在霍奇金病患者淋巴结中检测巨细胞病毒基因
作者：王哲 黄高升曰 阎庆国 陈协群 张晓晖
单位：710032 西安，第四军医大学病理学教研室
关键词：
中华血液学杂志000514 60%的霍奇金病(HD)患者淋巴组织RS和HD细胞中可检测到EB病毒(EBV)[1]，甚至有人报道可高达93%[2]。但EBV可能不是HD的唯一病因。我们利用聚合酶链反应(PCR)及原位杂交的方法直接检测了HD淋巴组织中的HCMV。
材料和方法
1 材料
1.1 标本来源及DNA提取：53例HD患者淋巴结及1例尸检涎腺巨细胞包涵体病的涎腺组织来自第四军医大学病理教研室，其中混合细胞型37例，淋巴细胞减少型5例，结节硬化型10例及滤泡间HD 1例。1例结节硬化型同时留取冰冻组织块及患者全血。5μm贴胶连续切片后，进行原位杂交检测。参照文献中方法[3，4]，提取石蜡包埋组织、冰冻组织及全血DNA，用于PCR。
, 百拇医药
1.2 引物及酶：PCR引物根据HCMV(AD169株)早期基因第4外显子基因设计[4]，5′端引物：5′-TGCTCACGCACATTGATCAC-3′，3′端引物：5′-GTACTGGGCAAAGACCTTCA-3′，扩增273bp的片段(上海Sangon公司合成)。采用EBV套式PCR通用型引物[1]，外引物5′端：5′-CTTTAAAACTCTAAAAATCAAAACTTTAGA-3′，3′端：5′-ACCAGAAATAGCTGCAGGACCACTTTATAC-3′，扩增335bp的片段；内引物5′端：5′-AATGGGCGCCATTTTGTA-3′，3′端：5′-TCCCTAGAACTGACAATT-3′，扩增253bp的片段(Sangon公司)，Taq酶购自Sangon公司。
2 方法
2.1 PCR：5μl标本加入50μl HCMV反应体系(10mmol/L Tris-HCl, 1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl, 0.2mmol/L dNTP,引物1μmol/L, 2U Taq酶)，94℃ 60s,55℃ 50s,72℃ 50s，扩增35个循环后，72℃延伸10min。5μl标本加入50μl EBV反应体系(含外引物：10mmol/L Tris-HCl, 1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl, 0.2mmol/L dNTP,1μmol/L引物，2U Taq酶)，94℃ 40s,60℃ 30s，扩增30个循环，扩增产物2.5μl加入第2次PCR反应体系(含内引物)中，94℃ 30s，55℃ 30s，扩增30个循环。扩增产物于20g/L琼脂糖凝胶上电泳，以出现273bp、253bp扩增片段为阳性，设立阴性对照，感染HCMV的人纤维母细胞系、EBV阳性的B95-8细胞系DNA提取物分别为阳性对照。
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2.2 HCMV的PCR产物变性后，固定于硝酸纤维素膜上，利用一段序列与PCR产物序列互补的寡核苷酸探针[序列为5′-GGTCACTAGTGACGCTTGTATGATGACCATG-3′(Sangon)[4]]，并用末端脱氧核苷酸转移酶(Promega)标记α-32P dATP，进行预杂交、杂交、放射自显影。
2.3 原位杂交：HCMV的PCR产物经凝胶电泳后回收273bp的片段并定量作为探针，按照地高辛标记检测试剂盒(Boehringer Mannheim)说明书进行标记和原位杂交。
结果
53例HD患者中PCR法检测HCMV阳性者13例(图1)，其中混合细胞型10型，淋巴细胞减少型1例，结节硬化型2例，1例冰冻组织及全血为阳性。53例HD患者中共检出EBV阳性14例，阳性率26%，其中混合细胞型8例，结节硬化型4例，淋巴细胞消减型1例，滤泡间HD 1例。13例HCMV阳性病例中仅2例EBV同时阳性，为混合细胞型。1份涎腺组织标本HCMV阳性。原位杂交法检测33例HD患者，HCMV阳性者5例，阳性率15.0%，与PCR阳性者相对应，阳性信号大多位于RS和HD细胞的细胞核或核仁中，有少数小淋巴细胞也呈阳性，其中混合细胞型2例，百分率8.7%，结节硬化型2例，百分率33.3%，淋巴细胞消减型1例，百分率25.0%。打点杂交证实PCR产物确为HCMV基因组的一部分(图2)。
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图1 巨细胞病毒PCR检测结果
讨论
HCMV为DNA病毒，与EBV同属疱疹病毒科。20世纪60年代曾从3例HD患者尿液中发现1例巨细胞病毒阳性。80年代又有作者检测HD患者血中HCMV抗体滴度，但未能明确二者之间的关系。人类感染HCMV后在病变组织中可形成特征性巨细胞包涵体。HCMV感染细胞后，可能诱导宿主细胞DNA聚合酶活性和DNA合成。我们发现，用原位杂交方法有15%的HD患者淋巴组织中可检测到HCMV，并且HCMV阳性信号大多存在于RS和HD细胞的胞核及核仁中，这可以解释部分病例组织中醒目的RS和HD细胞及其特征。在我们的工作中，PCR与原位杂交检测的阳性病例相符，但原位杂交阳性率较PCR低，这可能是方法敏感度不同所致。我们检测的EBV在HD组织中的阳性率与国外一些结果相似[5]，并发现11例HCMV阳性的HD标本EBV阴性。有关HCMV在HD病中的作用机制值得进一步研究。
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图2 打点杂交证实PCR产物为人巨细胞病毒基因组的一部分
参考文献
1，Herbst H, Niedobitek G, Kneba M, et al. High incidence of Epstein-Barr virus geneomes in Hodgkin's disease. Am J Pathol, 1990,137:13-18.
2，Samoszuk M, Ravel J. Frequent detection of Epstein-Barr viral deoxyribonucleic acid and absence of cytomegalovirus deoxyribonucleic acid in Hodgkin's disease and acquired immunodeficiency syndrome-related Hodgkin's disease. Lab Invest, 1991, 65:631-636.
, 百拇医药
3，Jackson DP, Lewis FA, Taylor GR, et al. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by polymerase chain reaction. J Clin Pathol, 1990, 34:499-504.
4，Boland GJ, Weger RAD, Tilanus MGJ, et al. Detection of cytomegalovirus in granulocytes by polymerase chain reaction compared with the CMV antigen test. J Clin Microbiol, 1992, 30:1763-1767.
5，Weiss LM, Strickler JG, Warnke RA, et al. Epstein-Barr viral DNA in tissues of Hodgkin's disease. Am J Pathol, 1987, 129:86-91.
(收稿日期：1999-10-18), 百拇医药
单位：710032 西安，第四军医大学病理学教研室
关键词：
中华血液学杂志000514 60%的霍奇金病(HD)患者淋巴组织RS和HD细胞中可检测到EB病毒(EBV)[1]，甚至有人报道可高达93%[2]。但EBV可能不是HD的唯一病因。我们利用聚合酶链反应(PCR)及原位杂交的方法直接检测了HD淋巴组织中的HCMV。
材料和方法
1 材料
1.1 标本来源及DNA提取：53例HD患者淋巴结及1例尸检涎腺巨细胞包涵体病的涎腺组织来自第四军医大学病理教研室，其中混合细胞型37例，淋巴细胞减少型5例，结节硬化型10例及滤泡间HD 1例。1例结节硬化型同时留取冰冻组织块及患者全血。5μm贴胶连续切片后，进行原位杂交检测。参照文献中方法[3，4]，提取石蜡包埋组织、冰冻组织及全血DNA，用于PCR。
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1.2 引物及酶：PCR引物根据HCMV(AD169株)早期基因第4外显子基因设计[4]，5′端引物：5′-TGCTCACGCACATTGATCAC-3′，3′端引物：5′-GTACTGGGCAAAGACCTTCA-3′，扩增273bp的片段(上海Sangon公司合成)。采用EBV套式PCR通用型引物[1]，外引物5′端：5′-CTTTAAAACTCTAAAAATCAAAACTTTAGA-3′，3′端：5′-ACCAGAAATAGCTGCAGGACCACTTTATAC-3′，扩增335bp的片段；内引物5′端：5′-AATGGGCGCCATTTTGTA-3′，3′端：5′-TCCCTAGAACTGACAATT-3′，扩增253bp的片段(Sangon公司)，Taq酶购自Sangon公司。
2 方法
2.1 PCR：5μl标本加入50μl HCMV反应体系(10mmol/L Tris-HCl, 1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl, 0.2mmol/L dNTP,引物1μmol/L, 2U Taq酶)，94℃ 60s,55℃ 50s,72℃ 50s，扩增35个循环后，72℃延伸10min。5μl标本加入50μl EBV反应体系(含外引物：10mmol/L Tris-HCl, 1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl, 0.2mmol/L dNTP,1μmol/L引物，2U Taq酶)，94℃ 40s,60℃ 30s，扩增30个循环，扩增产物2.5μl加入第2次PCR反应体系(含内引物)中，94℃ 30s，55℃ 30s，扩增30个循环。扩增产物于20g/L琼脂糖凝胶上电泳，以出现273bp、253bp扩增片段为阳性，设立阴性对照，感染HCMV的人纤维母细胞系、EBV阳性的B95-8细胞系DNA提取物分别为阳性对照。
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2.2 HCMV的PCR产物变性后，固定于硝酸纤维素膜上，利用一段序列与PCR产物序列互补的寡核苷酸探针[序列为5′-GGTCACTAGTGACGCTTGTATGATGACCATG-3′(Sangon)[4]]，并用末端脱氧核苷酸转移酶(Promega)标记α-32P dATP，进行预杂交、杂交、放射自显影。
2.3 原位杂交：HCMV的PCR产物经凝胶电泳后回收273bp的片段并定量作为探针，按照地高辛标记检测试剂盒(Boehringer Mannheim)说明书进行标记和原位杂交。
结果
53例HD患者中PCR法检测HCMV阳性者13例(图1)，其中混合细胞型10型，淋巴细胞减少型1例，结节硬化型2例，1例冰冻组织及全血为阳性。53例HD患者中共检出EBV阳性14例，阳性率26%，其中混合细胞型8例，结节硬化型4例，淋巴细胞消减型1例，滤泡间HD 1例。13例HCMV阳性病例中仅2例EBV同时阳性，为混合细胞型。1份涎腺组织标本HCMV阳性。原位杂交法检测33例HD患者，HCMV阳性者5例，阳性率15.0%，与PCR阳性者相对应，阳性信号大多位于RS和HD细胞的细胞核或核仁中，有少数小淋巴细胞也呈阳性，其中混合细胞型2例，百分率8.7%，结节硬化型2例，百分率33.3%，淋巴细胞消减型1例，百分率25.0%。打点杂交证实PCR产物确为HCMV基因组的一部分(图2)。
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图1 巨细胞病毒PCR检测结果
讨论
HCMV为DNA病毒，与EBV同属疱疹病毒科。20世纪60年代曾从3例HD患者尿液中发现1例巨细胞病毒阳性。80年代又有作者检测HD患者血中HCMV抗体滴度，但未能明确二者之间的关系。人类感染HCMV后在病变组织中可形成特征性巨细胞包涵体。HCMV感染细胞后，可能诱导宿主细胞DNA聚合酶活性和DNA合成。我们发现，用原位杂交方法有15%的HD患者淋巴组织中可检测到HCMV，并且HCMV阳性信号大多存在于RS和HD细胞的胞核及核仁中，这可以解释部分病例组织中醒目的RS和HD细胞及其特征。在我们的工作中，PCR与原位杂交检测的阳性病例相符，但原位杂交阳性率较PCR低，这可能是方法敏感度不同所致。我们检测的EBV在HD组织中的阳性率与国外一些结果相似[5]，并发现11例HCMV阳性的HD标本EBV阴性。有关HCMV在HD病中的作用机制值得进一步研究。
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图2 打点杂交证实PCR产物为人巨细胞病毒基因组的一部分
参考文献
1，Herbst H, Niedobitek G, Kneba M, et al. High incidence of Epstein-Barr virus geneomes in Hodgkin's disease. Am J Pathol, 1990,137:13-18.
2，Samoszuk M, Ravel J. Frequent detection of Epstein-Barr viral deoxyribonucleic acid and absence of cytomegalovirus deoxyribonucleic acid in Hodgkin's disease and acquired immunodeficiency syndrome-related Hodgkin's disease. Lab Invest, 1991, 65:631-636.
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3，Jackson DP, Lewis FA, Taylor GR, et al. Tissue extraction of DNA and RNA and analysis by polymerase chain reaction. J Clin Pathol, 1990, 34:499-504.
4，Boland GJ, Weger RAD, Tilanus MGJ, et al. Detection of cytomegalovirus in granulocytes by polymerase chain reaction compared with the CMV antigen test. J Clin Microbiol, 1992, 30:1763-1767.
5，Weiss LM, Strickler JG, Warnke RA, et al. Epstein-Barr viral DNA in tissues of Hodgkin's disease. Am J Pathol, 1987, 129:86-91.
(收稿日期：1999-10-18), 百拇医药