系统性红斑狼疮发病中IL-12及信号传递分子STAT3STAT4对外周血淋巴细胞的作用
作者：李清刚 李幼姬 李志坚 董秀清
单位：李清刚(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)；李幼姬(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)；李志坚(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)；董秀清(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)
关键词：
中华风湿病学杂志000512 系统性红斑狼疮(SLE)被公认为是一种自身免疫性疾病，淋巴细胞过度增生，以及大量自身抗体产生是其重要的发病机制[1]。最近有报道，白细胞介素-12(interleukine-12，IL-12)可使正常人B细胞在SA、IL-2等协同作用刺激下，合成大量自身抗体，并且促进T淋巴细胞增生、分泌INF-γ等，但IL-12是否促进SLE活动期外周血单个核淋巴细胞(PBMC)增生、分化、分泌自身抗体，以及发挥异常生物学作用的细胞内信号传递机制，未见有报道，我们对此进行了研究。
, http://www.100md.com
1 资料与方法
1.1 研究对象：16例SLE活动期患者均符合1982年ARA SLE诊断标准，均为1998年4月至8月间的住院病人，均为女性，平均年龄25.9岁(17～47岁)，平均病程1.4年(1.5个月～6年)。
1.2 细胞培养：清晨空腹抽取肘静脉血10ml肝素抗凝，分离PBMC，以2×106/ml加入24孔细胞培养板培养，分别设空白对照，IL-12(10 ng/ml)，IL-2(100 U/ml)，IL-12 (10 ng/ml)+IL-2(100 U/ml)刺激实验组。
1.3 标本检测：PBMC增生检测应用MTT法，在2400酶标仪(美国)测A560～A630吸光度(A值)。IgG、IgA、IgM水平用ELISA方法检测。STAT3、STAT4测定采用免疫沉淀、免疫印迹[2]、化学发光方法[2]检测。
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1.4 统计学处理：检测数据以
±s表示，结果采用t检验。
2 结 果
IL-12可直接促进SLE患者PBMC增生，对正常人PBMC作用不明显，与IL-2协同可促进PBMC增生，见图1。
图1 IL-12、IL-2、IL-12+IL-2
对SLE正常对照PBMC增生
IL-12单独刺激PBMC，只有SLE患者IgG、IgM合成量显著增高(P<0.01)，IgA合成量变化不大(P>0.05)。IL-12与IL-2协同刺激后，SLE患者以及正常人PBMC较IL-12直接刺激合成IgG、IgM显著增高(P<0.01)，IgA水平变化不显著(P>0.05)，见表1。
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SLE患者PBMC经IL-12单独或与IL-2协同刺激后，STAT3、STAT4磷酸酪氨酸异常活化，正常人PBMC需IL-2协同刺激才出现活化，单独IL-12刺激只有STAT3发生磷酸酪氨酸活化。
3 讨 论
IL-12是近年发现的一种细胞炎症因子，主要由T、B淋巴细胞及单核-巨噬细胞合成，发挥重要免疫学作用。
Diane等[3]学者报道IL-12与SA或IL-2协同刺激对正常T、B淋巴细胞有促增生、分化作用，我们的实验结果与上述报道一致，但还发现在活动期SLE患者并不要IL-2的协同刺激，IL-12单独即可促进PBMC增生、分化产生免疫球蛋白，这可能与SLE患者PBMC本身存在异常，或由于体内高水平的细胞因子预刺激促进了IL-12受体的表达有关，从而直接对IL-12产生反应。
, 百拇医药
表1 IL-12单独及与IL-2协同诱导PBMC分泌免疫球蛋白的变化(±s) 组别
例数
Ig
ng/ml
空白对照
IL-12
10 ng/ml
IL-12 (10 ng/ml)+IL-2
(100 U/ml)
IgG
, 百拇医药
35±14
48±21
4 813±166ΔΔ
正常对照组
10
IgM
46±19
60±31
2 004±329ΔΔ
IgA
30±14
34±18
, 百拇医药
51±27
IgG
41±17
3 704±338**
5 974±498**ΔΔ
SLE活动期组
16
IgM
51±13
4 494±737**
5 337±400**Δ
, http://www.100md.com
IgA
42±21
46±15
57±23*
注：SLE活动期组Ig分别与正常对照组相比较*P<0.05，**P<0.01；IL-12与IL-2+IL-12协同组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；实验组IgG、IgM合成与空白对照组相比较，P<0.01
许多研究证实，在正常淋巴细胞，IL-12发挥生物学作用的细胞内信号传递机制通过STAT3、STAT4实现，并且只有IL-12才能将STAT4激活[2]。IL-12结合于受体，使STAT3、STAT4酪氨酸磷酸化后，转位到核内，结合于特异基因的启动子序列上促进基因表达，发挥生物学作用。
, 百拇医药
在本研究中，单独应用IL-12只对SLE活动期PBMC的STAT3、STAT4活化，正常人PBMC需要IL-2的协同刺激才能活化，这表明PBMC的增生、分化与IL-12的细胞内信号传递机制紧密相关，Azzoni等[4]学者就发现IL-12可促进细胞内c-myc基因表达(一种细胞增生标志)，这可能是由于IL-12通过信号传递途径上调了c-myc基因表达，从而使细胞增生、分化。SLE活动期PBMC上的IL-12受体可能已被多种炎症因子刺激表达，或处于异常状态，IL-12可直接促使STAT3、STAT4活化；而正常PBMC经IL-2预刺激后，诱导了IL-12受体表达，IL-12才能激活信号传递分子STAT3、STAT4。单独IL-2刺激有STAT3、无STAT4磷酸化，并且单独IL-12刺激后，STAT3活化信号弱，协同刺激信号强，这一方面说明IL-2亦能促进STAT3活化，另一方面说明IL-12除STAT3外，主要是通过STAT4发挥作用，这与Yu等[5]的报道相一致。因此，我们推知IL-12通过SLE患者异常的信号传导途径STAT3、STAT4促进PBMC增生、分化，合成大量自身抗体，参与疾病的发生。 参 考 文 献
, http://www.100md.com
1，叶任高，沈清瑞，主编.肾脏病诊断与治疗学.北京：人民卫生出版社，1994.271-276.
2，Jacobson NG,Szabo SJ,Weber RM,et al.Interlukine 12 signaling in T helper type 1 (Th1) cells involves tyrosine phosphorylation of signal transducer and activator of transcription STAT3 and STAT4.J Exp Med,1995,181:1755.
3，Diane F,Jrline K,Julie K.Role of IL-12 in human B lymphocyte proiferation and differentiation.J Immunol,1995,154:1606.
, http://www.100md.com
4，Azzoni L,Kanakaraj P,Olga Zatsepina,et al.IL-12 induced activation of NK and T cells occurs in the absence of immediate early activation gene expression.J Immunol,1996,157:3235.
5，Yu CHR,Lin JX,Donald W,et al.Differential utilization of janus kinase-signal transducer and activation of transcription signaling pathways in the stimulation of human natural killer cells by IL-2,IL-12 and IFN-γ.J Immunol,1996,157:126.
(收稿日期：1999-10-23), 百拇医药
单位：李清刚(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)；李幼姬(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)；李志坚(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)；董秀清(510080 广州，中山医科大学附属第一医院肾病研究所)
关键词：
中华风湿病学杂志000512 系统性红斑狼疮(SLE)被公认为是一种自身免疫性疾病，淋巴细胞过度增生，以及大量自身抗体产生是其重要的发病机制[1]。最近有报道，白细胞介素-12(interleukine-12，IL-12)可使正常人B细胞在SA、IL-2等协同作用刺激下，合成大量自身抗体，并且促进T淋巴细胞增生、分泌INF-γ等，但IL-12是否促进SLE活动期外周血单个核淋巴细胞(PBMC)增生、分化、分泌自身抗体，以及发挥异常生物学作用的细胞内信号传递机制，未见有报道，我们对此进行了研究。
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1 资料与方法
1.1 研究对象：16例SLE活动期患者均符合1982年ARA SLE诊断标准，均为1998年4月至8月间的住院病人，均为女性，平均年龄25.9岁(17～47岁)，平均病程1.4年(1.5个月～6年)。
1.2 细胞培养：清晨空腹抽取肘静脉血10ml肝素抗凝，分离PBMC，以2×106/ml加入24孔细胞培养板培养，分别设空白对照，IL-12(10 ng/ml)，IL-2(100 U/ml)，IL-12 (10 ng/ml)+IL-2(100 U/ml)刺激实验组。
1.3 标本检测：PBMC增生检测应用MTT法，在2400酶标仪(美国)测A560～A630吸光度(A值)。IgG、IgA、IgM水平用ELISA方法检测。STAT3、STAT4测定采用免疫沉淀、免疫印迹[2]、化学发光方法[2]检测。
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1.4 统计学处理：检测数据以
±s表示，结果采用t检验。2 结 果
IL-12可直接促进SLE患者PBMC增生，对正常人PBMC作用不明显，与IL-2协同可促进PBMC增生，见图1。
图1 IL-12、IL-2、IL-12+IL-2
对SLE正常对照PBMC增生
IL-12单独刺激PBMC，只有SLE患者IgG、IgM合成量显著增高(P<0.01)，IgA合成量变化不大(P>0.05)。IL-12与IL-2协同刺激后，SLE患者以及正常人PBMC较IL-12直接刺激合成IgG、IgM显著增高(P<0.01)，IgA水平变化不显著(P>0.05)，见表1。
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SLE患者PBMC经IL-12单独或与IL-2协同刺激后，STAT3、STAT4磷酸酪氨酸异常活化，正常人PBMC需IL-2协同刺激才出现活化，单独IL-12刺激只有STAT3发生磷酸酪氨酸活化。
3 讨 论
IL-12是近年发现的一种细胞炎症因子，主要由T、B淋巴细胞及单核-巨噬细胞合成，发挥重要免疫学作用。
Diane等[3]学者报道IL-12与SA或IL-2协同刺激对正常T、B淋巴细胞有促增生、分化作用，我们的实验结果与上述报道一致，但还发现在活动期SLE患者并不要IL-2的协同刺激，IL-12单独即可促进PBMC增生、分化产生免疫球蛋白，这可能与SLE患者PBMC本身存在异常，或由于体内高水平的细胞因子预刺激促进了IL-12受体的表达有关，从而直接对IL-12产生反应。
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表1 IL-12单独及与IL-2协同诱导PBMC分泌免疫球蛋白的变化(
±s) 组别例数
Ig
ng/ml
空白对照
IL-12
10 ng/ml
IL-12 (10 ng/ml)+IL-2
(100 U/ml)
IgG
, 百拇医药
35±14
48±21
4 813±166ΔΔ
正常对照组
10
IgM
46±19
60±31
2 004±329ΔΔ
IgA
30±14
34±18
, 百拇医药
51±27
IgG
41±17
3 704±338**
5 974±498**ΔΔ
SLE活动期组
16
IgM
51±13
4 494±737**
5 337±400**Δ
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IgA
42±21
46±15
57±23*
注：SLE活动期组Ig分别与正常对照组相比较*P<0.05，**P<0.01；IL-12与IL-2+IL-12协同组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；实验组IgG、IgM合成与空白对照组相比较，P<0.01
许多研究证实，在正常淋巴细胞，IL-12发挥生物学作用的细胞内信号传递机制通过STAT3、STAT4实现，并且只有IL-12才能将STAT4激活[2]。IL-12结合于受体，使STAT3、STAT4酪氨酸磷酸化后，转位到核内，结合于特异基因的启动子序列上促进基因表达，发挥生物学作用。
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在本研究中，单独应用IL-12只对SLE活动期PBMC的STAT3、STAT4活化，正常人PBMC需要IL-2的协同刺激才能活化，这表明PBMC的增生、分化与IL-12的细胞内信号传递机制紧密相关，Azzoni等[4]学者就发现IL-12可促进细胞内c-myc基因表达(一种细胞增生标志)，这可能是由于IL-12通过信号传递途径上调了c-myc基因表达，从而使细胞增生、分化。SLE活动期PBMC上的IL-12受体可能已被多种炎症因子刺激表达，或处于异常状态，IL-12可直接促使STAT3、STAT4活化；而正常PBMC经IL-2预刺激后，诱导了IL-12受体表达，IL-12才能激活信号传递分子STAT3、STAT4。单独IL-2刺激有STAT3、无STAT4磷酸化，并且单独IL-12刺激后，STAT3活化信号弱，协同刺激信号强，这一方面说明IL-2亦能促进STAT3活化，另一方面说明IL-12除STAT3外，主要是通过STAT4发挥作用，这与Yu等[5]的报道相一致。因此，我们推知IL-12通过SLE患者异常的信号传导途径STAT3、STAT4促进PBMC增生、分化，合成大量自身抗体，参与疾病的发生。 参 考 文 献
, http://www.100md.com
1，叶任高，沈清瑞，主编.肾脏病诊断与治疗学.北京：人民卫生出版社，1994.271-276.
2，Jacobson NG,Szabo SJ,Weber RM,et al.Interlukine 12 signaling in T helper type 1 (Th1) cells involves tyrosine phosphorylation of signal transducer and activator of transcription STAT3 and STAT4.J Exp Med,1995,181:1755.
3，Diane F,Jrline K,Julie K.Role of IL-12 in human B lymphocyte proiferation and differentiation.J Immunol,1995,154:1606.
, http://www.100md.com
4，Azzoni L,Kanakaraj P,Olga Zatsepina,et al.IL-12 induced activation of NK and T cells occurs in the absence of immediate early activation gene expression.J Immunol,1996,157:3235.
5，Yu CHR,Lin JX,Donald W,et al.Differential utilization of janus kinase-signal transducer and activation of transcription signaling pathways in the stimulation of human natural killer cells by IL-2,IL-12 and IFN-γ.J Immunol,1996,157:126.
(收稿日期：1999-10-23), 百拇医药