N-乙基马来酰亚胺敏感因子NSF与食管鳞癌细胞分化有关
作者：张睿 王雪皎 王秀琴 周传农 丁芳 郭明洲 刘芝华 吴旻
单位：张睿 王雪皎 王秀琴 周传农 丁芳 郭明洲 刘芝华 吴旻(中国医学科学院中国协和医科大学分子肿瘤学国家重点实验室，北京100021)
关键词：食管肿瘤；细胞分化
癌症000501
【摘要】目的：克隆食管鳞癌细胞EC8712分化过程中受ATRA调控的靶基因。方法：采用AP-PCR技术从食管鳞癌细胞EC8712中克隆受ATRA调控的差异表达基因片段，并测序及作同源分析，采用Northern杂交进行验证。结果：分离到在食管癌细胞分化过程中表达下调的一基因片段。该基因从ATRA处理一天开始表达被明显抑制，这种抑制持续整个诱导过程。该片段被克隆于pGEM-T载体并测序。同源分析结果表明，该基因片段与人N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)基因高度同源(IDENTITY：99%)，为人NSF基因片段。NSF基因在真核细胞囊泡转运系统中发挥着重要作用。结论：参与囊泡转运的NSF基因在食管癌细胞分化过程中发挥着重要作用，NSF表达的抑制是囊泡转运系统转运活性下降的分子机制。
, 百拇医药
中图分类号：R735.1文献标识码：A文章编号：1000-467X(2000)05-0395-04
Esophageal squamous carcinoma cell differentiation-related gene N-ethylmalimide sensitive factor (NSF)
ZHANG Rui, WANG Xue-jiao, WU Min, et al.
(National Laboratory of Molecular Oncology, Department of Cell Biology,Cancer Institutue, PUMC＆ CAMS, Beijing 100021, P.R. China)
【Abstract】 Objective： To clone ATRA-regulated gene in esophageal squamous cancer cell line EC8712. Methods： By using AP-PCR technique, differentially expressed gene fragments (ESTs) were isolated from ATRA-treated EC8712. Cloning, sequencing and homology analysis were carried out to characterize an isolated differentitally expressed gene fragment. Results： The differentially expressed gene fragment was isolated, cloned and sequenced, the gene expression was inhibited during whole ATRA-treatment period, from first day to 9th day. Homology analysis revealed that the fragment derives from human N-ethylmalimide sensitive factor (NSF) gene, which is involed in vesicle transportation, expresses in various tissues, and plays important roles in differentiation of cells. Conclusion： The decrease in activity of cellular vesicle transportation plays important roles in cellular differentiation process. Down-regulation of NSF might contribute to decreased activity of vesicle transportation and differentiation of human cancer cell.
, 百拇医药
Key words： Esophageal neoplasmas; Cell differentiation
维甲类物质可有效地抑制食管癌的发生[1]，同时作为重要的分化诱导剂，已被用于白血病的分化治疗[2]。我室对全反式维甲酸(All-transRetinoicAcid,ATRA)诱导肿瘤细胞分化的分子机制进行了一系列研究，已分离出若干肿瘤分化相关基因[3～5]。分离肿瘤分化相关基因对深入探讨肿瘤细胞分化的分子机制和进行癌症的基因治疗具有重要意义。本工作采用AP-PCR技术分离到一表达受ATRA抑制的基因片段。同源分析表明，该基因片段来自参与细胞内囊泡转运的人N-乙基马来酰亚胺张睿，等.N-乙基马来酰亚胺敏感因子NSF与食管鳞癌细胞分化有关敏感因子(NSF)基因。
1材料和方法
1.1细胞及引物
人食管癌细胞系EC8712，本室建株并传代培养。组织类型为鳞癌，TNM分期为T3N0M0。
, http://www.100md.com
引物AP2：5-GGAAACAGCTATGACCATG-3
1.2全反式维甲酸诱导食管鳞癌细胞
将ATRA溶于含10%DMSO牛血清中，配成10-3mol/L的贮存液。M199培养基含15%小牛血清，正常培养的食管鳞癌细胞EC8712以80万/瓶传代，24小时后，将细胞分为三组，分别加入10-4mol/L的ATRA、1%DMSO或正常培养基。各组细胞均每天换液，在处理1、3、5、7、9天收获细胞，提取总RNA。
1.3逆转录反应
按照Superscript Preamplification System for First Strandc DNA Synthesis(GIBCO/BRL)试剂盒说明书进行。20μl逆转录反应体系中含3μg总RNA，0.5μgoligo(dT)12～18，逆转录反应完成后，采用RNaseH处理。
, http://www.100md.com
1.4AP-PCR反应
按照参考文献[6]进行AP-PCR反应。采用Prep-A-Gene DNA Purification Systems(Bio-Rad)回收差异片段，采用Promega公司的pGEM-Tvectorsystem将PCR产物克隆于pGEM-T载体，按照操作说明操作。
1.5细胞及组织总RNA提取
按照GIBCO公司TRIZOL试剂操作说明提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量后，-70℃保存。
1.6Northern杂交
Northern印迹：按照分子克隆实验指南[7]进行。总RNA样品30μg变性后迅速置于冰上冷却，1.2%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。采用毛细管虹吸法将RNA转移至Zeta-Probe尼龙膜上，转膜液为10×SSC，转膜结束后用GSGeneLinker(Bio-Rad)固定RNA。
, 百拇医药
探针同位素标记：采用Prime-a-GeneLabelingSystem(Promega)标记探针，按操作说明书进行。DNA用量为25ng，同位素α-32P-dCTP用量为50μCi。
杂交：RNA印迹的尼龙膜放入杂交袋，按350μl/cm2膜加入杂交液(1mmol/LEDTA,pH8.0,0.25mmolNa2HPO4，pH7.2，7%SDS)，65℃预杂交30min，弃去杂交液。按照150μl/cm2膜重新加入杂交液，并加入变性的同位素探针，65℃杂交16～20h。1mmol/LEDTA,40mmol/LNa2HPO4,5%SDS,65℃洗膜2次，每次15～30min，1mmol/LEDTA,40mmol/LNa2HPO4,1%SDS,65℃洗膜2次，每次15～30min。放射自显影分析结果。
, http://www.100md.com
2结果
2.1分化诱导过程中差异表达基因的分离、克隆和鉴定
采用AP2引物进行AP-PCR，结果显示(图1)：与对照组相比,ATRA处理后1、3、5、7和9天一基因片段表达明显下降，该基因片段长度约580碱基。
图1 AP-PCR结果差异表达基因片段(箭头)
C：对照组;R：ATRA处理组；D：DMSO处理组。下标数字为处理天数。
M：λDNA/ECOR1+HindIII分子量marker
将差异条带用刀片切出回收DNA，并克隆于GEM-T载体,自动测序仪测序。结果如下：
, http://www.100md.com
cDNA片段序列,589bases
1 ggaaacagctatgaccatgattgagaacagcattttagagattcaatgcc
61 ttgtttcttcaggcaaagagaataccagtcttgtgggagacctttaacca
111 aatacccagtgacttttagtgttagctcaggacagctgtcagaggatctc
161 tggcccacacctcgatttactaagccagatttgcatgtagaaagtctgcc
211 ttctaatcggccaactgttgtcatgcaacattcatgacactgactgagag
, http://www.100md.com 261 ttatcaagggtgatggtgctagtagagaggttgaaacgtgtagtgtccac
311 aagtactggatggttcccacccagagggactgagcaagaaggaatcactt
361 tagcctgcatgggaaggtaagcgcagcattctaaaccaaattgacacctt
411 ccacgagacactaagctatctcagtatgcataaggaagggagttttattg
461 cactaatcatgcagagcgagcacatgttgaaggtagagaacgttccactt
511 agtccagtatcttgagtaagacagtgaagatcctaggccatcctcacctt
, 百拇医药
561 ggtcacttcccatggtcatagctgtttcc
同源比较结果如下：
gb|AF102846.1|AF102846HomosapiensN-ethylmaleimide-sensitivefactor(NSF)mRNA,completecds.
Length=3348 Identities=563/566(99%)
Score=1098bits(554),Expect=0.0 Strand=Plus/Minus
Query：3AAACAGCTATGACCATGATTGAGAACAGCATTTTAGAGATTCAATGCCTTGTTTCTTCAG62
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
, http://www.100md.com
Sbjct：2938AAACATCTCTGACAATGATTGAGAACAGCATTTTAGAGATTCAATGCCTTGTTTCTTCAG2879
Query：63GCAAAGAGAATACCAGTCTTGTGGGAGACCTTTAACCAAATACCCAGTGACTTTTAGTGT122
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2878GCAAAGAGAATACCAGTCTTGTGGGAGACCTTTAACCAAATACCCAGTGACTTTTAGTGT2819
Query：123TAGCTCAGGACAGCTGTCAGAGGATCTCTGGCCCACACCTCGATTTACTAAGCCAGATTT182
, 百拇医药
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2818TAGCTCAGGACAGCTGTCAGAGGATCTCTGGCCCACACCTCGATTTACTAAGCCAGATTT2759
Query：183GCATGTAGAAAGTCTGCCTTCTAATCGGCCAACTGTTGTCATGCAACATTCATGACACTG242
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2758GCATGTAGAAAGTCTGCCTTCTAATCGGCCAACTGTTGTCATGCAACATTCATGACACTG2699
, 百拇医药
Query：243ACTGAGAGTTATCAAGGGTGATGGTGCTAGTAGAGAGGTTGAAACGTGTAGTGTCCACAA302
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2698ACTGAGAGTTATCAAGGGTGATGGTGCTAGTAGAGAGGTTGAAACGTGTAGTGTCCACAA2639
Query：303GTACTGGATGGTTCCCACCCAGAGGGACTGAGCAAGAAGGAATCACTTTAGCCTGCATGG362
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
, http://www.100md.com
Sbjct：2638GTACTGGATGGTTCCCACCCAGAGGGACTGAGCAAGAAGGAATCACTTTAGCCTGCATGG2579
Query：363GAAGGTAAGCGCAGCATTCTAAACCAAATTGACACCTTCCACGAGACACTAAGCTATCTC422
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2578GAAGGTAAGCGCAGCATTCTAAACCAAATTGACACCTTCCACGAGACACTAAGCTATCTC2519
Query：423AGTATGCATAAGGAAGGGAGTTTTATTGCACTAATCATGCAGAGCGAGCACATGTTGAAG482
, 百拇医药
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2518AGTATGCATAAGGAAGGGAGTTTTATTGCACTAATCATGCAGAGCGAGCACATGTTGAAG2459
Query：483GTAGAGAACGTTCCACTTAGTCCAGTATCTTGAGTAAGACAGTGAAGATCCTAGGCCATC542
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2458GTAGAGAACGTTCCACTTAGTCCAGTATCTTGAGTAAGACAGTGAAGATCCTAGGCCATC2399
, 百拇医药
Query：543CTCACCTTGGTCACTTCCCATGGTCA568
||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2398CTCACCTTGGTCACTTCCCATGGTCA2373
图2 NSF表达的Northern杂交分析
C：对照组;D：DMSO处理组；
R：维甲酸处理组。下标数字为处理天数。
a：NSFNorthern杂交。b：RNA上样对照。
结果显示所克隆的差异表达基因片段序列与人N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)基因高度同源(Identities=563/566(99%))，来源于人NSF基因mRNA序列。
, 百拇医药
2.2Northern杂交鉴定ATRA对NSF表达的影响
以同位素标记的人NSF基因片段为探针进行Northern杂交，结果显示(图2)：与对照组相比，ATRA处理后1、3、5、7及9天NSF表达明显下降。该结果与AP-PCR结果一致。
3讨论
我室研究表明，ATRA可抑制肿瘤细胞生长，促使细胞形态向正常上皮细胞方向分化，维甲酸受体所介导的基因表达调控在肿瘤细胞分化过程中发挥着重要作用[3～5，8]。本研究结果表明，人NSF基因的表达从ATRA处理一天开始NSF基因表达被明显抑制，这种抑制持续整个诱导过程。
蛋白质合成后的运输是由细胞内囊泡转运系统完成的,NSF基因发挥着重要作用[9]。囊泡转运系统转运活性的变化不但与正常肾上皮细胞分化有关[10]，而且与HL-60细胞的分化有关，然而其机制尚不清楚[11]。本研究表明，人NSF基因的表达下降是囊泡转运系统转运活性下降的重要机制。囊泡转运系统转运活性下降在食管癌细胞分化过程中发挥重要作用。
, http://www.100md.com
基金项目：本课题受国家攀登计划项目(G1998051205)和“八六三”课题资助项目(Z19-01-01-02)资助
[参考文献]
1，蔡海英，林培中，管建新，等.维甲酸对小鼠前胃鳞状上皮增生与癌变的影响[J].肿瘤防治研究,1978，4：12～18.
2，Huang ME, Ye YC, Chen SR, et al. Use of all-trans retinoic acid in the treatment facute promyelocytic leukemia [J]. Blood,1988，72：567～572.
3，王雪皎，张睿，王秀琴，等.全反式维甲酸激活的人肺腺癌细胞基因的筛选[J].中国肿瘤临床,1999，26(2)：87～90.
, 百拇医药
4，王雪皎，王秀琴，张睿，等.全反式维甲酸激活人肺腺癌细胞系GLC-82中-PIG-B高度同源基因PIGB1[J].癌症,1999，18(6)：631～634.
5，王雪皎，王秀琴，蔡岩，等.维甲酸激活表达的人肺腺癌细胞分化相关基因的筛选[J].自然科学进展,1998，8(6)：759～762.
6，郭明洲，刘霜，王秀琴，等.林县食管癌组织和非食管癌组织差异DNA片段的克隆研究[J].中华预防医学杂志，1998，32(3)：168～170.
7，萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T，著.金东燕，黎孟枫，等译.分子克隆实验指南[M].第二板.北京：科学出版社，1992.
8，Liu G, Wu M, Levi G, Ferrari N. Related Articles Inhibition of cancer cell growth by all-trans retinoic acid and its analog N-(4-hydroxyphenyl) retinamide： a possible mechanism of action via regulation of retinoid receptors expression [J]. Int J Cancer,1998，78(2)：248～254.
, 百拇医药
9，Rothman JE. Mechanisms of intracellular protein transport [J]. Nature,1994,372(6501)：55～63.
10，Lehtonen S, Lehtonen E, Olkkonen VM. Vesicular transport and kidney development [J]. Int J Dev Biol,1999，43：425～433.
11，Ishikawa T, Wright CD, Ishizuka H. GS-X pump is functionally overexpressed in cis-diamminedichloroplatinum (II)-resistant human leukemia HL-60 cells and down-regulated by cell differentiation [J]. J Biol Chem, 1994，269(46)：29085～29093.
收稿日期：2000-01-17;修回日期：2000-03-07, 百拇医药
单位：张睿 王雪皎 王秀琴 周传农 丁芳 郭明洲 刘芝华 吴旻(中国医学科学院中国协和医科大学分子肿瘤学国家重点实验室，北京100021)
关键词：食管肿瘤；细胞分化
癌症000501
【摘要】目的：克隆食管鳞癌细胞EC8712分化过程中受ATRA调控的靶基因。方法：采用AP-PCR技术从食管鳞癌细胞EC8712中克隆受ATRA调控的差异表达基因片段，并测序及作同源分析，采用Northern杂交进行验证。结果：分离到在食管癌细胞分化过程中表达下调的一基因片段。该基因从ATRA处理一天开始表达被明显抑制，这种抑制持续整个诱导过程。该片段被克隆于pGEM-T载体并测序。同源分析结果表明，该基因片段与人N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)基因高度同源(IDENTITY：99%)，为人NSF基因片段。NSF基因在真核细胞囊泡转运系统中发挥着重要作用。结论：参与囊泡转运的NSF基因在食管癌细胞分化过程中发挥着重要作用，NSF表达的抑制是囊泡转运系统转运活性下降的分子机制。
, 百拇医药
中图分类号：R735.1文献标识码：A文章编号：1000-467X(2000)05-0395-04
Esophageal squamous carcinoma cell differentiation-related gene N-ethylmalimide sensitive factor (NSF)
ZHANG Rui, WANG Xue-jiao, WU Min, et al.
(National Laboratory of Molecular Oncology, Department of Cell Biology,Cancer Institutue, PUMC＆ CAMS, Beijing 100021, P.R. China)
【Abstract】 Objective： To clone ATRA-regulated gene in esophageal squamous cancer cell line EC8712. Methods： By using AP-PCR technique, differentially expressed gene fragments (ESTs) were isolated from ATRA-treated EC8712. Cloning, sequencing and homology analysis were carried out to characterize an isolated differentitally expressed gene fragment. Results： The differentially expressed gene fragment was isolated, cloned and sequenced, the gene expression was inhibited during whole ATRA-treatment period, from first day to 9th day. Homology analysis revealed that the fragment derives from human N-ethylmalimide sensitive factor (NSF) gene, which is involed in vesicle transportation, expresses in various tissues, and plays important roles in differentiation of cells. Conclusion： The decrease in activity of cellular vesicle transportation plays important roles in cellular differentiation process. Down-regulation of NSF might contribute to decreased activity of vesicle transportation and differentiation of human cancer cell.
, 百拇医药
Key words： Esophageal neoplasmas; Cell differentiation
维甲类物质可有效地抑制食管癌的发生[1]，同时作为重要的分化诱导剂，已被用于白血病的分化治疗[2]。我室对全反式维甲酸(All-transRetinoicAcid,ATRA)诱导肿瘤细胞分化的分子机制进行了一系列研究，已分离出若干肿瘤分化相关基因[3～5]。分离肿瘤分化相关基因对深入探讨肿瘤细胞分化的分子机制和进行癌症的基因治疗具有重要意义。本工作采用AP-PCR技术分离到一表达受ATRA抑制的基因片段。同源分析表明，该基因片段来自参与细胞内囊泡转运的人N-乙基马来酰亚胺张睿，等.N-乙基马来酰亚胺敏感因子NSF与食管鳞癌细胞分化有关敏感因子(NSF)基因。
1材料和方法
1.1细胞及引物
人食管癌细胞系EC8712，本室建株并传代培养。组织类型为鳞癌，TNM分期为T3N0M0。
, http://www.100md.com
引物AP2：5-GGAAACAGCTATGACCATG-3
1.2全反式维甲酸诱导食管鳞癌细胞
将ATRA溶于含10%DMSO牛血清中，配成10-3mol/L的贮存液。M199培养基含15%小牛血清，正常培养的食管鳞癌细胞EC8712以80万/瓶传代，24小时后，将细胞分为三组，分别加入10-4mol/L的ATRA、1%DMSO或正常培养基。各组细胞均每天换液，在处理1、3、5、7、9天收获细胞，提取总RNA。
1.3逆转录反应
按照Superscript Preamplification System for First Strandc DNA Synthesis(GIBCO/BRL)试剂盒说明书进行。20μl逆转录反应体系中含3μg总RNA，0.5μgoligo(dT)12～18，逆转录反应完成后，采用RNaseH处理。
, http://www.100md.com
1.4AP-PCR反应
按照参考文献[6]进行AP-PCR反应。采用Prep-A-Gene DNA Purification Systems(Bio-Rad)回收差异片段，采用Promega公司的pGEM-Tvectorsystem将PCR产物克隆于pGEM-T载体，按照操作说明操作。
1.5细胞及组织总RNA提取
按照GIBCO公司TRIZOL试剂操作说明提取细胞总RNA，紫外分光光度计定量后，-70℃保存。
1.6Northern杂交
Northern印迹：按照分子克隆实验指南[7]进行。总RNA样品30μg变性后迅速置于冰上冷却，1.2%的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。采用毛细管虹吸法将RNA转移至Zeta-Probe尼龙膜上，转膜液为10×SSC，转膜结束后用GSGeneLinker(Bio-Rad)固定RNA。
, 百拇医药
探针同位素标记：采用Prime-a-GeneLabelingSystem(Promega)标记探针，按操作说明书进行。DNA用量为25ng，同位素α-32P-dCTP用量为50μCi。
杂交：RNA印迹的尼龙膜放入杂交袋，按350μl/cm2膜加入杂交液(1mmol/LEDTA,pH8.0,0.25mmolNa2HPO4，pH7.2，7%SDS)，65℃预杂交30min，弃去杂交液。按照150μl/cm2膜重新加入杂交液，并加入变性的同位素探针，65℃杂交16～20h。1mmol/LEDTA,40mmol/LNa2HPO4,5%SDS,65℃洗膜2次，每次15～30min，1mmol/LEDTA,40mmol/LNa2HPO4,1%SDS,65℃洗膜2次，每次15～30min。放射自显影分析结果。
, http://www.100md.com
2结果
2.1分化诱导过程中差异表达基因的分离、克隆和鉴定
采用AP2引物进行AP-PCR，结果显示(图1)：与对照组相比,ATRA处理后1、3、5、7和9天一基因片段表达明显下降，该基因片段长度约580碱基。
图1 AP-PCR结果差异表达基因片段(箭头)
C：对照组;R：ATRA处理组；D：DMSO处理组。下标数字为处理天数。
M：λDNA/ECOR1+HindIII分子量marker
将差异条带用刀片切出回收DNA，并克隆于GEM-T载体,自动测序仪测序。结果如下：
, http://www.100md.com
cDNA片段序列,589bases
1 ggaaacagctatgaccatgattgagaacagcattttagagattcaatgcc
61 ttgtttcttcaggcaaagagaataccagtcttgtgggagacctttaacca
111 aatacccagtgacttttagtgttagctcaggacagctgtcagaggatctc
161 tggcccacacctcgatttactaagccagatttgcatgtagaaagtctgcc
211 ttctaatcggccaactgttgtcatgcaacattcatgacactgactgagag
, http://www.100md.com 261 ttatcaagggtgatggtgctagtagagaggttgaaacgtgtagtgtccac
311 aagtactggatggttcccacccagagggactgagcaagaaggaatcactt
361 tagcctgcatgggaaggtaagcgcagcattctaaaccaaattgacacctt
411 ccacgagacactaagctatctcagtatgcataaggaagggagttttattg
461 cactaatcatgcagagcgagcacatgttgaaggtagagaacgttccactt
511 agtccagtatcttgagtaagacagtgaagatcctaggccatcctcacctt
, 百拇医药
561 ggtcacttcccatggtcatagctgtttcc
同源比较结果如下：
gb|AF102846.1|AF102846HomosapiensN-ethylmaleimide-sensitivefactor(NSF)mRNA,completecds.
Length=3348 Identities=563/566(99%)
Score=1098bits(554),Expect=0.0 Strand=Plus/Minus
Query：3AAACAGCTATGACCATGATTGAGAACAGCATTTTAGAGATTCAATGCCTTGTTTCTTCAG62
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
, http://www.100md.com
Sbjct：2938AAACATCTCTGACAATGATTGAGAACAGCATTTTAGAGATTCAATGCCTTGTTTCTTCAG2879
Query：63GCAAAGAGAATACCAGTCTTGTGGGAGACCTTTAACCAAATACCCAGTGACTTTTAGTGT122
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2878GCAAAGAGAATACCAGTCTTGTGGGAGACCTTTAACCAAATACCCAGTGACTTTTAGTGT2819
Query：123TAGCTCAGGACAGCTGTCAGAGGATCTCTGGCCCACACCTCGATTTACTAAGCCAGATTT182
, 百拇医药
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2818TAGCTCAGGACAGCTGTCAGAGGATCTCTGGCCCACACCTCGATTTACTAAGCCAGATTT2759
Query：183GCATGTAGAAAGTCTGCCTTCTAATCGGCCAACTGTTGTCATGCAACATTCATGACACTG242
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2758GCATGTAGAAAGTCTGCCTTCTAATCGGCCAACTGTTGTCATGCAACATTCATGACACTG2699
, 百拇医药
Query：243ACTGAGAGTTATCAAGGGTGATGGTGCTAGTAGAGAGGTTGAAACGTGTAGTGTCCACAA302
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2698ACTGAGAGTTATCAAGGGTGATGGTGCTAGTAGAGAGGTTGAAACGTGTAGTGTCCACAA2639
Query：303GTACTGGATGGTTCCCACCCAGAGGGACTGAGCAAGAAGGAATCACTTTAGCCTGCATGG362
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
, http://www.100md.com
Sbjct：2638GTACTGGATGGTTCCCACCCAGAGGGACTGAGCAAGAAGGAATCACTTTAGCCTGCATGG2579
Query：363GAAGGTAAGCGCAGCATTCTAAACCAAATTGACACCTTCCACGAGACACTAAGCTATCTC422
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2578GAAGGTAAGCGCAGCATTCTAAACCAAATTGACACCTTCCACGAGACACTAAGCTATCTC2519
Query：423AGTATGCATAAGGAAGGGAGTTTTATTGCACTAATCATGCAGAGCGAGCACATGTTGAAG482
, 百拇医药
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2518AGTATGCATAAGGAAGGGAGTTTTATTGCACTAATCATGCAGAGCGAGCACATGTTGAAG2459
Query：483GTAGAGAACGTTCCACTTAGTCCAGTATCTTGAGTAAGACAGTGAAGATCCTAGGCCATC542
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2458GTAGAGAACGTTCCACTTAGTCCAGTATCTTGAGTAAGACAGTGAAGATCCTAGGCCATC2399
, 百拇医药
Query：543CTCACCTTGGTCACTTCCCATGGTCA568
||||||||||||||||||||||||||
Sbjct：2398CTCACCTTGGTCACTTCCCATGGTCA2373
图2 NSF表达的Northern杂交分析
C：对照组;D：DMSO处理组；
R：维甲酸处理组。下标数字为处理天数。
a：NSFNorthern杂交。b：RNA上样对照。
结果显示所克隆的差异表达基因片段序列与人N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)基因高度同源(Identities=563/566(99%))，来源于人NSF基因mRNA序列。
, 百拇医药
2.2Northern杂交鉴定ATRA对NSF表达的影响
以同位素标记的人NSF基因片段为探针进行Northern杂交，结果显示(图2)：与对照组相比，ATRA处理后1、3、5、7及9天NSF表达明显下降。该结果与AP-PCR结果一致。
3讨论
我室研究表明，ATRA可抑制肿瘤细胞生长，促使细胞形态向正常上皮细胞方向分化，维甲酸受体所介导的基因表达调控在肿瘤细胞分化过程中发挥着重要作用[3～5，8]。本研究结果表明，人NSF基因的表达从ATRA处理一天开始NSF基因表达被明显抑制，这种抑制持续整个诱导过程。
蛋白质合成后的运输是由细胞内囊泡转运系统完成的,NSF基因发挥着重要作用[9]。囊泡转运系统转运活性的变化不但与正常肾上皮细胞分化有关[10]，而且与HL-60细胞的分化有关，然而其机制尚不清楚[11]。本研究表明，人NSF基因的表达下降是囊泡转运系统转运活性下降的重要机制。囊泡转运系统转运活性下降在食管癌细胞分化过程中发挥重要作用。
, http://www.100md.com
基金项目：本课题受国家攀登计划项目(G1998051205)和“八六三”课题资助项目(Z19-01-01-02)资助
[参考文献]
1，蔡海英，林培中，管建新，等.维甲酸对小鼠前胃鳞状上皮增生与癌变的影响[J].肿瘤防治研究,1978，4：12～18.
2，Huang ME, Ye YC, Chen SR, et al. Use of all-trans retinoic acid in the treatment facute promyelocytic leukemia [J]. Blood,1988，72：567～572.
3，王雪皎，张睿，王秀琴，等.全反式维甲酸激活的人肺腺癌细胞基因的筛选[J].中国肿瘤临床,1999，26(2)：87～90.
, 百拇医药
4，王雪皎，王秀琴，张睿，等.全反式维甲酸激活人肺腺癌细胞系GLC-82中-PIG-B高度同源基因PIGB1[J].癌症,1999，18(6)：631～634.
5，王雪皎，王秀琴，蔡岩，等.维甲酸激活表达的人肺腺癌细胞分化相关基因的筛选[J].自然科学进展,1998，8(6)：759～762.
6，郭明洲，刘霜，王秀琴，等.林县食管癌组织和非食管癌组织差异DNA片段的克隆研究[J].中华预防医学杂志，1998，32(3)：168～170.
7，萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T，著.金东燕，黎孟枫，等译.分子克隆实验指南[M].第二板.北京：科学出版社，1992.
8，Liu G, Wu M, Levi G, Ferrari N. Related Articles Inhibition of cancer cell growth by all-trans retinoic acid and its analog N-(4-hydroxyphenyl) retinamide： a possible mechanism of action via regulation of retinoid receptors expression [J]. Int J Cancer,1998，78(2)：248～254.
, 百拇医药
9，Rothman JE. Mechanisms of intracellular protein transport [J]. Nature,1994,372(6501)：55～63.
10，Lehtonen S, Lehtonen E, Olkkonen VM. Vesicular transport and kidney development [J]. Int J Dev Biol,1999，43：425～433.
11，Ishikawa T, Wright CD, Ishizuka H. GS-X pump is functionally overexpressed in cis-diamminedichloroplatinum (II)-resistant human leukemia HL-60 cells and down-regulated by cell differentiation [J]. J Biol Chem, 1994，269(46)：29085～29093.
收稿日期：2000-01-17;修回日期：2000-03-07, 百拇医药