 钟慕贞 刘少颜(广州市第二人民医院病理科,广东 广州510150)
关键词：胃肿瘤；基因；p53，c-erbB-2；荧光原位杂交(FISH)
癌症000509
【摘要】目的：探讨胃癌组织中c-erbB-2和p53基因的表达及其意义。方法：应用荧光原位杂交技术对55例胃癌及移行区、正常区组织的常规石蜡包埋标本进行检测。结果：c-erbB-2和p53基因表达的阳性率分别为36.36%和45.45%，移行区为10.91%和3.64%，正常粘膜区为3.64%和0，三区间差异均有极显著意义(P值均<0.01)。在肠型和弥漫型胃癌中，c-erbB-2阳性率分别为51.61%和16.67%，p53阳性率分别为25.81%和70.83%，其在两型间的差异有显著性意义(P<0.05)。c-erbB-2和p53基因表达与胃癌的组织学分级有关(P<0.05或P<0.01)；c-erbB-2基因表达阳性与胃癌的淋巴结内转移有关(P<0.05)。结论：c-erbB-2基因扩增和p53基因突变与胃癌的发生、类型、分化和转移有关，其测定可有助于确定肿瘤的生物学行为。
, 百拇医药
中图分类号：R735.2文献标识码：A文章编号：1000-467X(2000)05-0426-03
Detection of c-erbB-2 and p53 gene expression in human gastric carcinoma by fluorescence in situ hybridization
PENG Wen-ming, MAI Wei-yang, ZHENG Xiu-ling, et al.
(Second People's Hospital Guangzhou, Guangzhou 510150,P.R.China)
【Abstract】 Objective： To investigate the expression of c-erbB-2 and p53 gene in gastric carcinoma. Method： The C-erbB-2 and p53 expressions were dedected by in situ hybridization (FISH) for 55 cases of gastric carcinoma tissues, their transitional region tissues and normal tissues of formalin-fixed, paraffinembedded sections. Results： The positive rate of c-erbB-2 and p53 were 36.1% and 45.5% in cancer tissues, 10.91% and 3.64% in transitional regions, 3.64% and 0 in normal regions respectively. There were highly significant differences among the three regions (all P<0.001). In intestinal type and diffuse type gastric carcinoma, the incidences of c-erbB-2 were 51.61% and 16.37% , and of p53 were 25.8% and 70.83% respectively,which was significantly different between two types (all P< 0.05). The expression of c-erbB-2 and p53 gene were also correlated with the histological grades of the tumors (P< 0.01 or 0.05) . The positive of C-erbB-2 gene was related to lymph node metastasis of gastric carcinoma (P< 0.05) . Conclusions： The amplification of c-erbB-2 gene and mutation of p53 are related to genesis type, differentiation and metastasis, and thus the detection of these gene expression might be useful in evaluating the biological behavior of the tumors.
, 百拇医药
Key Words： Gastric neoplasms; Gene; C-erbB-2; p53; Fluorescence in situ Hybridization (FISH)
荧光原位杂交技术(Fluorscence in situhybridization,FISH)曾用于细胞遗传学染色体的分析[1]，近年来已开始用于肿瘤基因的分析研究[2,3]。我们应用FISH技术检测胃癌、癌旁及正常组织的c-erbB-2和p53基因表达情况，以探讨其与癌的发生、分类、分级和淋巴结转移的关系。
彭文明，等.荧光原位杂交技术检测c-erbB-2和p53基因在胃癌中的表达
1材料和方法
1.1材料
收集我院1996～1998年胃癌根治术切除的标本55例，其中男性34例，女性21例，<50岁11例，>50岁44例，平均年龄61.1岁。每例标本按肿瘤区、移行区(距肿瘤0.5～1cm)和正常区取材。常规固定、包理。切片厚4μm，HE染色，按照Lauren氏组织学分类：肠型31例，弥漫型24例。按WHO分级标准：1级19例、2级13例、3级23例。淋巴结转移35例。
, 百拇医药
1.2试剂
c-erbB-2和p53cDNA生物素探针系中山生物技术有限公司提供。FISH试剂盒系Oncor公司产品。部分试剂自行配制：①20×SSC：88.2g枸橼酸钠，173.3 g Nacl加水至1000ml，高压灭菌。②变性液：28ml去离子甲酰胺，4ml20×SSC，8ml蒸馏水。③PBD液：用下列液代替，1000ml20×SSC，加1.25gTween20，相当于×5PBD。
1.3FISH
切片<4μm，置于硅烷玻片上60℃过夜，脱蜡至80%乙醇，晾干；2×SSC洗，5min×3次；0.2mol·L-1盐酸10min；2×SSC洗，5min×3次；250μg/ml蛋白酶K室温30min；2×SSC洗，5min×3次；梯度乙醇脱水，晾干。切片入85℃变性液，8min后快速入-20℃70%至100%乙醇脱水，各2min，晾干；同时将配好的含有cerbB2或p53探针的杂交液85℃变性5min，然后放在0℃冰浴中10min；滴加含探针杂交液，每片15～20μl，用盖片封盖，置于湿盒中，37℃温箱过夜。取下盖玻片，入50%甲酰胺45℃10min；入2×SSC，40℃，5min；入2×SSC，37℃，5min；入PBD2min；每片滴加15～20μlFITC标记的Avidin加盖塑料膜，湿盒37℃，20分钟；入PBD2min×3次；滴加15～20μl生物素结合的抗Avidin，加盖塑料膜，湿盒中37℃30min；PBD2min×3次；再加15～20μlFITC标记的Avidin，盖塑料膜，湿盒中37℃30min；入PBD2min×3次；滴加PI/Antifade。每片20μl(避光)，直接封片，5min后，荧光镜检。
, 百拇医药
1.4对照
①正常胃粘膜组织；②用2×SSC代替含探针杂交液作对照。
1.5观察
用OlympusBX60荧光显微镜观察[滤镜WB，激发波长490～600nm]，判断结果：细胞核或胞浆中见到多个黄绿色荧光信号，即为阳性。
1.6统计学处理
采用卡方检验和四格表确切概率法。
2结果
2.1荧光原位杂交的染色特点
阳性细胞成群分布，在弥漫型胃癌中荧光信号稍强(图1)，肠型胃癌中，其信号稍弱(图2)。
, 百拇医药
2.2c-erbB-2和p53基因表达阳性与胃癌的关系
c-erbB-2和p53基因表达阳性率在胃癌组织中分别为36.36%和45.45%，移行区为10.91%和3.64%，正常粘膜区为3.64%和0。三区间差异均有极显著意义(P<0.01)。其与组织学类型、分化程度和淋巴结转移的关系见附表。
统计学处理，c-erbB-2和p53基因表达在胃癌肠型和弥漫型间的差异有显著性意义(P<0.05)。在胃癌的组织学分级间也有显著性差异(P<0.05或P<0.01)；cerbB2基因表达阳性还与胃癌的淋巴结转移有关(P<0.05)。p53基因表达在淋巴结内胃癌转移病例中有增高的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。
图1弥漫型胃癌的细胞中可见成簇的p53cDNA探针的黄绿色斑点状荧光(FISH)信号。FISH×3300
, 百拇医药
图2肠型胃癌的癌细胞中可见到多个c-erbB-2cDNA探针的黄绿色斑点状荧光(FISH)信号。FISH×3300
胃癌c-erbB-2和p53基因表达和阳性之间的相互关系：55例胃癌两者同时阳性者12例(21.80%),同时阴性者22例(40%)，统计学处理，两者未见相关关系(P>0.05)。
3讨论
c-erbB-2和p53基因同处于17号染色体上的原癌基因和抑癌基因。c-erbB-2基因的激活或扩增和p53基因的突变与胃癌的发生关系密切[4]。本实验用FISH检测胃癌肿瘤区内c-erbB-2基因阳性率为36.36%，表明c-erbB-2基因的扩增与激活，使得控制胃上皮细胞生长等细胞遗传学上发生了改变。有人曾应用原位杂交方法检测横纹肌肉瘤p53基因表达阳性率为67.4%，明显高于PCR-SSCP法检测p53基因5～8外显子的基因突变率[5]。我们应用p53cDNA探针进行荧光原位杂交检测胃癌，不仅反映出胃癌p53突变型mRNA，而且也能检测出少量的野生型mRNA,其阳性率为45.5%，表明p53基因突变或失活，使得胃的上皮细胞抑癌功能的丧失和获得致癌的效应。因此两者在胃癌的发生上都起着重要的作用。另外，在同一病例共同表达阳性率为21.8%，也进一步证明胃癌的组织学发生与其他肿瘤一样，并非单一基因或某一染色体基因位点突变所致。但两者是否具有协同作用，还需要扩大样本进一步研究。
, 百拇医药
本组检测发现c-erbB-2基因扩增在胃癌正常区和移动区内明显高于p53，后者在正常粘膜区内阴性，提示了c-erbB-2基因激活在胃癌癌变过程中比p53基因突变启动较早，而p53基因突变可能是胃癌癌变晚期事件，故可能对癌前病变的研究有一定的意义。本组结果还发现在肠型胃癌c-erbB-2表达阳性率(51.61%)明显高于弥漫型(16.67%)，而p53阳性率弥漫型(70.83%)明显高于肠型(25.81%)(P<0.05)，提示p53基因突变和cerbB2基因扩增与两型胃癌的组织学发生起源有关。在p53和cerbB2基因表达与胃癌分化程度的关系中仅见高低分化癌之间有明显差异(P<0.01或P<0.05)，但在逐级比较中无显著性意义(0.05)，表明p53和c-erbB-2表达与癌的分化高低有关，但不能作为分级的参数。在与淋巴结内胃癌转移的关系中，c-erbB-2基因阳性表达与淋巴结内胃癌转移呈正相关(P<0.05)，对胃癌的预后判断有一定意义。
表1 胃癌c-erbB-2基因扩增和p53基因突变
, 百拇医药
与组织学分类、分级和淋巴结转移的关系 项目
n
c-erbB-2阳性率(%)
p53阳性率(%)
P值
组织学类型
肠型
31
16(51.61)
8(25.811)
<0.05
弥漫型
, http://www.100md.com
24
4(16.67)
17(70.83)
分化程度
Ⅰ
19
3(15.79)
2(10.53)
<0.05
Ⅱ
13
5(38.46)
7(53.85)
, http://www.100md.com
<0.01
Ⅲ
23
12(52.17)
16(69.57)
淋巴结转移
阳性
35
17(48.57)
19(54.29)
<0.05*
阴性
, 百拇医药 20
3(15.00)
6(30.00)
基金项目：本课题受广州市科委基金项目(No：1999-Z-102-10)资助
[参考文献]
1，Hou JW, Liu CH, Wang TR, et al. Mosaic ring chromosome 13 analyzed by fluorescence in situ hybridization： report of a case [J]. J Formos Med Assoc, 1992， 91： 1108～ 1111.
2，Anastasi J,Le Beau MM, Vardiman JW, et al. Detection of trisomy 12 in chronic lymphocytic leukemia by fluorscenec in situ hybridization to interphase cells： ausimple and sensitive method [J]. Blood,1992,79： 1796～ 1801.
, http://www.100md.com
3，Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, et al. erbB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992， 89： 5321～ 5325.
4，Jang WI, Yang WJ, Lee CI, et al. Immunohistochemical detection of p53 protein, c-erbB-2 protein, epidermal growth factor receptor protein and proliferating cell nuclear antigen in gastric carcinoma [J]. J Korean Med Sci, 1993， 8(4)：293～304.
5，赖日权，王卓才，折晓宁,等.横纹肌肉瘤中MDM2及p53基因表达的原位杂交检测 [J].中华病理学杂志，1998，27(2)：127～129.
收稿日期：1999-09-29；修回日期：1999-11-30, http://www.100md.com
单位：彭文明 麦卫阳 郑秀玲 周敏能 方云光 黄锐明 钟慕贞 刘少颜(广州市第二人民医院病理科,广东 广州510150)
关键词：胃肿瘤；基因；p53，c-erbB-2；荧光原位杂交(FISH)
癌症000509
【摘要】目的：探讨胃癌组织中c-erbB-2和p53基因的表达及其意义。方法：应用荧光原位杂交技术对55例胃癌及移行区、正常区组织的常规石蜡包埋标本进行检测。结果：c-erbB-2和p53基因表达的阳性率分别为36.36%和45.45%，移行区为10.91%和3.64%，正常粘膜区为3.64%和0，三区间差异均有极显著意义(P值均<0.01)。在肠型和弥漫型胃癌中，c-erbB-2阳性率分别为51.61%和16.67%，p53阳性率分别为25.81%和70.83%，其在两型间的差异有显著性意义(P<0.05)。c-erbB-2和p53基因表达与胃癌的组织学分级有关(P<0.05或P<0.01)；c-erbB-2基因表达阳性与胃癌的淋巴结内转移有关(P<0.05)。结论：c-erbB-2基因扩增和p53基因突变与胃癌的发生、类型、分化和转移有关，其测定可有助于确定肿瘤的生物学行为。
, 百拇医药
中图分类号：R735.2文献标识码：A文章编号：1000-467X(2000)05-0426-03
Detection of c-erbB-2 and p53 gene expression in human gastric carcinoma by fluorescence in situ hybridization
PENG Wen-ming, MAI Wei-yang, ZHENG Xiu-ling, et al.
(Second People's Hospital Guangzhou, Guangzhou 510150,P.R.China)
【Abstract】 Objective： To investigate the expression of c-erbB-2 and p53 gene in gastric carcinoma. Method： The C-erbB-2 and p53 expressions were dedected by in situ hybridization (FISH) for 55 cases of gastric carcinoma tissues, their transitional region tissues and normal tissues of formalin-fixed, paraffinembedded sections. Results： The positive rate of c-erbB-2 and p53 were 36.1% and 45.5% in cancer tissues, 10.91% and 3.64% in transitional regions, 3.64% and 0 in normal regions respectively. There were highly significant differences among the three regions (all P<0.001). In intestinal type and diffuse type gastric carcinoma, the incidences of c-erbB-2 were 51.61% and 16.37% , and of p53 were 25.8% and 70.83% respectively,which was significantly different between two types (all P< 0.05). The expression of c-erbB-2 and p53 gene were also correlated with the histological grades of the tumors (P< 0.01 or 0.05) . The positive of C-erbB-2 gene was related to lymph node metastasis of gastric carcinoma (P< 0.05) . Conclusions： The amplification of c-erbB-2 gene and mutation of p53 are related to genesis type, differentiation and metastasis, and thus the detection of these gene expression might be useful in evaluating the biological behavior of the tumors.
, 百拇医药
Key Words： Gastric neoplasms; Gene; C-erbB-2; p53; Fluorescence in situ Hybridization (FISH)
荧光原位杂交技术(Fluorscence in situhybridization,FISH)曾用于细胞遗传学染色体的分析[1]，近年来已开始用于肿瘤基因的分析研究[2,3]。我们应用FISH技术检测胃癌、癌旁及正常组织的c-erbB-2和p53基因表达情况，以探讨其与癌的发生、分类、分级和淋巴结转移的关系。
彭文明，等.荧光原位杂交技术检测c-erbB-2和p53基因在胃癌中的表达
1材料和方法
1.1材料
收集我院1996～1998年胃癌根治术切除的标本55例，其中男性34例，女性21例，<50岁11例，>50岁44例，平均年龄61.1岁。每例标本按肿瘤区、移行区(距肿瘤0.5～1cm)和正常区取材。常规固定、包理。切片厚4μm，HE染色，按照Lauren氏组织学分类：肠型31例，弥漫型24例。按WHO分级标准：1级19例、2级13例、3级23例。淋巴结转移35例。
, 百拇医药
1.2试剂
c-erbB-2和p53cDNA生物素探针系中山生物技术有限公司提供。FISH试剂盒系Oncor公司产品。部分试剂自行配制：①20×SSC：88.2g枸橼酸钠，173.3 g Nacl加水至1000ml，高压灭菌。②变性液：28ml去离子甲酰胺，4ml20×SSC，8ml蒸馏水。③PBD液：用下列液代替，1000ml20×SSC，加1.25gTween20，相当于×5PBD。
1.3FISH
切片<4μm，置于硅烷玻片上60℃过夜，脱蜡至80%乙醇，晾干；2×SSC洗，5min×3次；0.2mol·L-1盐酸10min；2×SSC洗，5min×3次；250μg/ml蛋白酶K室温30min；2×SSC洗，5min×3次；梯度乙醇脱水，晾干。切片入85℃变性液，8min后快速入-20℃70%至100%乙醇脱水，各2min，晾干；同时将配好的含有cerbB2或p53探针的杂交液85℃变性5min，然后放在0℃冰浴中10min；滴加含探针杂交液，每片15～20μl，用盖片封盖，置于湿盒中，37℃温箱过夜。取下盖玻片，入50%甲酰胺45℃10min；入2×SSC，40℃，5min；入2×SSC，37℃，5min；入PBD2min；每片滴加15～20μlFITC标记的Avidin加盖塑料膜，湿盒37℃，20分钟；入PBD2min×3次；滴加15～20μl生物素结合的抗Avidin，加盖塑料膜，湿盒中37℃30min；PBD2min×3次；再加15～20μlFITC标记的Avidin，盖塑料膜，湿盒中37℃30min；入PBD2min×3次；滴加PI/Antifade。每片20μl(避光)，直接封片，5min后，荧光镜检。
, 百拇医药
1.4对照
①正常胃粘膜组织；②用2×SSC代替含探针杂交液作对照。
1.5观察
用OlympusBX60荧光显微镜观察[滤镜WB，激发波长490～600nm]，判断结果：细胞核或胞浆中见到多个黄绿色荧光信号，即为阳性。
1.6统计学处理
采用卡方检验和四格表确切概率法。
2结果
2.1荧光原位杂交的染色特点
阳性细胞成群分布，在弥漫型胃癌中荧光信号稍强(图1)，肠型胃癌中，其信号稍弱(图2)。
, 百拇医药
2.2c-erbB-2和p53基因表达阳性与胃癌的关系
c-erbB-2和p53基因表达阳性率在胃癌组织中分别为36.36%和45.45%，移行区为10.91%和3.64%，正常粘膜区为3.64%和0。三区间差异均有极显著意义(P<0.01)。其与组织学类型、分化程度和淋巴结转移的关系见附表。
统计学处理，c-erbB-2和p53基因表达在胃癌肠型和弥漫型间的差异有显著性意义(P<0.05)。在胃癌的组织学分级间也有显著性差异(P<0.05或P<0.01)；cerbB2基因表达阳性还与胃癌的淋巴结转移有关(P<0.05)。p53基因表达在淋巴结内胃癌转移病例中有增高的趋势，但无统计学意义(P>0.05)。
图1弥漫型胃癌的细胞中可见成簇的p53cDNA探针的黄绿色斑点状荧光(FISH)信号。FISH×3300
, 百拇医药
图2肠型胃癌的癌细胞中可见到多个c-erbB-2cDNA探针的黄绿色斑点状荧光(FISH)信号。FISH×3300
胃癌c-erbB-2和p53基因表达和阳性之间的相互关系：55例胃癌两者同时阳性者12例(21.80%),同时阴性者22例(40%)，统计学处理，两者未见相关关系(P>0.05)。
3讨论
c-erbB-2和p53基因同处于17号染色体上的原癌基因和抑癌基因。c-erbB-2基因的激活或扩增和p53基因的突变与胃癌的发生关系密切[4]。本实验用FISH检测胃癌肿瘤区内c-erbB-2基因阳性率为36.36%，表明c-erbB-2基因的扩增与激活，使得控制胃上皮细胞生长等细胞遗传学上发生了改变。有人曾应用原位杂交方法检测横纹肌肉瘤p53基因表达阳性率为67.4%，明显高于PCR-SSCP法检测p53基因5～8外显子的基因突变率[5]。我们应用p53cDNA探针进行荧光原位杂交检测胃癌，不仅反映出胃癌p53突变型mRNA，而且也能检测出少量的野生型mRNA,其阳性率为45.5%，表明p53基因突变或失活，使得胃的上皮细胞抑癌功能的丧失和获得致癌的效应。因此两者在胃癌的发生上都起着重要的作用。另外，在同一病例共同表达阳性率为21.8%，也进一步证明胃癌的组织学发生与其他肿瘤一样，并非单一基因或某一染色体基因位点突变所致。但两者是否具有协同作用，还需要扩大样本进一步研究。
, 百拇医药
本组检测发现c-erbB-2基因扩增在胃癌正常区和移动区内明显高于p53，后者在正常粘膜区内阴性，提示了c-erbB-2基因激活在胃癌癌变过程中比p53基因突变启动较早，而p53基因突变可能是胃癌癌变晚期事件，故可能对癌前病变的研究有一定的意义。本组结果还发现在肠型胃癌c-erbB-2表达阳性率(51.61%)明显高于弥漫型(16.67%)，而p53阳性率弥漫型(70.83%)明显高于肠型(25.81%)(P<0.05)，提示p53基因突变和cerbB2基因扩增与两型胃癌的组织学发生起源有关。在p53和cerbB2基因表达与胃癌分化程度的关系中仅见高低分化癌之间有明显差异(P<0.01或P<0.05)，但在逐级比较中无显著性意义(0.05)，表明p53和c-erbB-2表达与癌的分化高低有关，但不能作为分级的参数。在与淋巴结内胃癌转移的关系中，c-erbB-2基因阳性表达与淋巴结内胃癌转移呈正相关(P<0.05)，对胃癌的预后判断有一定意义。
表1 胃癌c-erbB-2基因扩增和p53基因突变
, 百拇医药
与组织学分类、分级和淋巴结转移的关系 项目
n
c-erbB-2阳性率(%)
p53阳性率(%)
P值
组织学类型
肠型
31
16(51.61)
8(25.811)
<0.05
弥漫型
, http://www.100md.com
24
4(16.67)
17(70.83)
分化程度
Ⅰ
19
3(15.79)
2(10.53)
<0.05
Ⅱ
13
5(38.46)
7(53.85)
, http://www.100md.com
<0.01
Ⅲ
23
12(52.17)
16(69.57)
淋巴结转移
阳性
35
17(48.57)
19(54.29)
<0.05*
阴性
, 百拇医药 20
3(15.00)
6(30.00)
基金项目：本课题受广州市科委基金项目(No：1999-Z-102-10)资助
[参考文献]
1，Hou JW, Liu CH, Wang TR, et al. Mosaic ring chromosome 13 analyzed by fluorescence in situ hybridization： report of a case [J]. J Formos Med Assoc, 1992， 91： 1108～ 1111.
2，Anastasi J,Le Beau MM, Vardiman JW, et al. Detection of trisomy 12 in chronic lymphocytic leukemia by fluorscenec in situ hybridization to interphase cells： ausimple and sensitive method [J]. Blood,1992,79： 1796～ 1801.
, http://www.100md.com
3，Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, et al. erbB2 amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992， 89： 5321～ 5325.
4，Jang WI, Yang WJ, Lee CI, et al. Immunohistochemical detection of p53 protein, c-erbB-2 protein, epidermal growth factor receptor protein and proliferating cell nuclear antigen in gastric carcinoma [J]. J Korean Med Sci, 1993， 8(4)：293～304.
5，赖日权，王卓才，折晓宁,等.横纹肌肉瘤中MDM2及p53基因表达的原位杂交检测 [J].中华病理学杂志，1998，27(2)：127～129.
收稿日期：1999-09-29；修回日期：1999-11-30, http://www.100md.com