小鼠IL-3 cDNA转染的骨髓基质细胞促进造血的实验研究
作者：袁良平 粟永萍 程天民 郑华金 刘林 王延江 瞿红云
单位：袁良平 粟永萍 程天民 刘林 王延江(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)；郑华金 瞿红云(成都军区总医院血液科)
关键词：
中华血液学杂志000511 骨髓基质细胞是造血微环境中的重要组成部分。我们借助逆转录病毒载体将小鼠白细胞介素3(IL-3)cDNA导入小鼠骨髓基质细胞，利用聚合酶链反应(PCR)检测基质细胞是否导入外源性IL-3基因，并观察其对造血细胞增殖活性的影响。
材料和方法
1 材料 逆转录病毒载体pLXSN及pUC-IL-3质粒由刘昕博士馈赠，工具酶购自宝灵曼及新英格兰公司，BALB/c小鼠购自本校动物中心。
, 百拇医药
2 重组IL-3 cDNA 的构建[1] 用XhoⅠ将载体pLXSN线性化并将IL-3 cDNA由pUC-IL-3质粒上切下(片段约1.2kb)，经V型槽回收，T4 Ligase连接，得到重组子pLXSN-IL-3；用HindⅢ酶切鉴定IL-3片段插入方向。
3 重组逆转录病毒的产生及病毒滴液检测 利用脂质体dosper将pLXSN-IL-3和空载体pLXSN，分别转染入包装细胞PA317，用G418筛选PA317的细胞克隆。用含病毒的培养上清液转染NIH/3T3细胞，计算每皿G418抗性细胞克隆，即为产病毒滴度，以每毫升集落形成单位(CFU/ml)表示，计算公式：抗病毒效价=每皿克隆数×上清稀释倍数。
4 转染小鼠骨髓基质细胞(BMS)[2] 取BALB/c小鼠股骨骨髓，制成单细胞悬液，取1×106个细胞在基质细胞培养体系中培养(DMEM培养液，体积分数为20%的胎牛血清，体积分数为10%的马血清，10-6mol/L氢化可的松，青、链霉素各100U/ml)，3周后加含高效价病毒上清液(以不含病毒的培养液及含空载体的上清液作对照)，继续培养48h，G418筛选，约10d后克隆形成。挑选各组阳性克隆(BMS/pLXSNIL-3和BMS/pLXSN)，培养扩增后收集细胞和上清备用。
, 百拇医药
5 培养基质细胞基因组DNA的提取及基因检测
5.1 按Sambrook等的方法[1]进行培养细胞基因组DNA的提取，真空抽滤至接近干燥，TE溶解后备用。
5.2 PCR检测载体中NeoR基因及IL-3基因：
5.2.1 检测NeoR的基因引物：
引物1：5′-CCAGGCTCAAGGCGCGCATGA-3′；
引物2：3′-TCACGGGTAGCCAACGCTATG-5′。
产物长度170bp。
5.2.2 检测IL-3的基因引物：
, 百拇医药
引物1：5′-CTGAATTCATGGTTCTTGCCAGC-3′；
引物2：5′-TCGTCGACTTAACATTCCACGGTTCC-3′。
产物长度500bp。
PCR反应条件：总反应体积为50μl，其中DNA模板10μl (1μg)，10×缓冲液5μl，引物各1μl(1μg)， MgCl2(15mmol/L) 5μl,dNTP 3μl, dH2O 25μl。95℃ 5min，94℃ 90s，55℃ 60s，72℃ 60s，循环35次，72℃延伸10min。PCR产物经25g/L琼脂糖凝胶电泳，标准DNA分子量为PCR大分子量标记。
6 小鼠骨髓CFU-GM的培养 参照文献[3]的方法，稍作改良。
, 百拇医药 7 噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性 NFS-60细胞分别与基质细胞各组混合培养24h、48h、72h，加入MTT后检测增殖活性。
结 果
1 IL-3 cDNA与逆转录载体pLXSN克隆后，得到重组子pLXSN-IL-3质粒，用XhoⅠ酶切鉴定，证实IL-3 cDNA已重组到pLXSN上。HindⅢ酶切，得到1240bp和633bp 2个片段，前者为正向连接，后者为反向连接。
2 病毒滴度的检测 pLXSN-IL-3和空载体pLXSN经脂质体dosper转染PA317细胞，经G418筛选得到产病毒细胞株，转化NIH/3T3细胞，测得其产毒滴度在105CFU/ml以上。
3 转染基质细胞上清生物活性检测 结果见表1。此结果表明，转染pLXSN/IL-3的基质细胞有明显促进小鼠骨髓CFU-GM增殖的作用， 空载体组及未转染基质细胞组也有促进5.1 按Sambrook等的方法[1]进行培养细胞基因组DNA的提取，真空抽滤至接近干燥，TE溶解后备用。CFU-GM增殖的作用，但不及转染组。
, 百拇医药
表1 骨髓基质细胞培养上清液的生物活性检测(CFU-GM)(
±s) 组 别
上清液的稀释度
5-1
5-2
5-3
5-4
BMS/pLXSNIL-3
765.0±123.4**
603.0±110.4**
, 百拇医药
512.0±68.6**
310.0±58.3**
BMS/pLXSN
260.1±21.4*△
245.6±26.3*△
176.0±21.3*△
121.0±25.4*△
BMS
256.5±22.1*△
248.2±24.2*△
, http://www.100md.com
167.0±24.2*△
118.4±25.6*△
EMEM
40.1±6.6
38.8±7.1
38.2±6.8
34.1±5.7
注：上清液按1∶5稀释；与各组比较，**P<0.01，pLXSN组与BMS组比较，*P<0.05,与DMEM组比较，△P<0.014 PCR检测骨髓基质细胞中外源性基因 将含5%高效价病毒的培养上清液(pLXSN-IL-3和空载体pLXSN)感染BMS，G418筛选，10d后均表现出大量G418抗性克隆，基因转移效率分别为40.3%和52.2%，未转染的BMS组加入G418后3～5d全部死亡(表2)。
, 百拇医药
表2 PCR检测基质细胞中的外源基因 组别
加入上清成分
基因转移
效率(%)
PCR检测
BMS
含pLXSNIL-3
40.3
扩增出NeoR及IL-3基因
BMS
含pLXSN
52.2
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扩增出NeoR，无IL-3基因
BMS
不含pLXSN
0
未扩增出NeoR及IL-3基因
及pLXSN-IL-3
5 NFS-60细胞增殖活性检测 结果见表3。无基质细胞混合培养的NFS-60(亦未加入其它造血因子)培养24h后大部分死亡(未加入MTT检测)，提示基质细胞具有促进NSF-60细胞增殖的作用，但不及转染pLXSN/IL-3的基质细胞。表3 NFS-60细胞增殖活性检测(MTT法，A值) 组别
培养时间
24h
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48h
72h
BMS/pLXSNIL-3
0.68±0.04**
0.76±0.05**
0.70±0.05**
BMS/pLXSN
0.32±0.05*
0.40±0.04*
0.34±0.03*
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BMS
0.30±0.03
0.39±0.03
0.32±0.05
注：与各组比较，**P<0.01；与BMS组比较，*P>0.05讨 论
骨髓造血干/祖细胞的增殖、分化受多方面的调控，除造血因子外，最重要的就是造血微环境。BMS是造血微环境的主要成分，BMS一方面与造血干细胞紧密接触，以保证干细胞的自我更新，另一方面分泌造血生长因子促进造血干/祖细胞的增殖与分化。正常情况下，BMS能少量地分泌IL-3、IL-6、GM-CSF等细胞因子，但浓度不稳定且非常微量。在放、化疗条件下，较高浓度IL-3对恢复骨髓造血有一定促进作用[4]。整合了外源性IL-3 cDNA的基质细胞能显著促进小鼠骨髓CFU-GM的形成，其表达的IL-3具有一定的生物活性。用重组IL-3 cDNA逆转录病毒载体转染的小鼠BMS输入受体小鼠后，在其血清中出现一定水平的IL-3活性(约250U/ml)，且在小鼠被照射后能促进外周血白细胞恢复。基因治疗的关键是正确选择基因导入的靶细胞。有学者将GM-CSF cDNA导入造血细胞PDCP，结果发现GM-CSF转移后PDCP丧失了自我更新能力，同步分化为正常成熟粒-单核细胞[5]。较高浓度的IL-3能刺激IL-3依赖细胞TF-1表达IL-3受体β链，增加细胞对IL-3的亲和力。我们的实验结果证实，转染pLXSN/IL-3的基质细胞有明显促进小鼠骨髓CFU-GM增殖的作用。
, 百拇医药
参考文献
1，Sambrook J, Fritch EF, Manitafis T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 9-11.
2，Kittler EL, McGrath H, Temeles D, et al. Biological significance of constitutive and subliminal growth factor production by bone marrow stroma. Blood, 1992,79:3168-3178.
3，李青,曹雪涛,蔡荣,等.白细胞介素-3基因疗法对同基因骨髓移植造血重建的影响.中华血液学杂志, 1996,17:237-239.
, 百拇医药
4，刘秀珍. 造血祖细胞培养技术实验手册. 北京: 北京出版社, 1993. 45-49.
5，Chang JM,Johnson GR. Effects of spleen colony forming unit self-renewal after retroviral-mediated gene transfer of multi-colony-stimulating factor granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor. Exp Hematol, 1992, 30:602-607.
(收稿日期：1998-11-16), 百拇医药
单位：袁良平 粟永萍 程天民 刘林 王延江(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)；郑华金 瞿红云(成都军区总医院血液科)
关键词：
中华血液学杂志000511 骨髓基质细胞是造血微环境中的重要组成部分。我们借助逆转录病毒载体将小鼠白细胞介素3(IL-3)cDNA导入小鼠骨髓基质细胞，利用聚合酶链反应(PCR)检测基质细胞是否导入外源性IL-3基因，并观察其对造血细胞增殖活性的影响。
材料和方法
1 材料 逆转录病毒载体pLXSN及pUC-IL-3质粒由刘昕博士馈赠，工具酶购自宝灵曼及新英格兰公司，BALB/c小鼠购自本校动物中心。
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2 重组IL-3 cDNA 的构建[1] 用XhoⅠ将载体pLXSN线性化并将IL-3 cDNA由pUC-IL-3质粒上切下(片段约1.2kb)，经V型槽回收，T4 Ligase连接，得到重组子pLXSN-IL-3；用HindⅢ酶切鉴定IL-3片段插入方向。
3 重组逆转录病毒的产生及病毒滴液检测 利用脂质体dosper将pLXSN-IL-3和空载体pLXSN，分别转染入包装细胞PA317，用G418筛选PA317的细胞克隆。用含病毒的培养上清液转染NIH/3T3细胞，计算每皿G418抗性细胞克隆，即为产病毒滴度，以每毫升集落形成单位(CFU/ml)表示，计算公式：抗病毒效价=每皿克隆数×上清稀释倍数。
4 转染小鼠骨髓基质细胞(BMS)[2] 取BALB/c小鼠股骨骨髓，制成单细胞悬液，取1×106个细胞在基质细胞培养体系中培养(DMEM培养液，体积分数为20%的胎牛血清，体积分数为10%的马血清，10-6mol/L氢化可的松，青、链霉素各100U/ml)，3周后加含高效价病毒上清液(以不含病毒的培养液及含空载体的上清液作对照)，继续培养48h，G418筛选，约10d后克隆形成。挑选各组阳性克隆(BMS/pLXSNIL-3和BMS/pLXSN)，培养扩增后收集细胞和上清备用。
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5 培养基质细胞基因组DNA的提取及基因检测
5.1 按Sambrook等的方法[1]进行培养细胞基因组DNA的提取，真空抽滤至接近干燥，TE溶解后备用。
5.2 PCR检测载体中NeoR基因及IL-3基因：
5.2.1 检测NeoR的基因引物：
引物1：5′-CCAGGCTCAAGGCGCGCATGA-3′；
引物2：3′-TCACGGGTAGCCAACGCTATG-5′。
产物长度170bp。
5.2.2 检测IL-3的基因引物：
, 百拇医药
引物1：5′-CTGAATTCATGGTTCTTGCCAGC-3′；
引物2：5′-TCGTCGACTTAACATTCCACGGTTCC-3′。
产物长度500bp。
PCR反应条件：总反应体积为50μl，其中DNA模板10μl (1μg)，10×缓冲液5μl，引物各1μl(1μg)， MgCl2(15mmol/L) 5μl,dNTP 3μl, dH2O 25μl。95℃ 5min，94℃ 90s，55℃ 60s，72℃ 60s，循环35次，72℃延伸10min。PCR产物经25g/L琼脂糖凝胶电泳，标准DNA分子量为PCR大分子量标记。
6 小鼠骨髓CFU-GM的培养 参照文献[3]的方法，稍作改良。
, 百拇医药 7 噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性 NFS-60细胞分别与基质细胞各组混合培养24h、48h、72h，加入MTT后检测增殖活性。
结 果
1 IL-3 cDNA与逆转录载体pLXSN克隆后，得到重组子pLXSN-IL-3质粒，用XhoⅠ酶切鉴定，证实IL-3 cDNA已重组到pLXSN上。HindⅢ酶切，得到1240bp和633bp 2个片段，前者为正向连接，后者为反向连接。
2 病毒滴度的检测 pLXSN-IL-3和空载体pLXSN经脂质体dosper转染PA317细胞，经G418筛选得到产病毒细胞株，转化NIH/3T3细胞，测得其产毒滴度在105CFU/ml以上。
3 转染基质细胞上清生物活性检测 结果见表1。此结果表明，转染pLXSN/IL-3的基质细胞有明显促进小鼠骨髓CFU-GM增殖的作用， 空载体组及未转染基质细胞组也有促进5.1 按Sambrook等的方法[1]进行培养细胞基因组DNA的提取，真空抽滤至接近干燥，TE溶解后备用。CFU-GM增殖的作用，但不及转染组。
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表1 骨髓基质细胞培养上清液的生物活性检测(CFU-GM)(
±s) 组 别上清液的稀释度
5-1
5-2
5-3
5-4
BMS/pLXSNIL-3
765.0±123.4**
603.0±110.4**
, 百拇医药
512.0±68.6**
310.0±58.3**
BMS/pLXSN
260.1±21.4*△
245.6±26.3*△
176.0±21.3*△
121.0±25.4*△
BMS
256.5±22.1*△
248.2±24.2*△
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167.0±24.2*△
118.4±25.6*△
EMEM
40.1±6.6
38.8±7.1
38.2±6.8
34.1±5.7
注：上清液按1∶5稀释；与各组比较，**P<0.01，pLXSN组与BMS组比较，*P<0.05,与DMEM组比较，△P<0.014 PCR检测骨髓基质细胞中外源性基因 将含5%高效价病毒的培养上清液(pLXSN-IL-3和空载体pLXSN)感染BMS，G418筛选，10d后均表现出大量G418抗性克隆，基因转移效率分别为40.3%和52.2%，未转染的BMS组加入G418后3～5d全部死亡(表2)。
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表2 PCR检测基质细胞中的外源基因 组别
加入上清成分
基因转移
效率(%)
PCR检测
BMS
含pLXSNIL-3
40.3
扩增出NeoR及IL-3基因
BMS
含pLXSN
52.2
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扩增出NeoR，无IL-3基因
BMS
不含pLXSN
0
未扩增出NeoR及IL-3基因
及pLXSN-IL-3
5 NFS-60细胞增殖活性检测 结果见表3。无基质细胞混合培养的NFS-60(亦未加入其它造血因子)培养24h后大部分死亡(未加入MTT检测)，提示基质细胞具有促进NSF-60细胞增殖的作用，但不及转染pLXSN/IL-3的基质细胞。表3 NFS-60细胞增殖活性检测(MTT法，A值) 组别
培养时间
24h
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48h
72h
BMS/pLXSNIL-3
0.68±0.04**
0.76±0.05**
0.70±0.05**
BMS/pLXSN
0.32±0.05*
0.40±0.04*
0.34±0.03*
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BMS
0.30±0.03
0.39±0.03
0.32±0.05
注：与各组比较，**P<0.01；与BMS组比较，*P>0.05讨 论
骨髓造血干/祖细胞的增殖、分化受多方面的调控，除造血因子外，最重要的就是造血微环境。BMS是造血微环境的主要成分，BMS一方面与造血干细胞紧密接触，以保证干细胞的自我更新，另一方面分泌造血生长因子促进造血干/祖细胞的增殖与分化。正常情况下，BMS能少量地分泌IL-3、IL-6、GM-CSF等细胞因子，但浓度不稳定且非常微量。在放、化疗条件下，较高浓度IL-3对恢复骨髓造血有一定促进作用[4]。整合了外源性IL-3 cDNA的基质细胞能显著促进小鼠骨髓CFU-GM的形成，其表达的IL-3具有一定的生物活性。用重组IL-3 cDNA逆转录病毒载体转染的小鼠BMS输入受体小鼠后，在其血清中出现一定水平的IL-3活性(约250U/ml)，且在小鼠被照射后能促进外周血白细胞恢复。基因治疗的关键是正确选择基因导入的靶细胞。有学者将GM-CSF cDNA导入造血细胞PDCP，结果发现GM-CSF转移后PDCP丧失了自我更新能力，同步分化为正常成熟粒-单核细胞[5]。较高浓度的IL-3能刺激IL-3依赖细胞TF-1表达IL-3受体β链，增加细胞对IL-3的亲和力。我们的实验结果证实，转染pLXSN/IL-3的基质细胞有明显促进小鼠骨髓CFU-GM增殖的作用。
, 百拇医药
参考文献
1，Sambrook J, Fritch EF, Manitafis T. Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 9-11.
2，Kittler EL, McGrath H, Temeles D, et al. Biological significance of constitutive and subliminal growth factor production by bone marrow stroma. Blood, 1992,79:3168-3178.
3，李青,曹雪涛,蔡荣,等.白细胞介素-3基因疗法对同基因骨髓移植造血重建的影响.中华血液学杂志, 1996,17:237-239.
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4，刘秀珍. 造血祖细胞培养技术实验手册. 北京: 北京出版社, 1993. 45-49.
5，Chang JM,Johnson GR. Effects of spleen colony forming unit self-renewal after retroviral-mediated gene transfer of multi-colony-stimulating factor granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor. Exp Hematol, 1992, 30:602-607.
(收稿日期：1998-11-16), 百拇医药