碱性成纤维细胞生长因子在周围神经损伤局部的基因表达与细胞定位
作者：池雷霆 裴福兴 王光林 夏庆杰 杨静 刘涟
单位：池雷霆 裴福兴 王光林 杨静(610041成都，华西医科大学附属第一医院骨科)；夏庆杰(医学遗传教研室)；刘涟(四川大学图形图像分析研究所)
关键词：疾病模型；动物；创伤和损伤；成纤维细胞生长因子；碱性；基因表达；神经再生
中华骨科杂志000513
【摘要】目的观察碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)mRNA在周围神经损伤后的局部表达规律及细胞定位。方法60只Wistar大鼠随机分为正常组(4只)、对照组和实验组(各28只)。用改良持针器钳夹大鼠坐骨神经制成神经挤压伤模型，分别于术后4h，1、3、7、14、21、28d处死大鼠，切取包括挤压伤及其上下各2mm的神经段，应用引物原位标记技术(primedinsitulabeling,PRINS)，结合光镜及计算机图像分析系统检测损伤局部的bFGFmRNA表达变化及细胞定位，分别以图像分析结果中灰度值和阳性面积值表示bFGFmRNA的表达强度和阳性细胞数。结果实验组于术后4h，表达强度开始增加(176.07±16.64)，阳性细胞数增多[(725.33±60.45)μm2]，与正常组及对照组比较差异有显著性意义(均P<0.05)；术后7d，表达强度最高(122.89±10.77)，阳性细胞数最多[(1876.35±108.40)μm2]，与对照组比较差异有显著性意义(均P<0.05)；术后28d表达强度(189.85±19.51)及阳性细胞数[(605.25±36.40)μm2]均降至正常组及对照组水平(P>0.05)。结论周围神经损伤后内源性bFGFmRNA表达增强有助于神经再生。
, 百拇医药
The expression and cellular localization of basic fibroblast growth factor mRNA in peripheral nerve following crushed injury
CHI Leiting, PEI Fuxing, WANG Guanglin, et al
Department of Orthopaedic Surgery, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China
【 Abstract】 Objective To observe the expression and cellular localization of basic fibroblast growth factor (bFGF) mRNA in the peripheral nerve following crushed injury. Methods Sixty male Wistar rats (nine weeks old) were randomly divided into normal (n=4), control (n=28) and experimental group (n=28). In the normal group, all rats were not operated upon before sacrifice. In the control group, the sciatic nerve was only exposed by operation, while in the experimental group, the sciatic nerve of rats were crushed by modified needle holder for 5 minutes and Sunderland Ⅱ type injury were produced. The rats were sacrificed at 4th hour, 1, 3, 7, 14, 21, and 28th day, and the crushed region (including adjacent 2 mm) of nerve were removed for dectecting bFGF mRNA. Primed in situ labeling (PRINS) combining with light electromicroscopy and computer image analysis system were used to monitor the expression intensity and numbers of positive cells of bFGF mRNA. The gray colour scores and size of area represent the expression intensity and numbers of positive cells respectively. Results The expression intensity 176.07± 16.64 and number of positive expressing cells (725.33± 60.45)μ m2 began to increase at 4th hour in experimental group. The differences were obvious comparing with normal and control group (P< 0.05). The expression of bFGF mRNA reached highest level at 7th day,intensity 122.89± 10.77, positive cells(1 876.35± 108.40)μ m2 and returned to the control levels at 28th day after crushing injury,intensity 189.85± 19.51, positive cells(605.25± 36.40)μ m 2(P >0.05). bFGF mRNA were mainly expressed by Schwann cells, macrophages, fibroblasts and vascular endothelial cells. Conclusion The increase of the expression of endogenous bFGF mRNA may enhance regeneration of peripheral nerve after injury.
, 百拇医药
【 Key words】 Disease model,animal; Wounds and injuries; Fibroblast growth factor,basic; Gene expression; Nerve regeneration
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种具有很强生物学活性的阳离子多肽。它在神经系统的广泛分布提示它与神经系统的发育、营养及维持正常功能密不可分。外源性bFGF具有明显地促周围神经细胞再生作用[1]，但其作用机制尚不清楚。运用现代分子生物学技术检测内源性bFGF在周围神经损伤后的表达变化是探明其作用机制的重要环节之一。本研究应用引物原位标记技术(primed in situ labeling,PRINS)检测bFGF mRNA在周围神经损伤时的局部表达变化与细胞定位，以探讨其促神经再生机制。
材料与方法
, 百拇医药
一、主要仪器和试剂
MIAS-2000图像分析系统，由四川大学图形图像分析研究所提供。地高辛标记和检测试剂盒、蛋白酶K及RT-PCR试剂盒均为德国宝灵曼公司产品。bFGF引物为中科院上海细胞所赛尔生物技术公司合成。检测方法均按试剂盒要求操作。
二、动物模型制作
实验用动物为雄性9周龄Wistar大鼠60只，体重150～200g，随机分为正常组4只(只做切口，不行手术。用以鉴别手术切口是否会对bFGFmRNA在坐骨神经中的表达产生影响)、对照组及实验组各28只。实验组大鼠经乙醚吸入麻醉后暴露左侧坐骨神经并在坐骨切迹下1cm处用改良持针钳压至第3格钳夹，造成SunderlandⅡ型损伤[2]，9-0无创缝线标记后逐层缝合。对照组大鼠乙醚吸入麻醉后，仅切开皮肤暴露左侧坐骨神经但不钳夹，在相应部位同法标记后缝合。术后分笼饲养，正常组于手术后4h处死，其余两组分别在术后4h，1、3、7、14、21、28d各处死4只大鼠收集标本。
, 百拇医药
三、标本收集
大鼠乙醚麻醉后，经左心室灌注生理盐水及含体积分数为4%多聚甲醛PBS，然后切取包括挤压伤在内的上下各2mm的坐骨神经段，同法切取正常组及对照组的相应部位等长标本。以体积分数为10%甲醛固定，石蜡包埋，纵切6μm，裱于涂有APES的载玻片上，烤片后4℃密封保存。
四、逆转录实验
标本切片以二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，10μg/ml蛋白酶K37℃消化15min，0.1mol/L甘氨酸/PBS冲洗5min，再以PBS冲洗3次，每次5min。试剂配制成50ml的逆转录反应混合液加至载玻片，50℃50min进行逆转录反应，1∶500抗地高辛抗体37℃作用30min，氮蓝四唑-X磷酸(NBT-BCIP)显色系统避光显色，光镜控色。丙酮酒精固定，水洗，核固红复染3min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
用bFGF反义引物取代正义引物、用PBS取代抗体，省略逆转录步骤及正义引物的方法进行阴性对照。
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五、结果判定
以细胞质、细胞核内出现蓝黑色杂交信号、细胞核复染后呈桃红色判断为光镜下阳性信号，观察bFGFmRNA阳性表达的部位及信号强度的变化。
六、MIAS-2000图像分析
(一)检测内容:用灰度值和阳性面积值对阳性信号进行量化。灰度值表示阳性细胞内信号的强度，灰度值越小则信号越强；阳性面积值表示表达阳性信号细胞数目的多少，阳性面积值越大则阳性细胞的数目越多。
(二)检测方法:标本切片置于光镜下(×200)，输入图像并显示，在同一光强度下检测灰度值和阳性面积值。
七、统计学方法
所有数据均经SPSS/PC+软件包处理，分别采用方差分析及t检验；选择P<0.05为差异显著性标准；结果以均数±标准差表示。
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结果
一、光镜观察结果
在正常组及对照组，雪旺细胞和成纤维细胞的细胞质和细胞核中可见散在的弱阳性信号，雪旺细胞呈长梭形(图1)。实验组于术后4h阳性信号开始增强(图2)；术后1d雪旺细胞的细胞核变圆并核染色加深；术后7d，雪旺细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞的细胞质和细胞核内阳性信号最强，巨噬细胞和雪旺细胞数量明显增多，有大量的新生血管生成、管腔变大(图3～5)；术后14d，阳性信号减弱，阳性细胞数量减少；术后28d，阳性信号强度及阳性细胞数接近正常组及对照组(图6)。全部阴性对照未见阳性信号出现。
图1 术后4h，正常组与对照组雪旺细胞及
成纤维细胞内有散在的弱阳性信号 NBT-BCIP染色×400
, 百拇医药
图2 术后4h，实验组阳性信号开始增强NBT-BCIP染色×400
图3 术后7d，实验组强阳性信号见于雪旺细胞和成纤维细胞，雪旺细胞增殖明显 NBT-BCIP染色×400
图4 术后7d，实验组血管内皮细胞内分布有强阳性信号，血管腔粗大 NBT-BCIP染色×400
图5 术后7d，实验组可见大量巨噬细胞浸润，阳性信号位于巨噬细胞胞质及胞核 NBT-BCIP染色×400
, 百拇医药
图6 术后28d，实验组阳性信号强度接近正常组及对照组水平，雪旺细胞的细胞核形态恢复至长梭形 NBT-BCIP染色×400
二、MIAS-2000图像分析结果
(一)bFGF mRNA阳性表达的灰度值变化:术后4h，实验组灰度值减小，与正常组及对照组比较差异有显著性意义(q=1.3920、1.2148，P<0.05)，术后7d实验组灰度值最低，术后28d灰度值升至正常及对照组水平(表1)。
表1 术后不同时限bFGF mRNA表达的灰度值变化(
±s) 分组
动物数
取材时间
4h
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1d
3d
7d
14d
21d
28d
正常组
4
187.01±12.33
-
-
-
-
, http://www.100md.com -
-
对照组
28
191.29±15.16(4)
190.46±13.23(4)
189.00±12.07(4)
187.57±13.02(4)
189.39±14.10(4)
191.88±16.31(4)
192.17±15.43(4)
, http://www.100md.com 实验组
28
176.07±16.64(4)
153.92±11.86(4)
119.35±9.68(4)
122.89±10.77(4)
162.82±12.46(4)
162.82±12.46(4)
189.85±19.51(4)
F-t组
1.01065*
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4.1131*
9.0032*
13.2690*
7.4961*
2.8312*
0.1866
注:*P<0.05。表2同
(二)bFGF mRNA表达的阳性面积值变化:术后4h，实验组阳性面积值开始增加，与正常组及对照组比较差异有显著性意义(q=5.0660、4.3660,P<0.05)，术后7d阳性面积值最大，术后28d降至正常组及对照组水平(表2)。
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表2 术后不同时限bFGF mRNA表达的阳性面积值变化(±s，μm2) 分组
动物数
取材时间
4h
1d
3d
7d
14d
21d
28d
正常组
, 百拇医药
4
595.21±40.30
-
-
-
-
-
-
对照组
28
613.19±51.37(4)
615.00±55.43(4)
614.32±43.16(4)
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614.32±43.26(4)
610.88±47.31(4)
615.22±45.56(4)
612.18±50.62(4)
实验组
28
725.33±60.45(4)
916.44±100.41(4)
382.34±125.37(4)
876±35±108.40(4)
254.81±105.56(4)
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897.30±92.33(4)
605.25±36.40(4)
F-t组
7.5355*
5.2564*
11.5848*
21.8332*
11.1332*
5.4795*
0.2223
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讨论
bFGF广泛分布于中枢神经及周围神经系统，对维持神经功能及促进神经再生具有重要作用[3]。Kostyk等[4]的研究证实，在钳夹大鼠视神经后bFGF的表达增强有助于保护视觉感受器及刺激视神经再生。Ji等[5]也发现，在切断大鼠坐骨神经后bFGF mRNA的表达水平及阳性细胞数目迅速增高，在伤后3d约有80%的背根节神经元出现阳性表达，而且非神经细胞bFGF mRNA的表达也有所增强。提示bFGF的表达增强是背根节神经元对机械损伤的保护性反应，有维持神经元存活和促进坐骨神经再生的作用。本组结果显示，在伤后4h，大鼠坐骨神经中的bFGF mRNA表达开始增强，阳性表达的细胞数量增多，伤后7d达高峰，阳性细胞数目最多。表明周围神经损伤后内源性bFGF mRNA表达的增强有助于周围神经再生。bFGF mRNA的增加使其翻译产物亦相应增加，内源性bFGF通过发挥其多种生物学活性以达到促进周围神经再生的效果。
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当神经损伤后，主要有四种细胞参与周围神经细胞的再生过程，即雪旺细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞[6]。雪旺细胞在伤后24h开始分裂增殖，3d明显增加，7d达高峰，2～4周增殖停止并形成Bungner带[7]。周围神经损伤后雪旺细胞的病理变化与其内源性bFGFmRNA表达的变化规律相吻合，说明雪旺细胞在增殖过程中伴随bFGF转录水平的增强。bFGF与跨膜受体结合后被内在化而最终定位于细胞浆和细胞核，通过影响RNA聚合酶Ⅰ来加强核蛋白体基因的转录，加速细胞由G0→G1、G1→S期的转换，促进细胞的分裂与增殖。周围神经损伤后雪旺细胞的分裂增殖一方面为神经再生构建支架，另一方面又可通过其细胞内bFGF mRNA的表达增强来增加内源性bFGF的合成与分泌，促进自身及其他非神经的分裂增殖，促进周围神经再生。
本研究首次采用PRINS技术成功地检测出大鼠坐骨神经挤压伤局部bFGFmRNA的表达规律及细胞定位。PRINS结合地高辛配基系统检测DNA，其灵敏度可达30fg，接近放射自显影水平[8]。它与原位杂交的区别在于引物是非标记的，避免了原位杂交中出现的背景着色、标记效率低、同位素放射性污染等问题，具有操作简便、实验周期短、相对经济等优点，可替代原位杂交成为分子病理学研究及细胞基因快速诊断的有效工具。
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670729)
参 考 文 献
1，唐孝明，裴福兴，谭健三.碱性成纤维细胞生长因子促神经再生的实验研究.中华显微外科杂志，1998,21:201-204.
2，廖维靖，南登昆，黄彬鉴.一种评定周围神经损伤及其再生和(或)功能恢复的实验新方法.中国康复，1992,4:151-154.
3，Hassan SM, Kerkhoff M, Troost D, et al. Basic fibroblast growth factor immunoreactivity in the peripheral motor system of the rat. Acta Neuropathol(Berl), 1994, 87: 405- 410.
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4，Kostyk SK, D Amore PA, Herman IM, et al. Optic nerve injury alters basic fibroblast growth factor localization in the retina and optic tract. J Neurosci, 1994,14(3 pt 2): 1441- 1449.
5，Ji RR, Zhang Q, Zhang X, et al. Prominent expression of bFGF in dorsal root ganglia after axotomy. Eur J Neurosci, 1995, 7: 2458- 2468.
6，忻元培，朱家恺.雪旺氏细胞与神经再生.中华显微外科杂志，1988,11:95-99.
7，Stachowiak WK, Moffett J, Joy A, et al. Regulation of bFGF gene expression and subcellular distribution of bFGF protein in adrenal medullary cells. J Cell Biol, 1994,127: 203- 223.
8，乔旭刚，朱平，李崇高.用地高辛配基标记探针原位杂交检测单拷贝基因.中华医学遗传杂志，1995,1:59-60.
(收稿日期：1999-01-11), http://www.100md.com
单位：池雷霆 裴福兴 王光林 杨静(610041成都，华西医科大学附属第一医院骨科)；夏庆杰(医学遗传教研室)；刘涟(四川大学图形图像分析研究所)
关键词：疾病模型；动物；创伤和损伤；成纤维细胞生长因子；碱性；基因表达；神经再生
中华骨科杂志000513
【摘要】目的观察碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)mRNA在周围神经损伤后的局部表达规律及细胞定位。方法60只Wistar大鼠随机分为正常组(4只)、对照组和实验组(各28只)。用改良持针器钳夹大鼠坐骨神经制成神经挤压伤模型，分别于术后4h，1、3、7、14、21、28d处死大鼠，切取包括挤压伤及其上下各2mm的神经段，应用引物原位标记技术(primedinsitulabeling,PRINS)，结合光镜及计算机图像分析系统检测损伤局部的bFGFmRNA表达变化及细胞定位，分别以图像分析结果中灰度值和阳性面积值表示bFGFmRNA的表达强度和阳性细胞数。结果实验组于术后4h，表达强度开始增加(176.07±16.64)，阳性细胞数增多[(725.33±60.45)μm2]，与正常组及对照组比较差异有显著性意义(均P<0.05)；术后7d，表达强度最高(122.89±10.77)，阳性细胞数最多[(1876.35±108.40)μm2]，与对照组比较差异有显著性意义(均P<0.05)；术后28d表达强度(189.85±19.51)及阳性细胞数[(605.25±36.40)μm2]均降至正常组及对照组水平(P>0.05)。结论周围神经损伤后内源性bFGFmRNA表达增强有助于神经再生。
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The expression and cellular localization of basic fibroblast growth factor mRNA in peripheral nerve following crushed injury
CHI Leiting, PEI Fuxing, WANG Guanglin, et al
Department of Orthopaedic Surgery, The First University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China
【 Abstract】 Objective To observe the expression and cellular localization of basic fibroblast growth factor (bFGF) mRNA in the peripheral nerve following crushed injury. Methods Sixty male Wistar rats (nine weeks old) were randomly divided into normal (n=4), control (n=28) and experimental group (n=28). In the normal group, all rats were not operated upon before sacrifice. In the control group, the sciatic nerve was only exposed by operation, while in the experimental group, the sciatic nerve of rats were crushed by modified needle holder for 5 minutes and Sunderland Ⅱ type injury were produced. The rats were sacrificed at 4th hour, 1, 3, 7, 14, 21, and 28th day, and the crushed region (including adjacent 2 mm) of nerve were removed for dectecting bFGF mRNA. Primed in situ labeling (PRINS) combining with light electromicroscopy and computer image analysis system were used to monitor the expression intensity and numbers of positive cells of bFGF mRNA. The gray colour scores and size of area represent the expression intensity and numbers of positive cells respectively. Results The expression intensity 176.07± 16.64 and number of positive expressing cells (725.33± 60.45)μ m2 began to increase at 4th hour in experimental group. The differences were obvious comparing with normal and control group (P< 0.05). The expression of bFGF mRNA reached highest level at 7th day,intensity 122.89± 10.77, positive cells(1 876.35± 108.40)μ m2 and returned to the control levels at 28th day after crushing injury,intensity 189.85± 19.51, positive cells(605.25± 36.40)μ m 2(P >0.05). bFGF mRNA were mainly expressed by Schwann cells, macrophages, fibroblasts and vascular endothelial cells. Conclusion The increase of the expression of endogenous bFGF mRNA may enhance regeneration of peripheral nerve after injury.
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【 Key words】 Disease model,animal; Wounds and injuries; Fibroblast growth factor,basic; Gene expression; Nerve regeneration
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种具有很强生物学活性的阳离子多肽。它在神经系统的广泛分布提示它与神经系统的发育、营养及维持正常功能密不可分。外源性bFGF具有明显地促周围神经细胞再生作用[1]，但其作用机制尚不清楚。运用现代分子生物学技术检测内源性bFGF在周围神经损伤后的表达变化是探明其作用机制的重要环节之一。本研究应用引物原位标记技术(primed in situ labeling,PRINS)检测bFGF mRNA在周围神经损伤时的局部表达变化与细胞定位，以探讨其促神经再生机制。
材料与方法
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一、主要仪器和试剂
MIAS-2000图像分析系统，由四川大学图形图像分析研究所提供。地高辛标记和检测试剂盒、蛋白酶K及RT-PCR试剂盒均为德国宝灵曼公司产品。bFGF引物为中科院上海细胞所赛尔生物技术公司合成。检测方法均按试剂盒要求操作。
二、动物模型制作
实验用动物为雄性9周龄Wistar大鼠60只，体重150～200g，随机分为正常组4只(只做切口，不行手术。用以鉴别手术切口是否会对bFGFmRNA在坐骨神经中的表达产生影响)、对照组及实验组各28只。实验组大鼠经乙醚吸入麻醉后暴露左侧坐骨神经并在坐骨切迹下1cm处用改良持针钳压至第3格钳夹，造成SunderlandⅡ型损伤[2]，9-0无创缝线标记后逐层缝合。对照组大鼠乙醚吸入麻醉后，仅切开皮肤暴露左侧坐骨神经但不钳夹，在相应部位同法标记后缝合。术后分笼饲养，正常组于手术后4h处死，其余两组分别在术后4h，1、3、7、14、21、28d各处死4只大鼠收集标本。
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三、标本收集
大鼠乙醚麻醉后，经左心室灌注生理盐水及含体积分数为4%多聚甲醛PBS，然后切取包括挤压伤在内的上下各2mm的坐骨神经段，同法切取正常组及对照组的相应部位等长标本。以体积分数为10%甲醛固定，石蜡包埋，纵切6μm，裱于涂有APES的载玻片上，烤片后4℃密封保存。
四、逆转录实验
标本切片以二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，10μg/ml蛋白酶K37℃消化15min，0.1mol/L甘氨酸/PBS冲洗5min，再以PBS冲洗3次，每次5min。试剂配制成50ml的逆转录反应混合液加至载玻片，50℃50min进行逆转录反应，1∶500抗地高辛抗体37℃作用30min，氮蓝四唑-X磷酸(NBT-BCIP)显色系统避光显色，光镜控色。丙酮酒精固定，水洗，核固红复染3min，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
用bFGF反义引物取代正义引物、用PBS取代抗体，省略逆转录步骤及正义引物的方法进行阴性对照。
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五、结果判定
以细胞质、细胞核内出现蓝黑色杂交信号、细胞核复染后呈桃红色判断为光镜下阳性信号，观察bFGFmRNA阳性表达的部位及信号强度的变化。
六、MIAS-2000图像分析
(一)检测内容:用灰度值和阳性面积值对阳性信号进行量化。灰度值表示阳性细胞内信号的强度，灰度值越小则信号越强；阳性面积值表示表达阳性信号细胞数目的多少，阳性面积值越大则阳性细胞的数目越多。
(二)检测方法:标本切片置于光镜下(×200)，输入图像并显示，在同一光强度下检测灰度值和阳性面积值。
七、统计学方法
所有数据均经SPSS/PC+软件包处理，分别采用方差分析及t检验；选择P<0.05为差异显著性标准；结果以均数±标准差表示。
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结果
一、光镜观察结果
在正常组及对照组，雪旺细胞和成纤维细胞的细胞质和细胞核中可见散在的弱阳性信号，雪旺细胞呈长梭形(图1)。实验组于术后4h阳性信号开始增强(图2)；术后1d雪旺细胞的细胞核变圆并核染色加深；术后7d，雪旺细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞的细胞质和细胞核内阳性信号最强，巨噬细胞和雪旺细胞数量明显增多，有大量的新生血管生成、管腔变大(图3～5)；术后14d，阳性信号减弱，阳性细胞数量减少；术后28d，阳性信号强度及阳性细胞数接近正常组及对照组(图6)。全部阴性对照未见阳性信号出现。
图1 术后4h，正常组与对照组雪旺细胞及
成纤维细胞内有散在的弱阳性信号 NBT-BCIP染色×400
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图2 术后4h，实验组阳性信号开始增强NBT-BCIP染色×400
图3 术后7d，实验组强阳性信号见于雪旺细胞和成纤维细胞，雪旺细胞增殖明显 NBT-BCIP染色×400
图4 术后7d，实验组血管内皮细胞内分布有强阳性信号，血管腔粗大 NBT-BCIP染色×400
图5 术后7d，实验组可见大量巨噬细胞浸润，阳性信号位于巨噬细胞胞质及胞核 NBT-BCIP染色×400
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图6 术后28d，实验组阳性信号强度接近正常组及对照组水平，雪旺细胞的细胞核形态恢复至长梭形 NBT-BCIP染色×400
二、MIAS-2000图像分析结果
(一)bFGF mRNA阳性表达的灰度值变化:术后4h，实验组灰度值减小，与正常组及对照组比较差异有显著性意义(q=1.3920、1.2148，P<0.05)，术后7d实验组灰度值最低，术后28d灰度值升至正常及对照组水平(表1)。
表1 术后不同时限bFGF mRNA表达的灰度值变化(
±s) 分组动物数
取材时间
4h
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1d
3d
7d
14d
21d
28d
正常组
4
187.01±12.33
-
-
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-
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-
对照组
28
191.29±15.16(4)
190.46±13.23(4)
189.00±12.07(4)
187.57±13.02(4)
189.39±14.10(4)
191.88±16.31(4)
192.17±15.43(4)
, http://www.100md.com 实验组
28
176.07±16.64(4)
153.92±11.86(4)
119.35±9.68(4)
122.89±10.77(4)
162.82±12.46(4)
162.82±12.46(4)
189.85±19.51(4)
F-t组
1.01065*
, 百拇医药
4.1131*
9.0032*
13.2690*
7.4961*
2.8312*
0.1866
注:*P<0.05。表2同
(二)bFGF mRNA表达的阳性面积值变化:术后4h，实验组阳性面积值开始增加，与正常组及对照组比较差异有显著性意义(q=5.0660、4.3660,P<0.05)，术后7d阳性面积值最大，术后28d降至正常组及对照组水平(表2)。
, 百拇医药
表2 术后不同时限bFGF mRNA表达的阳性面积值变化(
±s，μm2) 分组动物数
取材时间
4h
1d
3d
7d
14d
21d
28d
正常组
, 百拇医药
4
595.21±40.30
-
-
-
-
-
-
对照组
28
613.19±51.37(4)
615.00±55.43(4)
614.32±43.16(4)
, 百拇医药
614.32±43.26(4)
610.88±47.31(4)
615.22±45.56(4)
612.18±50.62(4)
实验组
28
725.33±60.45(4)
916.44±100.41(4)
382.34±125.37(4)
876±35±108.40(4)
254.81±105.56(4)
, http://www.100md.com
897.30±92.33(4)
605.25±36.40(4)
F-t组
7.5355*
5.2564*
11.5848*
21.8332*
11.1332*
5.4795*
0.2223
, http://www.100md.com
讨论
bFGF广泛分布于中枢神经及周围神经系统，对维持神经功能及促进神经再生具有重要作用[3]。Kostyk等[4]的研究证实，在钳夹大鼠视神经后bFGF的表达增强有助于保护视觉感受器及刺激视神经再生。Ji等[5]也发现，在切断大鼠坐骨神经后bFGF mRNA的表达水平及阳性细胞数目迅速增高，在伤后3d约有80%的背根节神经元出现阳性表达，而且非神经细胞bFGF mRNA的表达也有所增强。提示bFGF的表达增强是背根节神经元对机械损伤的保护性反应，有维持神经元存活和促进坐骨神经再生的作用。本组结果显示，在伤后4h，大鼠坐骨神经中的bFGF mRNA表达开始增强，阳性表达的细胞数量增多，伤后7d达高峰，阳性细胞数目最多。表明周围神经损伤后内源性bFGF mRNA表达的增强有助于周围神经再生。bFGF mRNA的增加使其翻译产物亦相应增加，内源性bFGF通过发挥其多种生物学活性以达到促进周围神经再生的效果。
, 百拇医药
当神经损伤后，主要有四种细胞参与周围神经细胞的再生过程，即雪旺细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞[6]。雪旺细胞在伤后24h开始分裂增殖，3d明显增加，7d达高峰，2～4周增殖停止并形成Bungner带[7]。周围神经损伤后雪旺细胞的病理变化与其内源性bFGFmRNA表达的变化规律相吻合，说明雪旺细胞在增殖过程中伴随bFGF转录水平的增强。bFGF与跨膜受体结合后被内在化而最终定位于细胞浆和细胞核，通过影响RNA聚合酶Ⅰ来加强核蛋白体基因的转录，加速细胞由G0→G1、G1→S期的转换，促进细胞的分裂与增殖。周围神经损伤后雪旺细胞的分裂增殖一方面为神经再生构建支架，另一方面又可通过其细胞内bFGF mRNA的表达增强来增加内源性bFGF的合成与分泌，促进自身及其他非神经的分裂增殖，促进周围神经再生。
本研究首次采用PRINS技术成功地检测出大鼠坐骨神经挤压伤局部bFGFmRNA的表达规律及细胞定位。PRINS结合地高辛配基系统检测DNA，其灵敏度可达30fg，接近放射自显影水平[8]。它与原位杂交的区别在于引物是非标记的，避免了原位杂交中出现的背景着色、标记效率低、同位素放射性污染等问题，具有操作简便、实验周期短、相对经济等优点，可替代原位杂交成为分子病理学研究及细胞基因快速诊断的有效工具。
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670729)
参 考 文 献
1，唐孝明，裴福兴，谭健三.碱性成纤维细胞生长因子促神经再生的实验研究.中华显微外科杂志，1998,21:201-204.
2，廖维靖，南登昆，黄彬鉴.一种评定周围神经损伤及其再生和(或)功能恢复的实验新方法.中国康复，1992,4:151-154.
3，Hassan SM, Kerkhoff M, Troost D, et al. Basic fibroblast growth factor immunoreactivity in the peripheral motor system of the rat. Acta Neuropathol(Berl), 1994, 87: 405- 410.
, 百拇医药
4，Kostyk SK, D Amore PA, Herman IM, et al. Optic nerve injury alters basic fibroblast growth factor localization in the retina and optic tract. J Neurosci, 1994,14(3 pt 2): 1441- 1449.
5，Ji RR, Zhang Q, Zhang X, et al. Prominent expression of bFGF in dorsal root ganglia after axotomy. Eur J Neurosci, 1995, 7: 2458- 2468.
6，忻元培，朱家恺.雪旺氏细胞与神经再生.中华显微外科杂志，1988,11:95-99.
7，Stachowiak WK, Moffett J, Joy A, et al. Regulation of bFGF gene expression and subcellular distribution of bFGF protein in adrenal medullary cells. J Cell Biol, 1994,127: 203- 223.
8，乔旭刚，朱平，李崇高.用地高辛配基标记探针原位杂交检测单拷贝基因.中华医学遗传杂志，1995,1:59-60.
(收稿日期：1999-01-11), http://www.100md.com