口服Ⅱ型胶原诱导免疫耐受对佐剂性关节炎免疫病理和Th亚群的作用
作者：朱平 王彦宏 冷南 王树宽 吴振彪 解慧 张惠琴 樊春梅
单位：朱平(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)；王彦宏(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)；冷南(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)；王树宽(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)；吴振彪(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)；解慧(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)
关键词：药物耐受性；关节炎，类风湿；关节炎，佐剂性；T淋巴细胞，辅助诱导；转化生长因子
中华风湿病学杂志000510 【摘 要】 目的 探讨口服Ⅱ型胶原(CⅡ)诱导的免疫耐受抑制佐剂性关节炎(AA)过程中，外周淋巴组织尤其是肠相关淋巴组织(GALT)和病变关节中免疫病理、Th细胞亚群种类及其细胞因子表达格局的改变。方法 采用免疫组织细胞化学和原位杂交等技术，对饲喂和未饲喂CⅡ的AA大鼠的上述器官和组织进行研究。结果 AA组大鼠外周淋巴器官(包括GALT)和炎症关节内均有以淋巴细胞为主的炎症反应，这些增生活化的淋巴细胞是以分泌的IFN-γ细胞为主的Th1样细胞。证明，AA的全身性迟发性超敏反应(DTH)是由分泌IFN-γ的Th1样细胞介导的。CⅡ治疗组大鼠其外周淋巴器官(包括GALT)和病变关节的炎症反应比AA组明显减轻，增生活化的淋巴细胞是以分泌TGF-β的Th3样细胞为主。证明，口服CⅡ能够诱导GALT产生调节性T细胞。结论 分泌TGF-β的Th3样细胞可能是口服CⅡ致耐受鼠抑制佐剂性关节炎机制的主要介导者。
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Effects of oral tolerance induced by anministration of type Ⅱcollagen on immunopathololgy and Th cell subsets of adjuvant arthritis
ZHU Ping,WANG Yanhong,LENG Nan,et al.
(Department of Clinical Immunology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China)
【Abstract】 Objective To develop the effective therapy for rheumatoid arthritis,and study the mechanisms of oral tolerance.Methods The peripheral lymphoid tissue including gut associated lymphoid tissue (GALT) and inflammatory joints tissue samples obtained from AA rats with or without type Ⅱ (CⅡ) collagen treatment were studied by streptavidin-biotin-enzyme complex staining and hybridization in situ.Results Inflammation response dominated by lymphocytes was observed in peripheral lymphoid organs including GALT and joints in AA control rats.These proliferated and activated lymphocytes were dominated ty IFN-γ secreting T cell subset (Th1-like cells).While,in CⅡ orally tolerized animals,a marked reduction of inflammatory response,and upregulation of the inhibitory cytokine TGF-β were observed.Conclusion The inhibitory cytokine TGF-β secreting Th3 cells may play an important role in suppression of adjuvant arthritis (AA) by oral administration of CⅡ.
, 百拇医药
【Key words】 Drug tolerance; Arthritis,rheumatoid; Arthritis adjuvant; T-lymocytes,helper-inducer; Transforming growth factors
佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)是一种免疫炎症模型，其特征是多发性关节炎，发病机制和病理特征与人类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)相似，是RA的动物模型。近年来的研究提示，口服Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱcollagen，CⅡ)能够诱导免疫耐受，通过“旁观者抑制”抑制AA，并且这种抑制作用能通过转输淋巴细胞转移[1，2]。为了进一步探讨口服耐受(oral tolerance)抑制佐剂性关节炎的细胞与分子机制，本文采用免疫组织细胞化学和原位杂交等技术，对饲喂和未饲喂CⅡ的AA大鼠的外周淋巴组织尤其是肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue，GALT)和病变关节进行研究，旨在弄清口服CⅡ诱导的免疫耐受抑制AA过程中，上述器官和组织中免疫病理、Th细胞亚群种类及其细胞因子表达格局的改变。
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1 材料与方法
1.1 实验动物：雌性SD大鼠，6～8周龄，体重(180±30) g，由第四军医大学动物实验中心提供。
1.2 AA的诱导：将同一批号卡介苗(预先60 ℃ 1 h灭活)配制成完全福氏佐剂(CFA，10 mg卡介苗/ml)。临用前充分混匀，取0.1 ml于SD大鼠右后足跖皮内诱导关节炎发生。
1.3 口服CⅡ诱导免疫耐受：可溶性CⅡ制备及实验分组和给药方案均按文献[1]进行。受试药物组根据开始给药时间(即在CFA致炎前2周、同时、后2周)设A、B、C三组：A、B、C三组分别设0.3、3、30、300 μg，和1 mg五个剂量组，每组4～6只鼠。CⅡ以0.05 mol/L醋酸溶解，各剂量组均采用经口插管灌注法给药，0.5 ml醋酸-CⅡ/次，2次/周，共3个月。同时设CFA致炎未给予CⅡ的鼠为阳性对照组，设单服0.5 ml醋酸或未经任何处理的鼠为阴性和正常对照。
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1.4 标本采取：AA起病在免疫后10～14 d，起病后1周病变至高峰并持续1个月后逐渐波动下降，病程长达3个多月。口服CⅡ治疗组疾病高峰下降，病程缩短。本实验各治疗组分别在CFA免疫后3周左右处死一只鼠(30 μg剂量组)，标本取自鼠的病变关节、脾脏、肠系膜淋巴结、小肠和窝淋巴结。并分别采取未经治疗的AA组和正常的大鼠相应组织作为阳性和阴性对照。
1.5 标本处理：将病变关节，去皮毛和多余的皮下组织，切割成适当大小的组织块后，采用10%中性甲醛固定，10%硝酸液脱钙；取脾脏、肠系膜淋巴结、小肠、窝淋巴结组织块采用10%中性甲醛固定。标本均经石蜡包埋、切片后附贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。每个样品选一张切片进行HE染色，Nikon显微镜下观察并照相。其他切片密封保存于4 ℃冰箱待检。
1.6 淋巴组织/器官局部细胞因子的表达：采用链霉素亲和素-生物素-辣根过氧化物酶(streptavidin-biotin-enzyme complex，SABC)-DAB系统染色(以下简称SABC染色)按文献[3]和试剂盒说明操作，检测上述切片中淋巴组织/器官中IL-4、IFN-γ及TGF-β蛋白在淋巴细胞中的表达。小鼠抗大鼠IL-4单抗，小鼠抗大鼠IFN-γ单抗均为英国Serotee公司产品；兔抗TGF-β1多克隆抗体为英国Santacruz生物技术公司产品：生物素标记的羊抗小鼠Ig(经多种抗原吸收)为Pharmingen公司产品：链霉素亲和素-生物素-辣根过氧化物酶试剂盒和DAB显色试剂盒为博士德公司产品。
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1.7 TGF-β mRNA的表达：采用原位杂交技术[4]，TGF-β原位杂交检测试剂盒为博士德公司进口分装产品。
2 结 果
2.1 口服CⅡ对佐剂关节炎的抑制作用
AA对照组大鼠，皮内注射CFA后18 h，右后足爪出现红、肿、热，持续3 d后逐渐减轻。10～14 d，出现以多发性关节炎为特征的全身迟发性变态反应，10只大鼠的四肢关节中90%(36/40)出现不同程度的红肿，炎症此起彼伏，迁延达3月余，部分出现关节畸形。另外多数大鼠的耳和尾部出现炎性小结，部分大鼠出现变应性角膜翳等关节外表现。口服CⅡ组大鼠，关节病变明显改善。B组中的CⅡ 30 μg剂量组，多关节炎的起病延迟至(19.5±7.6) d与佐剂性关节炎对照组(13.4±2.6) d比较差异显著(P<0.05)。A、B、C三组大鼠(各22只)的多关节炎波及的肢体数分别为51/88(57.8%)、58/88(65.9%)和54/88(61.3%)，与AA对照组(36/44，90%)相比较，差异非常显著(P<0.01)。另外，饲喂CⅡ的A、B、C各剂量组大鼠多关节炎的炎症反应亦较AA对照组明显减轻，病程明显缩短(P<0.01)。关节外表现较少、病变较轻。
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2.2 口服CⅡ对AA大鼠关节和淋巴器官的组织学改变
2.2.1 AA对照组大鼠外周淋巴组织和病变关节组织的病理学特点：佐剂致炎后3周，脾脏明显增大，变厚变硬，与周围组织有粘连。HE染色切片上，白髓部分和边缘区扩大，融合，细胞淡染。白髓淋巴细胞增生活跃，部分淋巴细胞出现核膜和核仁，并可见多核巨细胞。红髓部分相对缩小，血窦间隙变窄。肠系膜淋巴结的皮质尤其深皮质(胸腺依赖区)可见淋巴细胞明显增生，树突状细胞、网织细胞增多，组织细胞、窦细胞、单核巨噬细胞也有增生。髓质亦有大量淋巴细胞增生。肠Peyer集合淋巴结体积增大，淋巴细胞增生。窝淋巴结亦有类似改变。病变关节软组织高度肿胀，滑膜炎症反应表现突出，具有衬里细胞层增厚，间质水肿并有大量以淋巴细胞为主的炎细胞浸润，有血管翳形成并侵袭软骨和软骨下骨组织造成骨和软骨的破坏。3个月内各关节炎症此起彼落反复不断，多数关节出现畸形。显微镜下可见，关节内有大量胶原纤维增生，骨膜机化。部分关节在胶原增生的基础上仍有不同程度的炎症反应。
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2.2.2 口服CⅡ组大鼠外周淋巴组织和病变关节组织的病理学特点：佐剂致炎后，其脾脏、肠系膜淋巴结、肠Peyer集合结、窝淋巴结及病变关节的改变类同未治疗的AA组，但以淋巴细胞为主的炎症反应的程度明显减轻。3个月内，各病变关节从大体上观察均恢复如免疫前，但是关节切片于镜下观察时，可见部分关节组织有不同程度的胶原增生和骨膜机化。
2.3 AA组和口服CⅡ组大鼠外周淋巴器官中细胞因子表达类型
见表1和图1。采用SABC法染色，AA组大鼠的脾脏、肠系膜淋巴结、小肠Peyer集合结，大量增生活化的淋巴细胞中约有20%呈现IFN-γ染色阳性(见图1a、c、e)，IL-4和TGF-β缺乏或呈痕量标记。而口服CⅡ治疗组大鼠的脾脏、肠系膜淋巴结、小肠集合淋巴结中增生活化的淋巴细胞却有近20%为TGF-β染色阳性细胞(见图1b、d、f)，IFN-γ和IL-4染色阳性细胞<1%。正常对照组大鼠上述各组织的IFN-γ，IL-4和TGF-β表达细胞均少于1%。
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表1 细胞因子在疾病高峰期的外周淋巴组织中的表达 组别
细胞因子
IFN-γ
IL-4
TGF-β
饲喂CⅡ
-→±
-→±
2+
AA对照
2+
-→±
-→±
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正常对照
-→±
-→±
-→±
注：检查20高倍视野/组织，半定量分级：(-)染色呈阴性，(+)痕量染色，(2+)多灶染色
2.4 TGF-β mRNA的表达
采用原位杂交技术检测，口服CⅡ致大鼠脾脏、肠系膜淋巴结和小肠集合淋巴结活化增生的淋巴细胞中均有高水平TGF-β mRNA表达，见图2。而AA对照组和正常对照组仅有少数淋巴细胞低水平表达TGF-β mRNA。
3 讨 论
通过肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue，GALT)主动诱导的选择性免疫反应，是口服抗原抑制全身免疫反应的基本机制之一。GALT易于诱导产生Th2和TGF-β分泌性T细胞(Th3细胞)。在动物实验中，不同的动物模型可诱导产生调节细胞分泌IL-4 (Th2细胞)、TGF-β (Th3细胞)或IL-10(T regulatory 1，Tr1)，以及抑制性CD8+细胞[5-7]，与抑制疾病的进展有关。
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AA是用CFA[由油剂和乳化剂与结核分支杆菌(MT)组成]免疫敏感种系大鼠所诱导的一种发病机制和病理特征与人类RA相似的动物多发性关节炎模型。佐剂中MT的相对分子质量65 000热休克蛋白(heat shock protein，HSP)和软骨中的蛋白多糖(PG)桥连蛋白抗原成分相似，通过分子模拟或交叉反应，MT致敏的T细胞可同时攻击关节软骨的PG，造成关节炎。此外，角膜、虹膜、主动脉等部位均含有与软骨中相同的PG成分，当PG反应性T细胞迁徙到上述部位，即能与这些部位中的PG发生反应，造成局部炎症，引起关节外表现。从而形成AA的以多发性关节炎为特征性病变的全身性DTH，除表现四肢关节红肿，还可有耳和尾部出现炎性小结及变应性角膜翳等关节外表现。本实验对AA外周淋巴组织和病变关节的研究观察到，AA组大鼠不仅炎症关节内有滑膜增生和以淋巴细胞为主的炎细胞浸润，外周淋巴器官(包括GALT)亦有以淋巴细胞为主的炎症反应，这些增生活化的淋巴细胞是以分泌IFN-γ细胞为主的Th1样细胞。证明，AA的全身性DTH是由分泌IFN-γ的Th1样细胞介导的。
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同时，本实验在证明口服牛CⅡ对大鼠佐剂性关节炎具有抑制作用，而且在佐剂致炎前、后和同时(即发病前或发病早期开始给予)均有效。主要治疗效果为：推迟发病时间、减低发病率和减少关节炎累及的关节数，明显减轻关节炎的炎症及缩短病程的工作基础上[1]，对CⅡ治疗组大鼠进行了病理和免疫组织化学研究。观察到饲喂CⅡ治疗组大鼠其外周淋巴器官(包括GALT)和病变关节的炎症反应比AA组明显减轻，增生活化的淋巴细胞是以分泌TGF-β的Th3样细胞为主。证明，口服CⅡ能够诱导GALT产生调节性T细胞，这些调节性T细胞可迁移到肠系膜淋巴结和脾脏等淋巴器官，抑制效应细胞产生免疫应答；并能迁移到关节、耳部、尾部、角膜等特异器官，通过释放抑制性细胞因子TGF-β，抑制AA的Th1细胞介导的以多发性关节炎为特征性病变的全身性DTH。表明，这些分泌TGF-β的Th3样细胞可能是口服CⅡ致耐鼠抑制佐剂性关节炎机制的主要介导者。
此外，虽然有关RA发病的机制尚未阐明，但近年来的研究提示，人的Th1细胞识别软骨的Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ型胶原、PG以及其他的软骨和软骨细胞的抗原成分是RA发病机制的重要因素。口服Ⅱ型胶原在GALT诱导分泌TGF-β的调节性T细胞(Th3细胞)产生，嗣后，调节性T细胞迁徙到淋巴器官，抑制效应细胞产生免疫应答；抑或迁徙到特异靶器官，通过释放非特异性抑制因子(如IL-4、IL-10、TGF-β等)阻止免疫病理反应，此为“旁观者效应”。“旁观者效应”的诱导是特异性的，而发挥的效应是非特异性的。“旁观者效应”已在多发性硬化及其动物模型的研究中得到证实[8]。本文在口服CⅡ诱导免疫耐受治疗AA中证实“旁观者效应”机制，为此疗法应用于人RA治疗提供了理论和实验依据。
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a IFN-γ 在AA大鼠脾淋巴细胞中的表达
b TGF-β 在CⅡ致耐大鼠脾淋巴细胞中的表达
c IFN-γ 在AA大鼠脾肠系膜淋巴结细胞中的表达
d TGF-β 在CⅡ致耐大鼠肠系膜淋巴结细胞中的表达
e IFN-γ 在AA大鼠脾小肠Peyer集合结淋巴细胞中的表达
f TGF-β 在CⅡ致耐大鼠小肠Peyer集合结淋巴细胞中的表达
图1 AA和CⅡ致耐大鼠组织切片的SABC染色显微照片×400
图2 TGF-β mRNA 在饲喂CⅡ大鼠Peyer集合结淋巴细胞中的表达×400
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(本文图1～2见插页图第8页)
张惠琴(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)
樊春梅(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)
参 考 文 献
1，朱平，冷南，王彦宏，等.口服Ⅱ型胶原蛋白诱导免疫耐受治疗佐剂关节炎的研究.细胞与分子免疫学杂志，1999，15：305-307.
2，Zhengyi JZ,Charistopher SYL,Ofer L,et al.Suppression of adjuvant arthritis in lewis rats by oral administration of type Ⅱ collagen.J Immuno1,1990,145:2489-2493.
, 百拇医药
3，朱晴晖.生物素-链霉亲和素系统在检测人PBMC IL-2Ra中的应用.上海免疫学杂志，1993，13：146-149.
4，Leary JJ.Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing bioton-laballed DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized:bioblots.Proc Ncad Sci USA,1983,80:4045-4049.
5，Chen Y,Kuchroo VK,Inobe J,et al.Regulatory T cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalomyelitis.Science,1994,265:1237-1240.
, 百拇医药 6，Weiner HL.Oral tolerance:immunologic mechanisms and treatment of autoimmune diseases.Immunol Today,1997,18:335-343.
7，Strobel S,Mowat AM.Immune respones to dietary antigens:oral tolerance.Immunol Today,1998,19:173-181.
8，Miller A, Lider O,Weinter HL.Antigen-driven bystander suppression following oral administration of antigens.J Exp Med,1991,174:791-799.
(收稿日期：1999-12-24), 百拇医药
单位：朱平(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)；王彦宏(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)；冷南(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)；王树宽(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)；吴振彪(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)；解慧(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)
关键词：药物耐受性；关节炎，类风湿；关节炎，佐剂性；T淋巴细胞，辅助诱导；转化生长因子
中华风湿病学杂志000510 【摘 要】 目的 探讨口服Ⅱ型胶原(CⅡ)诱导的免疫耐受抑制佐剂性关节炎(AA)过程中，外周淋巴组织尤其是肠相关淋巴组织(GALT)和病变关节中免疫病理、Th细胞亚群种类及其细胞因子表达格局的改变。方法 采用免疫组织细胞化学和原位杂交等技术，对饲喂和未饲喂CⅡ的AA大鼠的上述器官和组织进行研究。结果 AA组大鼠外周淋巴器官(包括GALT)和炎症关节内均有以淋巴细胞为主的炎症反应，这些增生活化的淋巴细胞是以分泌的IFN-γ细胞为主的Th1样细胞。证明，AA的全身性迟发性超敏反应(DTH)是由分泌IFN-γ的Th1样细胞介导的。CⅡ治疗组大鼠其外周淋巴器官(包括GALT)和病变关节的炎症反应比AA组明显减轻，增生活化的淋巴细胞是以分泌TGF-β的Th3样细胞为主。证明，口服CⅡ能够诱导GALT产生调节性T细胞。结论 分泌TGF-β的Th3样细胞可能是口服CⅡ致耐受鼠抑制佐剂性关节炎机制的主要介导者。
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Effects of oral tolerance induced by anministration of type Ⅱcollagen on immunopathololgy and Th cell subsets of adjuvant arthritis
ZHU Ping,WANG Yanhong,LENG Nan,et al.
(Department of Clinical Immunology,Xijing Hospital,Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China)
【Abstract】 Objective To develop the effective therapy for rheumatoid arthritis,and study the mechanisms of oral tolerance.Methods The peripheral lymphoid tissue including gut associated lymphoid tissue (GALT) and inflammatory joints tissue samples obtained from AA rats with or without type Ⅱ (CⅡ) collagen treatment were studied by streptavidin-biotin-enzyme complex staining and hybridization in situ.Results Inflammation response dominated by lymphocytes was observed in peripheral lymphoid organs including GALT and joints in AA control rats.These proliferated and activated lymphocytes were dominated ty IFN-γ secreting T cell subset (Th1-like cells).While,in CⅡ orally tolerized animals,a marked reduction of inflammatory response,and upregulation of the inhibitory cytokine TGF-β were observed.Conclusion The inhibitory cytokine TGF-β secreting Th3 cells may play an important role in suppression of adjuvant arthritis (AA) by oral administration of CⅡ.
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【Key words】 Drug tolerance; Arthritis,rheumatoid; Arthritis adjuvant; T-lymocytes,helper-inducer; Transforming growth factors
佐剂性关节炎(adjuvant arthritis，AA)是一种免疫炎症模型，其特征是多发性关节炎，发病机制和病理特征与人类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)相似，是RA的动物模型。近年来的研究提示，口服Ⅱ型胶原蛋白(type Ⅱcollagen，CⅡ)能够诱导免疫耐受，通过“旁观者抑制”抑制AA，并且这种抑制作用能通过转输淋巴细胞转移[1，2]。为了进一步探讨口服耐受(oral tolerance)抑制佐剂性关节炎的细胞与分子机制，本文采用免疫组织细胞化学和原位杂交等技术，对饲喂和未饲喂CⅡ的AA大鼠的外周淋巴组织尤其是肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue，GALT)和病变关节进行研究，旨在弄清口服CⅡ诱导的免疫耐受抑制AA过程中，上述器官和组织中免疫病理、Th细胞亚群种类及其细胞因子表达格局的改变。
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1 材料与方法
1.1 实验动物：雌性SD大鼠，6～8周龄，体重(180±30) g，由第四军医大学动物实验中心提供。
1.2 AA的诱导：将同一批号卡介苗(预先60 ℃ 1 h灭活)配制成完全福氏佐剂(CFA，10 mg卡介苗/ml)。临用前充分混匀，取0.1 ml于SD大鼠右后足跖皮内诱导关节炎发生。
1.3 口服CⅡ诱导免疫耐受：可溶性CⅡ制备及实验分组和给药方案均按文献[1]进行。受试药物组根据开始给药时间(即在CFA致炎前2周、同时、后2周)设A、B、C三组：A、B、C三组分别设0.3、3、30、300 μg，和1 mg五个剂量组，每组4～6只鼠。CⅡ以0.05 mol/L醋酸溶解，各剂量组均采用经口插管灌注法给药，0.5 ml醋酸-CⅡ/次，2次/周，共3个月。同时设CFA致炎未给予CⅡ的鼠为阳性对照组，设单服0.5 ml醋酸或未经任何处理的鼠为阴性和正常对照。
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1.4 标本采取：AA起病在免疫后10～14 d，起病后1周病变至高峰并持续1个月后逐渐波动下降，病程长达3个多月。口服CⅡ治疗组疾病高峰下降，病程缩短。本实验各治疗组分别在CFA免疫后3周左右处死一只鼠(30 μg剂量组)，标本取自鼠的病变关节、脾脏、肠系膜淋巴结、小肠和窝淋巴结。并分别采取未经治疗的AA组和正常的大鼠相应组织作为阳性和阴性对照。
1.5 标本处理：将病变关节，去皮毛和多余的皮下组织，切割成适当大小的组织块后，采用10%中性甲醛固定，10%硝酸液脱钙；取脾脏、肠系膜淋巴结、小肠、窝淋巴结组织块采用10%中性甲醛固定。标本均经石蜡包埋、切片后附贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。每个样品选一张切片进行HE染色，Nikon显微镜下观察并照相。其他切片密封保存于4 ℃冰箱待检。
1.6 淋巴组织/器官局部细胞因子的表达：采用链霉素亲和素-生物素-辣根过氧化物酶(streptavidin-biotin-enzyme complex，SABC)-DAB系统染色(以下简称SABC染色)按文献[3]和试剂盒说明操作，检测上述切片中淋巴组织/器官中IL-4、IFN-γ及TGF-β蛋白在淋巴细胞中的表达。小鼠抗大鼠IL-4单抗，小鼠抗大鼠IFN-γ单抗均为英国Serotee公司产品；兔抗TGF-β1多克隆抗体为英国Santacruz生物技术公司产品：生物素标记的羊抗小鼠Ig(经多种抗原吸收)为Pharmingen公司产品：链霉素亲和素-生物素-辣根过氧化物酶试剂盒和DAB显色试剂盒为博士德公司产品。
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1.7 TGF-β mRNA的表达：采用原位杂交技术[4]，TGF-β原位杂交检测试剂盒为博士德公司进口分装产品。
2 结 果
2.1 口服CⅡ对佐剂关节炎的抑制作用
AA对照组大鼠，皮内注射CFA后18 h，右后足爪出现红、肿、热，持续3 d后逐渐减轻。10～14 d，出现以多发性关节炎为特征的全身迟发性变态反应，10只大鼠的四肢关节中90%(36/40)出现不同程度的红肿，炎症此起彼伏，迁延达3月余，部分出现关节畸形。另外多数大鼠的耳和尾部出现炎性小结，部分大鼠出现变应性角膜翳等关节外表现。口服CⅡ组大鼠，关节病变明显改善。B组中的CⅡ 30 μg剂量组，多关节炎的起病延迟至(19.5±7.6) d与佐剂性关节炎对照组(13.4±2.6) d比较差异显著(P<0.05)。A、B、C三组大鼠(各22只)的多关节炎波及的肢体数分别为51/88(57.8%)、58/88(65.9%)和54/88(61.3%)，与AA对照组(36/44，90%)相比较，差异非常显著(P<0.01)。另外，饲喂CⅡ的A、B、C各剂量组大鼠多关节炎的炎症反应亦较AA对照组明显减轻，病程明显缩短(P<0.01)。关节外表现较少、病变较轻。
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2.2 口服CⅡ对AA大鼠关节和淋巴器官的组织学改变
2.2.1 AA对照组大鼠外周淋巴组织和病变关节组织的病理学特点：佐剂致炎后3周，脾脏明显增大，变厚变硬，与周围组织有粘连。HE染色切片上，白髓部分和边缘区扩大，融合，细胞淡染。白髓淋巴细胞增生活跃，部分淋巴细胞出现核膜和核仁，并可见多核巨细胞。红髓部分相对缩小，血窦间隙变窄。肠系膜淋巴结的皮质尤其深皮质(胸腺依赖区)可见淋巴细胞明显增生，树突状细胞、网织细胞增多，组织细胞、窦细胞、单核巨噬细胞也有增生。髓质亦有大量淋巴细胞增生。肠Peyer集合淋巴结体积增大，淋巴细胞增生。窝淋巴结亦有类似改变。病变关节软组织高度肿胀，滑膜炎症反应表现突出，具有衬里细胞层增厚，间质水肿并有大量以淋巴细胞为主的炎细胞浸润，有血管翳形成并侵袭软骨和软骨下骨组织造成骨和软骨的破坏。3个月内各关节炎症此起彼落反复不断，多数关节出现畸形。显微镜下可见，关节内有大量胶原纤维增生，骨膜机化。部分关节在胶原增生的基础上仍有不同程度的炎症反应。
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2.2.2 口服CⅡ组大鼠外周淋巴组织和病变关节组织的病理学特点：佐剂致炎后，其脾脏、肠系膜淋巴结、肠Peyer集合结、窝淋巴结及病变关节的改变类同未治疗的AA组，但以淋巴细胞为主的炎症反应的程度明显减轻。3个月内，各病变关节从大体上观察均恢复如免疫前，但是关节切片于镜下观察时，可见部分关节组织有不同程度的胶原增生和骨膜机化。
2.3 AA组和口服CⅡ组大鼠外周淋巴器官中细胞因子表达类型
见表1和图1。采用SABC法染色，AA组大鼠的脾脏、肠系膜淋巴结、小肠Peyer集合结，大量增生活化的淋巴细胞中约有20%呈现IFN-γ染色阳性(见图1a、c、e)，IL-4和TGF-β缺乏或呈痕量标记。而口服CⅡ治疗组大鼠的脾脏、肠系膜淋巴结、小肠集合淋巴结中增生活化的淋巴细胞却有近20%为TGF-β染色阳性细胞(见图1b、d、f)，IFN-γ和IL-4染色阳性细胞<1%。正常对照组大鼠上述各组织的IFN-γ，IL-4和TGF-β表达细胞均少于1%。
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表1 细胞因子在疾病高峰期的外周淋巴组织中的表达 组别
细胞因子
IFN-γ
IL-4
TGF-β
饲喂CⅡ
-→±
-→±
2+
AA对照
2+
-→±
-→±
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正常对照
-→±
-→±
-→±
注：检查20高倍视野/组织，半定量分级：(-)染色呈阴性，(+)痕量染色，(2+)多灶染色
2.4 TGF-β mRNA的表达
采用原位杂交技术检测，口服CⅡ致大鼠脾脏、肠系膜淋巴结和小肠集合淋巴结活化增生的淋巴细胞中均有高水平TGF-β mRNA表达，见图2。而AA对照组和正常对照组仅有少数淋巴细胞低水平表达TGF-β mRNA。
3 讨 论
通过肠相关淋巴组织(gut-associated lymphoid tissue，GALT)主动诱导的选择性免疫反应，是口服抗原抑制全身免疫反应的基本机制之一。GALT易于诱导产生Th2和TGF-β分泌性T细胞(Th3细胞)。在动物实验中，不同的动物模型可诱导产生调节细胞分泌IL-4 (Th2细胞)、TGF-β (Th3细胞)或IL-10(T regulatory 1，Tr1)，以及抑制性CD8+细胞[5-7]，与抑制疾病的进展有关。
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AA是用CFA[由油剂和乳化剂与结核分支杆菌(MT)组成]免疫敏感种系大鼠所诱导的一种发病机制和病理特征与人类RA相似的动物多发性关节炎模型。佐剂中MT的相对分子质量65 000热休克蛋白(heat shock protein，HSP)和软骨中的蛋白多糖(PG)桥连蛋白抗原成分相似，通过分子模拟或交叉反应，MT致敏的T细胞可同时攻击关节软骨的PG，造成关节炎。此外，角膜、虹膜、主动脉等部位均含有与软骨中相同的PG成分，当PG反应性T细胞迁徙到上述部位，即能与这些部位中的PG发生反应，造成局部炎症，引起关节外表现。从而形成AA的以多发性关节炎为特征性病变的全身性DTH，除表现四肢关节红肿，还可有耳和尾部出现炎性小结及变应性角膜翳等关节外表现。本实验对AA外周淋巴组织和病变关节的研究观察到，AA组大鼠不仅炎症关节内有滑膜增生和以淋巴细胞为主的炎细胞浸润，外周淋巴器官(包括GALT)亦有以淋巴细胞为主的炎症反应，这些增生活化的淋巴细胞是以分泌IFN-γ细胞为主的Th1样细胞。证明，AA的全身性DTH是由分泌IFN-γ的Th1样细胞介导的。
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同时，本实验在证明口服牛CⅡ对大鼠佐剂性关节炎具有抑制作用，而且在佐剂致炎前、后和同时(即发病前或发病早期开始给予)均有效。主要治疗效果为：推迟发病时间、减低发病率和减少关节炎累及的关节数，明显减轻关节炎的炎症及缩短病程的工作基础上[1]，对CⅡ治疗组大鼠进行了病理和免疫组织化学研究。观察到饲喂CⅡ治疗组大鼠其外周淋巴器官(包括GALT)和病变关节的炎症反应比AA组明显减轻，增生活化的淋巴细胞是以分泌TGF-β的Th3样细胞为主。证明，口服CⅡ能够诱导GALT产生调节性T细胞，这些调节性T细胞可迁移到肠系膜淋巴结和脾脏等淋巴器官，抑制效应细胞产生免疫应答；并能迁移到关节、耳部、尾部、角膜等特异器官，通过释放抑制性细胞因子TGF-β，抑制AA的Th1细胞介导的以多发性关节炎为特征性病变的全身性DTH。表明，这些分泌TGF-β的Th3样细胞可能是口服CⅡ致耐鼠抑制佐剂性关节炎机制的主要介导者。
此外，虽然有关RA发病的机制尚未阐明，但近年来的研究提示，人的Th1细胞识别软骨的Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ型胶原、PG以及其他的软骨和软骨细胞的抗原成分是RA发病机制的重要因素。口服Ⅱ型胶原在GALT诱导分泌TGF-β的调节性T细胞(Th3细胞)产生，嗣后，调节性T细胞迁徙到淋巴器官，抑制效应细胞产生免疫应答；抑或迁徙到特异靶器官，通过释放非特异性抑制因子(如IL-4、IL-10、TGF-β等)阻止免疫病理反应，此为“旁观者效应”。“旁观者效应”的诱导是特异性的，而发挥的效应是非特异性的。“旁观者效应”已在多发性硬化及其动物模型的研究中得到证实[8]。本文在口服CⅡ诱导免疫耐受治疗AA中证实“旁观者效应”机制，为此疗法应用于人RA治疗提供了理论和实验依据。
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a IFN-γ 在AA大鼠脾淋巴细胞中的表达
b TGF-β 在CⅡ致耐大鼠脾淋巴细胞中的表达
c IFN-γ 在AA大鼠脾肠系膜淋巴结细胞中的表达
d TGF-β 在CⅡ致耐大鼠肠系膜淋巴结细胞中的表达
e IFN-γ 在AA大鼠脾小肠Peyer集合结淋巴细胞中的表达
f TGF-β 在CⅡ致耐大鼠小肠Peyer集合结淋巴细胞中的表达
图1 AA和CⅡ致耐大鼠组织切片的SABC染色显微照片×400
图2 TGF-β mRNA 在饲喂CⅡ大鼠Peyer集合结淋巴细胞中的表达×400
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(本文图1～2见插页图第8页)
张惠琴(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)
樊春梅(710032 西安，第四军医大学西京医院临床免疫科)
参 考 文 献
1，朱平，冷南，王彦宏，等.口服Ⅱ型胶原蛋白诱导免疫耐受治疗佐剂关节炎的研究.细胞与分子免疫学杂志，1999，15：305-307.
2，Zhengyi JZ,Charistopher SYL,Ofer L,et al.Suppression of adjuvant arthritis in lewis rats by oral administration of type Ⅱ collagen.J Immuno1,1990,145:2489-2493.
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3，朱晴晖.生物素-链霉亲和素系统在检测人PBMC IL-2Ra中的应用.上海免疫学杂志，1993，13：146-149.
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(收稿日期：1999-12-24), 百拇医药