染料木黄酮对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞生长的影响
作者：孙铁铮 吕厚山 药立波 燕太强 杨刚
单位：孙铁铮(100044 北京大学人民医院关节病研究所)；吕厚山(100044 北京大学人民医院关节病研究所)；药立波(第四军医大学生化及分子生物学教研室)；燕太强(100044 北京大学人民医院关节病研究所)；杨刚(100044 北京大学人民医院关节病研究所)
关键词：关节炎；滑膜；成纤维细胞；蛋白质酪氨酸激酶；增生；转化
中华风湿病学杂志000503 【摘 要】 目的 研究酪氨酸激酶(PTK)在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)异常增生与转化特性中的作用。方法 原代培养类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞。应用形态观察、细胞计数、3H-TdR掺入、流式细胞仪检测和双层琼脂培养法探讨染料木黄酮，特异性PTK抑制剂对于RA FLS细胞生长状态、数目、DNA合成、细胞周期及其非贴壁生长情况下细胞克隆形成数目的影响。结果 Genistein呈剂量依赖性抑制RA FLS 的数目增长、3H-TdR掺入和非贴壁生长的克隆形成数目；其生长抑制作用在细胞周期中G1期限制点。结论 酪氨酸激酶在RA FLS细胞异常增生与转化表现中发挥关键作用。
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Genistein′s effect on the growth of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis
SUN Tiezheng,LÜ Houshan,YAO Libo,et al.
(Arthritis Research Center,People′s Hospital,Beijing University,Beijing 100044,China.)
【Abstract】 Objective To study the role of protein tyrosine kinase (PTK) in abnormal proliferation and transformation phenotype of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte (RA FLS).Methods RA FLS was primarily cultured.Genistein,a protein tyrosine kinase inhibitor,was used to elucidate the effect of PTK on RA FLS morphology,number,DNA synthysis,cell cycle and colony numbers under anchorage-independent growth with microscope,cell counts,3H-TdR incorporation,flow cytometry and LMP agarose culture method.Results Genistein had an inhibitory effect on RA FLS cell number,3H-TdR incorporation and colony numbers under anchorage-independent growth in dose-dependent manner;the inhibition on RA FLS cell cycle was at G1 restriction point.Conclusion PTK has a key role in abnormal proliferation and transformation of RA FLS.
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【Key words】 Arthritis; Synovial membrane; Fibroblasts; Protein-tyrosine kinase; Proliferation; Transformation
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)以成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)过度增生、单核细胞浸润及新生血管形成为特征。增生的滑膜组织侵蚀周围肌腱、韧带、软骨和骨，造成关节的进行性破坏、畸形和功能丧失，对人类健康及生活质量构成严重威胁。近年来的研究表明，类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞具有转化细胞的外观表现[1]，而酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)在调控细胞生长、代谢、信号传递等生命活动中发挥重要作用，是正常细胞与转化细胞相互转变的关键环节[2]。本研究应用酪氨酸激酶抑制剂，染料木黄酮(genistein)观察其对于类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞生长的影响，以探明酪氨酸激酶在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞异常增生和转化中所发挥的作用。
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1 材料与方法
1.1 滑膜细胞的培养：滑膜均取材于北京大学人民医院关节病研究所行膝关节置换或滑膜切除术的类风湿关节炎病人，所有病人均符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎诊断标准[3]。术中取出滑膜组织，立即于无菌条件下剪碎，1.0 mg/ml Ⅰ型胶原酶(GIBCO-BRL)，37 ℃消化4 h后，离心收集细胞，加入含有20% FBS-DMEM(GIBCO-BRL)培养液，置于37 ℃、5%CO2孵箱中令其贴壁生长，细胞生长至85%汇满时，胰蛋白酶EDTA消化进行1∶3传代。本实验中采用3～5代成纤维样滑膜细胞。
1.2 滑膜细胞型别鉴定：取1～3代滑膜细胞，用0.125 mmol/L EDTA缓慢消化下来，PBS洗涤，台盼蓝染色计算活细胞数目，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD20、von Willibrand factor (Serotech UK)，和PE标记的小鼠抗人CD11b；4 ℃作用45 min；以含有1%的马血清的PBS溶液充分混匀作用1 h，80%酒精固定。实验均按三个平行管设计，重复6次。每次均以FITC和PE标记的鼠源性抗体作为阴性对照。样品集中进行流式细胞仪测定相对荧光强度及阳性细胞比例。
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1.3 Genistein对于RA成纤维样滑膜细胞生长数目的影响：将1×105 3～5代滑膜成纤维细胞种于60 mm Costar细胞平皿中，24 h贴壁后，在20% FBS-DMEM中加入不同浓度梯度genistein(Sigma)的DMSO贮存液。培养4 d以后，细胞用胰酶消化下来，台盼蓝染色，倒置纤维镜下计算活细胞数目。
1.4 Genistein对于RA成纤维样滑膜细胞DNA合成的影响：将1×104 3～5代滑膜成纤维细胞种于96孔板中，令其贴壁生长24 h，换以含有1% FBS-DMEM培养液静息24 h以后，重新加入20% FBS-DMEM培养液，并加入不同浓度梯度的genistein作用48 h在最后0.5 h的时候，加入3H-TdR(中国原子能研究所)18.5 kBq/孔，利用收获器将细胞收获于玻璃纤维滤膜上，γ计数仪下液闪计数。实验按三个平行孔设计，重复6次。
1.5 Genistein对于RA成纤维样滑膜细胞周期的影响：取85%汇满、状态良好的3～5代滑膜成纤维样细胞，以无血清DMEM静息24 h。抑制剂组于静息12 h加入37 μmol/L genistein，最后换以20% FBS-DMEM作用48 h。胰酶消化细胞，PBS洗涤细胞2次，70%酒精固定，无DNA酶的RNA酶(Sigma)100 ng/ml，37 ℃处理30 min，以100 ng/ml碘化丙啶(propidium iodide，PI)作用至少4 h后，进行流式细胞仪细胞周期的检测。
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1.6 Genistein对于RA FLS非贴壁情况下生长的影响：混合5 ml FBS、10 ml 1.67×DMEM和10 ml 1.6%的低熔点琼脂糖(LMP agarose，Canada)，以0.5 ml/孔混合液覆盖24孔板底层，室温凝固后，每孔加入0.6 ml 20% FBS-1.67×DMEM与不同浓度的genistein(0、19、37、74 μmol/L)，置于孵箱中达到浓度平衡后，加入0.6 ml 20%FBS-1.67×DMEM、1×104滑膜成纤维样细胞及其0.8 ml 1%的LMP琼脂糖的混合物，从而达到每孔2 ml的总体积。置于37 ℃、5%的CO2孵箱中，2周后观察并在40×倒置显微镜下随机选择5个视野计算细胞克隆数目(细胞数目>50个/克隆)。
2 结 果
流式细胞仪分析原代培养的滑膜细胞表面分子标志，发现CD3阳性细胞占7.9%，CD14阳性细胞占7.3%，CD11b阳性细胞占7.8%，CD20阳性细胞占7.5%，von Willibrand factor阳性细胞占0.9%。当按1∶3比例传至第三代时，以上各种细胞表面标志阳性细胞比例均小于1%(见图1)。所以，按照如上培养方法，当滑膜细胞培养到第三代时，即可以认为是型别较为均一的成纤维样滑膜细胞。
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图1 类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(Ⅲ代)型鉴别
显微镜下观察3～5代的RA FLS生长迅速，丧失接触性抑制，可以形成肿瘤细胞样灶，5代以后的RA FLS，生长速度减缓，细胞形态趋向于长梭形，平均约80 μmol/L，排列整齐，取向一致，以上转化特点逐渐丧失。为了研究genistein对于类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增生的影响，我们采用不同浓度的genistein(0、19、37、74 μmol/L)作用于RA FLS，4 d后细胞计数，以不加genistein组作为对照(100%)，其余各组对应百分比。Genistein对于RA FLS 生长抑制呈剂量依赖性，30 μmol/L的genistein对于RA FLS细胞计数达50%，而对于OA FLS 仅达24%；这说明RA FLS与OA FLS对genistein具有不同的敏感性。37 μmol/L(相当于10 μg/ml)genistein对于RA FLS生长抑制十分显著，观察genistein该浓度组的细胞形态发现，除了增生缓慢以外，无灶样改变，FLS重新出现接触抑制，细胞长度变短，轮廓增强，易形成树突状结构外观，而且RA FLS的改变较OA FLS明显。
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利用3H-TdR掺入法，在DNA合成水平上，我们观察不同浓度genistein对于RA FLS增生的影响(见表1)。genistein对于RA FLS成剂量依赖性抑制，与各对照组相比，各剂量组genistein均明显抑制RA FLS的DNA合成(P<0.01)，其中，37 μmol/L genistein对于FLS H3-TdR摄入的抑制达到86.2%。
表1 Genistein对类风湿关节炎
成纤维样滑膜细胞DNA合成与非贴壁生长细胞克隆数目的影响(
±s) 染料木黄酮
μmol/L
3H-TdR
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克隆数目
0
4553±671
72±4
19
2375±104
26±2
37
633±76
11±2
74
362±43
5±1
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注：组间q检验，每两组间比较P<0.01
我们应用37 μmol/L genistein观察RA FLS 的细胞周期改变，结果血清组(见图2)细胞周期分布为G1：46.5%，S：39.6%，G2-M：13.9%；而genistein作用组细胞周期分布G1期明显居多(85.9%)。可见genistein对于RA FLS生长抑制作用于G1期限制点，而非G2-M期。
图2 Genistein对于类风湿关节炎
成纤维样滑膜细胞周期影响
双层琼脂法分析genistein对于RA FLS非贴壁生长的影响，见表1，各剂量组genistein明显抑制RA FLS的克隆形成数目(P<0.01)。倒置显微镜下观察，genistein作用下RA FLS细胞多呈单个状态，即使形成细胞克隆，克隆面积与细胞数目明显少于无抑制剂组。因为非贴壁生长与细胞转化特性密切相关，尤其对于间充质来源的细胞来说，其与裸鼠成瘤性高度相关。因此，在此意义上genistein可以抑制RA FLS的转化特性。
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3 讨 论
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性系统性疾病，全世界发病率为1%，我国发病率为0.3%，1年内致残率高达20%，严重威胁人类的健康和生活质量。正常滑膜衬里层细胞包括A型细胞(巨噬细胞样滑膜细胞)、B型细胞(成纤维样滑膜细胞)、C型细胞(树突状滑膜细胞)。当RA发生时，大量炎性细胞浸润于滑膜下层，其中包括T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞等。应用特异性细胞表面标记抗体，我们鉴定原代培养的RA滑膜细胞。当传代至第三代时，成熟T细胞(CD3)、所有B细胞(CD20)、单核/巨噬细胞(CD14、CD11b)和血管内皮细胞(von Willibrand factor)所占比例均小于1%，因此我们认为体外培养三次传代以后的滑膜细胞为型别均一的成纤维样滑膜细胞，从而为我们进一步观察RA FLS生长特性奠定基础。
1985年Fassenbender首先提出RA滑膜细胞具有转化细胞特征，以后实验研究发现其转化特征主要表现在以下方面：①RA异常增生的滑膜组织类似于局限性侵袭生长的肿瘤，造成关节的破坏；②RA FLS具有细胞核大而苍白、核仁突出等转化细胞表现；③RA FLS体外培养时丧失接触性抑制，易形成肿瘤细胞样的灶；④RA FLS可以在非贴壁情况下以克隆形式生长[4]；⑤70%RA病人滑膜中可以检测到ras、c-myc、c-myb等原癌基因的高表达[5]；⑥最令人信服的证据是当将RA FLS与软骨共同植入SCID小鼠体内时，仍可以在60 d后表现出侵蚀软骨特性，而骨性关节炎和正常滑膜成纤维细胞则无此特征[6]。如上实验表明RA FLS已经发生不可逆性改变，即使在脱离炎性环境的条件下，仍可以持续活化、迁徙，侵蚀关节软骨和骨。由此可见，成纤维样滑膜细胞的转化特性在RA的发生、发展中发挥着T细胞依赖途径所不可解释的重要作用。RA FLS的转化特性可能是类风湿关节炎疾病发生的早期特征[7]。
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众所周知，酪氨酸激酶调控细胞生长、分化、细胞周期、代谢、转录、信号传导等[8]。许多生长因子受体，如表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)等都具有PTK活性，一半以上的原癌基因产物也具有PTK活性。蛋白酪氨酸磷酸化在正常细胞中仅占0.03%，但是在转化细胞中可以升高至10～20倍[2]。酪氨酸激酶是正常细胞与转化细胞相互转变的关键环节。1992年William等[9]研究发现，类风湿关节炎滑膜组织的PTK活性远远高于骨关节炎(OA)，我们以往的研究证实，RA FLS的PTK活性高于OA，表现在RA FLS中磷酸化酪氨酸程度是OA FLS的4～6倍。本实验应用genistein特异性PTK抑制剂，深入探讨酪氨酸激酶在RA FLS异常增生与转化特征中的作用。
Genistein是从食用大豆中提取的4′，5，7-三羟异黄酮，广泛用于研究抑制肿瘤细胞生长的研究中[10]。1987年Akiyama发现genistein是一种特异性酪氨激酶抑制剂。在体外和细胞整体水平研究中，genistein特异性抑制生长因子受体型酪氨酸激酶(RPTK)以及非受体型酪氨酸激酶(NRPTK)中src癌基因家族的活性。而其他酪氨酸激酶抑制剂可能在细胞整体水平上丧失抑制作用。本实验研究结果证实，genistein明显抑制体外培养的RA FLS的增生，细胞计数和3H-TdR摄入均反应了genistein呈剂量依赖性抑制作用。在肿瘤细胞研究中，根据其分化状态，genistein可以使肿瘤细胞细胞周期抑制于G0～G1期或G2-M期。本实验则证实genistein作用于RA FLS细胞周期于“G1期限制点”。由此可见，PTK对于RA FLS细胞增生周期的重要性，某些蛋白酪氨酸残基磷酸化对于RA FLS通过“G1限制点”是必需的。非贴壁生长是体外研究细胞系转化最常用的方法，它与细胞转化特性密切相关。对于间充质来源的细胞来说，它与裸鼠成瘤性高度相关。Genistein可以呈剂量依赖性抑制RA FLS非贴壁生长所形成的细胞克隆数目。鉴于RA FLS的转化特性在RA疾病发生、发展中的重要作用，对于成纤维样滑膜细胞转化特性的抑制，很可能成为治疗RA的有效措施；双层琼脂培养为分析RA FLS新的生长抑制剂疗效提供了一种可靠的体外实验方法。
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然而，genistein除了具有PTK抑制作用以外，尚具有部分抑制PKC激酶、拓扑异构酶Ⅱ、S6激酶作用，雌激素样或抗雌激素样效应和抗氧化剂作用。因此其对于肿瘤生长抑制的作用位点尚待进一步确定[10]。研究表明genistein除了PTK抑制效应以外的所有抑制作用的IC50明显高于50 μmol/L，而它在体内的最高血药浓度值也仅在5～10 μg/ml(19～37 μmol/L)。37 μmol/L的genistein已经明显抑制RA FLS的DNA合成，对细胞数目增长抑制超过50%，并可以明显减少FLS非贴壁生长的克隆数目。因此可以肯定PTK在RA FLS异常增生及转化特性中发挥重要作用。许多生长因子受体及癌基因具有PTK活性，而一些抑癌基因具有酪氨酸磷酸酶(PTP)活性，因此RA FLS中极可能存在原癌基因的突变或高表达，或抑癌基因的突变从而导致RA FLS中PTK活性升高，PTP活性降低，使蛋白质酪氨酸磷酸化程度增加，并表现出异常增生和转化特性。深入探讨RA FLS转化特性及其酪氨酸激酶活性蛋白的基因改变必将为阐明RA的发病机制和治疗RA提供新的思路。
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基金项目：国家自然科学基金重点项目资助(39730430)
参 考 文 献
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2，乐志培，尹桂山，李国梁.生物信息胞内传递分子机理.北京：世界图书出版公司 北京公司，1997.71-74.
3，Arnet FC,Edworthy SM,Bloch DA,et al.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1988,31:315-324.
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4，Lafyatis R,Remmers EF,Roberts AB,et al.Anchorage-independent growth of synoviocytes from arthritic and normal joints:stimulation by exogenous platelet-derived growth factor and inhibition by transforming growth factor-beta and retinoids.J Clin Invest,1989,83:1267-1276.
5，Trabandt A,Aicher WK,Gay RE,et al.Expression of the collagenolytic and ras-induced cyste-ne proteinase cathepsin L and proliferation associated oncogenes on synovial cells of MRL/mice and patients with rheumatoid arthritis.Matrix,1990,10:349-361.
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6，Müller-Ladner,Jorg Kriegmann,Barry N.Synovial fibroblasts of patients with rheumatoid arthritis attach to and invade normal human cartilage when engrafted into SCLD mice.Am J Pathol,1996,149:1067-1615.
7，Lin CW,Robbins PD,Georgescu HI,et al.Effects of immortali-zation upon the induction of matrix metalloproteinases in rabbit synovial fibroblasts.Exp Cell Res,1996,223:117-126.
8，Hunter T.Tyrosine phosphorylation:past,present and future.Bio-chem Soc Trans,1996,24:308-327.
9，Williams WV,Joan M.Tyrosine kinase signal transduction in rheu-matoid synovitis.Arthritis Rheum,1992,21:317-329.
10，Peterson G.Evaluation of the Biochemical targets of genistein in tumor cells.J Nutr,1992,125:784-789.
(收稿日期：1999-09-27), http://www.100md.com
单位：孙铁铮(100044 北京大学人民医院关节病研究所)；吕厚山(100044 北京大学人民医院关节病研究所)；药立波(第四军医大学生化及分子生物学教研室)；燕太强(100044 北京大学人民医院关节病研究所)；杨刚(100044 北京大学人民医院关节病研究所)
关键词：关节炎；滑膜；成纤维细胞；蛋白质酪氨酸激酶；增生；转化
中华风湿病学杂志000503 【摘 要】 目的 研究酪氨酸激酶(PTK)在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)异常增生与转化特性中的作用。方法 原代培养类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞。应用形态观察、细胞计数、3H-TdR掺入、流式细胞仪检测和双层琼脂培养法探讨染料木黄酮，特异性PTK抑制剂对于RA FLS细胞生长状态、数目、DNA合成、细胞周期及其非贴壁生长情况下细胞克隆形成数目的影响。结果 Genistein呈剂量依赖性抑制RA FLS 的数目增长、3H-TdR掺入和非贴壁生长的克隆形成数目；其生长抑制作用在细胞周期中G1期限制点。结论 酪氨酸激酶在RA FLS细胞异常增生与转化表现中发挥关键作用。
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【Abstract】 Objective To study the role of protein tyrosine kinase (PTK) in abnormal proliferation and transformation phenotype of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte (RA FLS).Methods RA FLS was primarily cultured.Genistein,a protein tyrosine kinase inhibitor,was used to elucidate the effect of PTK on RA FLS morphology,number,DNA synthysis,cell cycle and colony numbers under anchorage-independent growth with microscope,cell counts,3H-TdR incorporation,flow cytometry and LMP agarose culture method.Results Genistein had an inhibitory effect on RA FLS cell number,3H-TdR incorporation and colony numbers under anchorage-independent growth in dose-dependent manner;the inhibition on RA FLS cell cycle was at G1 restriction point.Conclusion PTK has a key role in abnormal proliferation and transformation of RA FLS.
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【Key words】 Arthritis; Synovial membrane; Fibroblasts; Protein-tyrosine kinase; Proliferation; Transformation
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)以成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)过度增生、单核细胞浸润及新生血管形成为特征。增生的滑膜组织侵蚀周围肌腱、韧带、软骨和骨，造成关节的进行性破坏、畸形和功能丧失，对人类健康及生活质量构成严重威胁。近年来的研究表明，类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞具有转化细胞的外观表现[1]，而酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)在调控细胞生长、代谢、信号传递等生命活动中发挥重要作用，是正常细胞与转化细胞相互转变的关键环节[2]。本研究应用酪氨酸激酶抑制剂，染料木黄酮(genistein)观察其对于类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞生长的影响，以探明酪氨酸激酶在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞异常增生和转化中所发挥的作用。
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1 材料与方法
1.1 滑膜细胞的培养：滑膜均取材于北京大学人民医院关节病研究所行膝关节置换或滑膜切除术的类风湿关节炎病人，所有病人均符合1987年美国风湿病协会修订的类风湿关节炎诊断标准[3]。术中取出滑膜组织，立即于无菌条件下剪碎，1.0 mg/ml Ⅰ型胶原酶(GIBCO-BRL)，37 ℃消化4 h后，离心收集细胞，加入含有20% FBS-DMEM(GIBCO-BRL)培养液，置于37 ℃、5%CO2孵箱中令其贴壁生长，细胞生长至85%汇满时，胰蛋白酶EDTA消化进行1∶3传代。本实验中采用3～5代成纤维样滑膜细胞。
1.2 滑膜细胞型别鉴定：取1～3代滑膜细胞，用0.125 mmol/L EDTA缓慢消化下来，PBS洗涤，台盼蓝染色计算活细胞数目，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD20、von Willibrand factor (Serotech UK)，和PE标记的小鼠抗人CD11b；4 ℃作用45 min；以含有1%的马血清的PBS溶液充分混匀作用1 h，80%酒精固定。实验均按三个平行管设计，重复6次。每次均以FITC和PE标记的鼠源性抗体作为阴性对照。样品集中进行流式细胞仪测定相对荧光强度及阳性细胞比例。
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1.3 Genistein对于RA成纤维样滑膜细胞生长数目的影响：将1×105 3～5代滑膜成纤维细胞种于60 mm Costar细胞平皿中，24 h贴壁后，在20% FBS-DMEM中加入不同浓度梯度genistein(Sigma)的DMSO贮存液。培养4 d以后，细胞用胰酶消化下来，台盼蓝染色，倒置纤维镜下计算活细胞数目。
1.4 Genistein对于RA成纤维样滑膜细胞DNA合成的影响：将1×104 3～5代滑膜成纤维细胞种于96孔板中，令其贴壁生长24 h，换以含有1% FBS-DMEM培养液静息24 h以后，重新加入20% FBS-DMEM培养液，并加入不同浓度梯度的genistein作用48 h在最后0.5 h的时候，加入3H-TdR(中国原子能研究所)18.5 kBq/孔，利用收获器将细胞收获于玻璃纤维滤膜上，γ计数仪下液闪计数。实验按三个平行孔设计，重复6次。
1.5 Genistein对于RA成纤维样滑膜细胞周期的影响：取85%汇满、状态良好的3～5代滑膜成纤维样细胞，以无血清DMEM静息24 h。抑制剂组于静息12 h加入37 μmol/L genistein，最后换以20% FBS-DMEM作用48 h。胰酶消化细胞，PBS洗涤细胞2次，70%酒精固定，无DNA酶的RNA酶(Sigma)100 ng/ml，37 ℃处理30 min，以100 ng/ml碘化丙啶(propidium iodide，PI)作用至少4 h后，进行流式细胞仪细胞周期的检测。
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1.6 Genistein对于RA FLS非贴壁情况下生长的影响：混合5 ml FBS、10 ml 1.67×DMEM和10 ml 1.6%的低熔点琼脂糖(LMP agarose，Canada)，以0.5 ml/孔混合液覆盖24孔板底层，室温凝固后，每孔加入0.6 ml 20% FBS-1.67×DMEM与不同浓度的genistein(0、19、37、74 μmol/L)，置于孵箱中达到浓度平衡后，加入0.6 ml 20%FBS-1.67×DMEM、1×104滑膜成纤维样细胞及其0.8 ml 1%的LMP琼脂糖的混合物，从而达到每孔2 ml的总体积。置于37 ℃、5%的CO2孵箱中，2周后观察并在40×倒置显微镜下随机选择5个视野计算细胞克隆数目(细胞数目>50个/克隆)。
2 结 果
流式细胞仪分析原代培养的滑膜细胞表面分子标志，发现CD3阳性细胞占7.9%，CD14阳性细胞占7.3%，CD11b阳性细胞占7.8%，CD20阳性细胞占7.5%，von Willibrand factor阳性细胞占0.9%。当按1∶3比例传至第三代时，以上各种细胞表面标志阳性细胞比例均小于1%(见图1)。所以，按照如上培养方法，当滑膜细胞培养到第三代时，即可以认为是型别较为均一的成纤维样滑膜细胞。
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图1 类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(Ⅲ代)型鉴别
显微镜下观察3～5代的RA FLS生长迅速，丧失接触性抑制，可以形成肿瘤细胞样灶，5代以后的RA FLS，生长速度减缓，细胞形态趋向于长梭形，平均约80 μmol/L，排列整齐，取向一致，以上转化特点逐渐丧失。为了研究genistein对于类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增生的影响，我们采用不同浓度的genistein(0、19、37、74 μmol/L)作用于RA FLS，4 d后细胞计数，以不加genistein组作为对照(100%)，其余各组对应百分比。Genistein对于RA FLS 生长抑制呈剂量依赖性，30 μmol/L的genistein对于RA FLS细胞计数达50%，而对于OA FLS 仅达24%；这说明RA FLS与OA FLS对genistein具有不同的敏感性。37 μmol/L(相当于10 μg/ml)genistein对于RA FLS生长抑制十分显著，观察genistein该浓度组的细胞形态发现，除了增生缓慢以外，无灶样改变，FLS重新出现接触抑制，细胞长度变短，轮廓增强，易形成树突状结构外观，而且RA FLS的改变较OA FLS明显。
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利用3H-TdR掺入法，在DNA合成水平上，我们观察不同浓度genistein对于RA FLS增生的影响(见表1)。genistein对于RA FLS成剂量依赖性抑制，与各对照组相比，各剂量组genistein均明显抑制RA FLS的DNA合成(P<0.01)，其中，37 μmol/L genistein对于FLS H3-TdR摄入的抑制达到86.2%。
表1 Genistein对类风湿关节炎
成纤维样滑膜细胞DNA合成与非贴壁生长细胞克隆数目的影响(
±s) 染料木黄酮μmol/L
3H-TdR
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克隆数目
0
4553±671
72±4
19
2375±104
26±2
37
633±76
11±2
74
362±43
5±1
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注：组间q检验，每两组间比较P<0.01
我们应用37 μmol/L genistein观察RA FLS 的细胞周期改变，结果血清组(见图2)细胞周期分布为G1：46.5%，S：39.6%，G2-M：13.9%；而genistein作用组细胞周期分布G1期明显居多(85.9%)。可见genistein对于RA FLS生长抑制作用于G1期限制点，而非G2-M期。
图2 Genistein对于类风湿关节炎
成纤维样滑膜细胞周期影响
双层琼脂法分析genistein对于RA FLS非贴壁生长的影响，见表1，各剂量组genistein明显抑制RA FLS的克隆形成数目(P<0.01)。倒置显微镜下观察，genistein作用下RA FLS细胞多呈单个状态，即使形成细胞克隆，克隆面积与细胞数目明显少于无抑制剂组。因为非贴壁生长与细胞转化特性密切相关，尤其对于间充质来源的细胞来说，其与裸鼠成瘤性高度相关。因此，在此意义上genistein可以抑制RA FLS的转化特性。
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3 讨 论
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性系统性疾病，全世界发病率为1%，我国发病率为0.3%，1年内致残率高达20%，严重威胁人类的健康和生活质量。正常滑膜衬里层细胞包括A型细胞(巨噬细胞样滑膜细胞)、B型细胞(成纤维样滑膜细胞)、C型细胞(树突状滑膜细胞)。当RA发生时，大量炎性细胞浸润于滑膜下层，其中包括T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞等。应用特异性细胞表面标记抗体，我们鉴定原代培养的RA滑膜细胞。当传代至第三代时，成熟T细胞(CD3)、所有B细胞(CD20)、单核/巨噬细胞(CD14、CD11b)和血管内皮细胞(von Willibrand factor)所占比例均小于1%，因此我们认为体外培养三次传代以后的滑膜细胞为型别均一的成纤维样滑膜细胞，从而为我们进一步观察RA FLS生长特性奠定基础。
1985年Fassenbender首先提出RA滑膜细胞具有转化细胞特征，以后实验研究发现其转化特征主要表现在以下方面：①RA异常增生的滑膜组织类似于局限性侵袭生长的肿瘤，造成关节的破坏；②RA FLS具有细胞核大而苍白、核仁突出等转化细胞表现；③RA FLS体外培养时丧失接触性抑制，易形成肿瘤细胞样的灶；④RA FLS可以在非贴壁情况下以克隆形式生长[4]；⑤70%RA病人滑膜中可以检测到ras、c-myc、c-myb等原癌基因的高表达[5]；⑥最令人信服的证据是当将RA FLS与软骨共同植入SCID小鼠体内时，仍可以在60 d后表现出侵蚀软骨特性，而骨性关节炎和正常滑膜成纤维细胞则无此特征[6]。如上实验表明RA FLS已经发生不可逆性改变，即使在脱离炎性环境的条件下，仍可以持续活化、迁徙，侵蚀关节软骨和骨。由此可见，成纤维样滑膜细胞的转化特性在RA的发生、发展中发挥着T细胞依赖途径所不可解释的重要作用。RA FLS的转化特性可能是类风湿关节炎疾病发生的早期特征[7]。
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众所周知，酪氨酸激酶调控细胞生长、分化、细胞周期、代谢、转录、信号传导等[8]。许多生长因子受体，如表皮生长因子受体(EGFR)和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)等都具有PTK活性，一半以上的原癌基因产物也具有PTK活性。蛋白酪氨酸磷酸化在正常细胞中仅占0.03%，但是在转化细胞中可以升高至10～20倍[2]。酪氨酸激酶是正常细胞与转化细胞相互转变的关键环节。1992年William等[9]研究发现，类风湿关节炎滑膜组织的PTK活性远远高于骨关节炎(OA)，我们以往的研究证实，RA FLS的PTK活性高于OA，表现在RA FLS中磷酸化酪氨酸程度是OA FLS的4～6倍。本实验应用genistein特异性PTK抑制剂，深入探讨酪氨酸激酶在RA FLS异常增生与转化特征中的作用。
Genistein是从食用大豆中提取的4′，5，7-三羟异黄酮，广泛用于研究抑制肿瘤细胞生长的研究中[10]。1987年Akiyama发现genistein是一种特异性酪氨激酶抑制剂。在体外和细胞整体水平研究中，genistein特异性抑制生长因子受体型酪氨酸激酶(RPTK)以及非受体型酪氨酸激酶(NRPTK)中src癌基因家族的活性。而其他酪氨酸激酶抑制剂可能在细胞整体水平上丧失抑制作用。本实验研究结果证实，genistein明显抑制体外培养的RA FLS的增生，细胞计数和3H-TdR摄入均反应了genistein呈剂量依赖性抑制作用。在肿瘤细胞研究中，根据其分化状态，genistein可以使肿瘤细胞细胞周期抑制于G0～G1期或G2-M期。本实验则证实genistein作用于RA FLS细胞周期于“G1期限制点”。由此可见，PTK对于RA FLS细胞增生周期的重要性，某些蛋白酪氨酸残基磷酸化对于RA FLS通过“G1限制点”是必需的。非贴壁生长是体外研究细胞系转化最常用的方法，它与细胞转化特性密切相关。对于间充质来源的细胞来说，它与裸鼠成瘤性高度相关。Genistein可以呈剂量依赖性抑制RA FLS非贴壁生长所形成的细胞克隆数目。鉴于RA FLS的转化特性在RA疾病发生、发展中的重要作用，对于成纤维样滑膜细胞转化特性的抑制，很可能成为治疗RA的有效措施；双层琼脂培养为分析RA FLS新的生长抑制剂疗效提供了一种可靠的体外实验方法。
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然而，genistein除了具有PTK抑制作用以外，尚具有部分抑制PKC激酶、拓扑异构酶Ⅱ、S6激酶作用，雌激素样或抗雌激素样效应和抗氧化剂作用。因此其对于肿瘤生长抑制的作用位点尚待进一步确定[10]。研究表明genistein除了PTK抑制效应以外的所有抑制作用的IC50明显高于50 μmol/L，而它在体内的最高血药浓度值也仅在5～10 μg/ml(19～37 μmol/L)。37 μmol/L的genistein已经明显抑制RA FLS的DNA合成，对细胞数目增长抑制超过50%，并可以明显减少FLS非贴壁生长的克隆数目。因此可以肯定PTK在RA FLS异常增生及转化特性中发挥重要作用。许多生长因子受体及癌基因具有PTK活性，而一些抑癌基因具有酪氨酸磷酸酶(PTP)活性，因此RA FLS中极可能存在原癌基因的突变或高表达，或抑癌基因的突变从而导致RA FLS中PTK活性升高，PTP活性降低，使蛋白质酪氨酸磷酸化程度增加，并表现出异常增生和转化特性。深入探讨RA FLS转化特性及其酪氨酸激酶活性蛋白的基因改变必将为阐明RA的发病机制和治疗RA提供新的思路。
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基金项目：国家自然科学基金重点项目资助(39730430)
参 考 文 献
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4，Lafyatis R,Remmers EF,Roberts AB,et al.Anchorage-independent growth of synoviocytes from arthritic and normal joints:stimulation by exogenous platelet-derived growth factor and inhibition by transforming growth factor-beta and retinoids.J Clin Invest,1989,83:1267-1276.
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(收稿日期：1999-09-27), http://www.100md.com