干式化学法与比浊法检测脑脊液蛋白的比较
作者：黎运西 范瑾瑾
单位：黎运西(广东省顺德市第一人民医院检验科 528300)；范瑾瑾(中山医科大学附属第一医院 51008)
关键词：干式化学；比浊；脑脊液；蛋白
广东医学000521 【摘要】 目的 比较干式化学法(A法)与比浊法(B法)在测定脑脊液(CSF)蛋白中的特点，指导临床选择合适的方法。方法 A法和B法分别采用改良双缩脲法和磺基水杨酸-硫酸钠比浊法(即磺柳酸法)对CSF进行测定，并对结果进行统计处理。结果 线性范围：A法为0.2～2.0 g/L，B法为0～2.4 g/L；批内变异系统(CV)：A法为2.11%，B法5.99%；批间CV：A法为3.64%，B法为10.72%；平均回收率：A法103.8%，B法95.0%；两法相关系数r=0.980。结论 两法相关性良好。A法简便、快速、准确、重复性好且适用于自动化分析仪；B法准确、灵敏度高，线性范围宽，但操作较繁琐且干扰因素多。
, 百拇医药
比浊法(B法)是检测CSF蛋白的传统方法[1，2]，该法灵敏度高、线性范围宽，但操作繁琐、精密度较低，干扰因素多。近年来有少数国内外文献报道可用干式化学法(A法)检测CSF蛋白[3]。我们就两法的特点作分析比较，以指导临床选择合适的方法。
1 材料与方法
1.1 样本来源 中山医科大学附属第一医院送检患者新鲜CSF标本(取无黄疸、溶血标本)。
1.2 试剂 磺柳酸试剂：磺基水杨酸3.0 g，无水硫酸钠7.0 g,加水至100 ml；临床化学干片蛋白试剂：批号为CAT 8208431；80 g/L蛋白标准液；124 g/L的血红蛋白(Hb)标准液。
1.3 仪器 COULTER MINI-KEM型光度计，Johnson-Johnson Vitros 750干片式生化分析仪，0℃冰箱。
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1.4 方法
1.4.1 A法 将CSF离心15 min(3 000 r/min)后取上清液加到Johnson-Johnson Vitros 750干片式生化分析仪上，仪器自动将液体检品加到特定载体干片试剂上，以检品中的水作溶剂，蛋白质与干片试剂中的改良双缩脲进行反应，产生有色物质，在波长670 nm下测反射吸光度，由于蛋白含量与反射吸光度成正比，故可通过测反射吸光度求蛋白浓度。
1.4.2 B法 将CSF按1.4.1所述条件离心后取上清0.5 ml加磺柳酸试剂4 ml，摇匀，室温(25℃，下同)静置10 min，然后使用COULTER MINI-KEM型光度计在波长530 nm、光径1 cm下以蒸馏水调零比色，测其吸光度，根据蛋白质含量与吸光度呈正比的关系即可由所测吸光度求得CSF蛋白浓度。
2 结果
2.1 线性试验 用80 g/L的蛋白标准液加蒸馏水配成不同浓度，分别用两法测定，得A法回归方程(浓度校正公式)：YA=0.702 XA+0.197(YA为CSF蛋白浓度，XA为CSF测值)；B法回归方程(浓度计算公式)：YA=2.437 XB+0.033(XB为B法所测CSF吸光度。YB为CSF蛋白浓度)，绘线性曲线。结果A法在0.2～2.0 g/L内线性良好；B法在0～2.4 g/L内线性良好。
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2.2 重复性
2.2.1 批内重复性 用两法分别对一份混合CSF标本平行测定20次。结果A法S 0.02 g/L，CV 2.11%； B法S 0.03 g/L, CV 5.99%。
2.2.2 批间重复性 用两法分别对同一份混合CSF标本连续检测7 d(每天早、中、晚3次，CSF标本置0℃冰箱保存)，结果A法S 0.03 g/L,CV 3.64%; B法S 0.04 g/L,CV 10.72%。
2.3 回收试验 在不同一份CSF标本中，分别加入不同的蛋白标准液，分别用两法测添加前后值，得平均回收率分别为：A法103.8%， B法95.0%。
2.4 干扰试验
2.4.1 溶血干扰试验 用Hb标准液加蒸馏水配成不同浓度的溶血样本加到CSF中，制成相当Hb终浓度为0.010～0.200 g/L的溶血CSF，分别用A，B两法测其蛋白浓度，结果如表1。
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2.4.2 时间的影响 取一份混合CSF标本，在室温用A，B两法于不同时间分别测其值，结果如表2。
表1 溶血对A，B两法检测结果的干扰 g/L 测定值
相当Hb值
平均偏差
0
0.010
0.025
0.050
0.100
0.150
0.200
, 百拇医药
A法测定值
0.179
0.220
0.309
0.187
0.370
0.563
0.642
A法干扰值
0.008
0.041
0.130
0.191
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0.384
0.463
0.203
B法测定值
0.114
0.122
0.148
0.200
0.268
0.309
0.387
B法干扰值
0.008
, 百拇医药
0.034
0.086
0.154
0.195
0.273
0.125
表2 CSF室温静置时间对A，B两法结果的影响 g/L 测定值
时间(min)
0
5
10
15
, 百拇医药
20
30
45
60
测定值
A法测定值
0.658
0.635
0.679
0.662
0.647
0.651
0.669
, 百拇医药
0.673
B法测定值
0.401
0.501
0.513
0.501
0.520
0.550
0.537
0.542
注：* B法是加磺柳酸试剂形成沉淀后再在室温下静置
2.5 相关试验 用A，B两法同时测42例患者的CSF蛋白浓度，并以测定结果作散点图，数据经统计处理，得回归方程：Y=1.256X-0.103，相关系数r=0.980，P<0.01，A，B两法呈直线相关。
, 百拇医药
3 讨论
本研究结果说明，B法灵敏度较A法高，线性范围也较A法宽。由于A法正常参考值为0.200～0.600 g/L，故A法灵敏度及线性范围已足以适合临床作用。
A法精密度较B法高，可能是由于干式试剂稳定，加样和显色也稳定之故。而B法手工操作较多，人为因素影响较大。CSF标本在摄氏零度冰箱保存1周无明显影响，但冰冻保存的CSF标本对磺柳酸试剂的反应有轻微影响。B法批间重复性差可能还与日间室温差有关[1]。而A法有37℃恒温装置，室温差对重复性影响不大。
在2.3所述浓度范围内，A法回收率较B法高，这与A法的检测原理有关。A法的干片试剂中有一滤过层，样品必须通过这一滤过层才能进入干片试剂中的反应层，因此能将很多对反应有干扰的杂质都隔离在反应层外面，从而提高了A法的准确度。有文献提出，标准液的选择对检测结果准确性的影响相当大，并指出用稀释人血清较为准确[4]，故本实验选用稀释人血清蛋白标准。还有文献指出，标准液是否含有CSF基质也会有所不同，建议用患者标本相关的指定定标值校正[3]。是否能用人CSF蛋白标准，是一个值得探讨的问题。
, 百拇医药
A，B两法均明显受溶血干扰。A法是采用含改良双缩脲的干片试剂与CSF蛋白反应。有文献报道，双缩脲法(包括改良双缩脲法)受溶血影响而使蛋白检测值明显偏高，但可采用导数分光光度法或双波长分光光度法排除这种干扰[5，6]，如能将导数分光光度法应用于A法中，将会收到更好效果。据文献报道，B法亦受溶血干扰，可作自身空白排除[1，2]。但并不能对Hb的实际干扰值加以准确检测而以排除。
B法室温下加沉淀剂后至5 min吸光度呈上升趋势，以后趋于稳定。故应于5 min后测其吸光度较为准确。而CSF室温静置时间对A法检测结果无明显影响。
有文献报道，黄疸对A，B两法检测结果均有影响[1]，但能通过脑膜进入CSF中的胆红素含量很低，对检测结果影响不大。
由于B法是检测CSF蛋白的传统方法，而A法与B法呈直线相关。故随着干式化学法仪器的应用和推广，干式化学法对CSF蛋白检验更优。
, 百拇医药
(本文承中山医科大学附属第一医院俞纯山教授及黄恩芳主任指教，特此志谢)
参考文献
1，郭新荣. 免疫比浊法检测脑脊液蛋白. 南通医学院学报，1997， 17(3)：426
2，赵建友，杜立水. 十二烷基苯磺酸钠比浊法测定脑脊液蛋白. 陕西医学检验，1997， 12(3)：25
3，Lasky FD. Achieving accuracy for routine clinical chemistry methods by using patient specimen correlations to assign calibrator values. Arch Pathol Lab Med, 1993, 117(4):412
4，Gerbaut L , Macart M. Is standardization more important than methodology for assay of total protein in cerebrospinal fluid. Clin Chem, 1986, 32(2):353
5，郭占君. 应用导数分光光度法排除双缩脲反应中溶血干扰. 上海医学检验杂志，1992，(4)：230
6，蔡庆岭. 应用双波长分光光度法在双缩脲反应中排除溶血干扰. 上海医学检验杂志，1989， (4)：212
收稿日期：1999-12-06, http://www.100md.com
单位：黎运西(广东省顺德市第一人民医院检验科 528300)；范瑾瑾(中山医科大学附属第一医院 51008)
关键词：干式化学；比浊；脑脊液；蛋白
广东医学000521 【摘要】 目的 比较干式化学法(A法)与比浊法(B法)在测定脑脊液(CSF)蛋白中的特点，指导临床选择合适的方法。方法 A法和B法分别采用改良双缩脲法和磺基水杨酸-硫酸钠比浊法(即磺柳酸法)对CSF进行测定，并对结果进行统计处理。结果 线性范围：A法为0.2～2.0 g/L，B法为0～2.4 g/L；批内变异系统(CV)：A法为2.11%，B法5.99%；批间CV：A法为3.64%，B法为10.72%；平均回收率：A法103.8%，B法95.0%；两法相关系数r=0.980。结论 两法相关性良好。A法简便、快速、准确、重复性好且适用于自动化分析仪；B法准确、灵敏度高，线性范围宽，但操作较繁琐且干扰因素多。
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比浊法(B法)是检测CSF蛋白的传统方法[1，2]，该法灵敏度高、线性范围宽，但操作繁琐、精密度较低，干扰因素多。近年来有少数国内外文献报道可用干式化学法(A法)检测CSF蛋白[3]。我们就两法的特点作分析比较，以指导临床选择合适的方法。
1 材料与方法
1.1 样本来源 中山医科大学附属第一医院送检患者新鲜CSF标本(取无黄疸、溶血标本)。
1.2 试剂 磺柳酸试剂：磺基水杨酸3.0 g，无水硫酸钠7.0 g,加水至100 ml；临床化学干片蛋白试剂：批号为CAT 8208431；80 g/L蛋白标准液；124 g/L的血红蛋白(Hb)标准液。
1.3 仪器 COULTER MINI-KEM型光度计，Johnson-Johnson Vitros 750干片式生化分析仪，0℃冰箱。
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1.4 方法
1.4.1 A法 将CSF离心15 min(3 000 r/min)后取上清液加到Johnson-Johnson Vitros 750干片式生化分析仪上，仪器自动将液体检品加到特定载体干片试剂上，以检品中的水作溶剂，蛋白质与干片试剂中的改良双缩脲进行反应，产生有色物质，在波长670 nm下测反射吸光度，由于蛋白含量与反射吸光度成正比，故可通过测反射吸光度求蛋白浓度。
1.4.2 B法 将CSF按1.4.1所述条件离心后取上清0.5 ml加磺柳酸试剂4 ml，摇匀，室温(25℃，下同)静置10 min，然后使用COULTER MINI-KEM型光度计在波长530 nm、光径1 cm下以蒸馏水调零比色，测其吸光度，根据蛋白质含量与吸光度呈正比的关系即可由所测吸光度求得CSF蛋白浓度。
2 结果
2.1 线性试验 用80 g/L的蛋白标准液加蒸馏水配成不同浓度，分别用两法测定，得A法回归方程(浓度校正公式)：YA=0.702 XA+0.197(YA为CSF蛋白浓度，XA为CSF测值)；B法回归方程(浓度计算公式)：YA=2.437 XB+0.033(XB为B法所测CSF吸光度。YB为CSF蛋白浓度)，绘线性曲线。结果A法在0.2～2.0 g/L内线性良好；B法在0～2.4 g/L内线性良好。
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2.2 重复性
2.2.1 批内重复性 用两法分别对一份混合CSF标本平行测定20次。结果A法S 0.02 g/L，CV 2.11%； B法S 0.03 g/L, CV 5.99%。
2.2.2 批间重复性 用两法分别对同一份混合CSF标本连续检测7 d(每天早、中、晚3次，CSF标本置0℃冰箱保存)，结果A法S 0.03 g/L,CV 3.64%; B法S 0.04 g/L,CV 10.72%。
2.3 回收试验 在不同一份CSF标本中，分别加入不同的蛋白标准液，分别用两法测添加前后值，得平均回收率分别为：A法103.8%， B法95.0%。
2.4 干扰试验
2.4.1 溶血干扰试验 用Hb标准液加蒸馏水配成不同浓度的溶血样本加到CSF中，制成相当Hb终浓度为0.010～0.200 g/L的溶血CSF，分别用A，B两法测其蛋白浓度，结果如表1。
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2.4.2 时间的影响 取一份混合CSF标本，在室温用A，B两法于不同时间分别测其值，结果如表2。
表1 溶血对A，B两法检测结果的干扰 g/L 测定值
相当Hb值
平均偏差
0
0.010
0.025
0.050
0.100
0.150
0.200
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A法测定值
0.179
0.220
0.309
0.187
0.370
0.563
0.642
A法干扰值
0.008
0.041
0.130
0.191
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0.384
0.463
0.203
B法测定值
0.114
0.122
0.148
0.200
0.268
0.309
0.387
B法干扰值
0.008
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0.034
0.086
0.154
0.195
0.273
0.125
表2 CSF室温静置时间对A，B两法结果的影响 g/L 测定值
时间(min)
0
5
10
15
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20
30
45
60
测定值
A法测定值
0.658
0.635
0.679
0.662
0.647
0.651
0.669
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0.673
B法测定值
0.401
0.501
0.513
0.501
0.520
0.550
0.537
0.542
注：* B法是加磺柳酸试剂形成沉淀后再在室温下静置
2.5 相关试验 用A，B两法同时测42例患者的CSF蛋白浓度，并以测定结果作散点图，数据经统计处理，得回归方程：Y=1.256X-0.103，相关系数r=0.980，P<0.01，A，B两法呈直线相关。
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3 讨论
本研究结果说明，B法灵敏度较A法高，线性范围也较A法宽。由于A法正常参考值为0.200～0.600 g/L，故A法灵敏度及线性范围已足以适合临床作用。
A法精密度较B法高，可能是由于干式试剂稳定，加样和显色也稳定之故。而B法手工操作较多，人为因素影响较大。CSF标本在摄氏零度冰箱保存1周无明显影响，但冰冻保存的CSF标本对磺柳酸试剂的反应有轻微影响。B法批间重复性差可能还与日间室温差有关[1]。而A法有37℃恒温装置，室温差对重复性影响不大。
在2.3所述浓度范围内，A法回收率较B法高，这与A法的检测原理有关。A法的干片试剂中有一滤过层，样品必须通过这一滤过层才能进入干片试剂中的反应层，因此能将很多对反应有干扰的杂质都隔离在反应层外面，从而提高了A法的准确度。有文献提出，标准液的选择对检测结果准确性的影响相当大，并指出用稀释人血清较为准确[4]，故本实验选用稀释人血清蛋白标准。还有文献指出，标准液是否含有CSF基质也会有所不同，建议用患者标本相关的指定定标值校正[3]。是否能用人CSF蛋白标准，是一个值得探讨的问题。
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A，B两法均明显受溶血干扰。A法是采用含改良双缩脲的干片试剂与CSF蛋白反应。有文献报道，双缩脲法(包括改良双缩脲法)受溶血影响而使蛋白检测值明显偏高，但可采用导数分光光度法或双波长分光光度法排除这种干扰[5，6]，如能将导数分光光度法应用于A法中，将会收到更好效果。据文献报道，B法亦受溶血干扰，可作自身空白排除[1，2]。但并不能对Hb的实际干扰值加以准确检测而以排除。
B法室温下加沉淀剂后至5 min吸光度呈上升趋势，以后趋于稳定。故应于5 min后测其吸光度较为准确。而CSF室温静置时间对A法检测结果无明显影响。
有文献报道，黄疸对A，B两法检测结果均有影响[1]，但能通过脑膜进入CSF中的胆红素含量很低，对检测结果影响不大。
由于B法是检测CSF蛋白的传统方法，而A法与B法呈直线相关。故随着干式化学法仪器的应用和推广，干式化学法对CSF蛋白检验更优。
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(本文承中山医科大学附属第一医院俞纯山教授及黄恩芳主任指教，特此志谢)
参考文献
1，郭新荣. 免疫比浊法检测脑脊液蛋白. 南通医学院学报，1997， 17(3)：426
2，赵建友，杜立水. 十二烷基苯磺酸钠比浊法测定脑脊液蛋白. 陕西医学检验，1997， 12(3)：25
3，Lasky FD. Achieving accuracy for routine clinical chemistry methods by using patient specimen correlations to assign calibrator values. Arch Pathol Lab Med, 1993, 117(4):412
4，Gerbaut L , Macart M. Is standardization more important than methodology for assay of total protein in cerebrospinal fluid. Clin Chem, 1986, 32(2):353
5，郭占君. 应用导数分光光度法排除双缩脲反应中溶血干扰. 上海医学检验杂志，1992，(4)：230
6，蔡庆岭. 应用双波长分光光度法在双缩脲反应中排除溶血干扰. 上海医学检验杂志，1989， (4)：212
收稿日期：1999-12-06, http://www.100md.com