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您的位置:首页>>动态>>医学进展 中国血液流变学杂志2000年第10卷第1期
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兔腹主动脉狭窄后局部内皮通透性和细胞形态的变化
舒强 金鑫 凌光烈
摘 要:目的:了解血液动力学改变后内皮通透性,内皮细胞形态变化和三者之间的关系。方法:正常及高脂血症兔腹主动脉狭窄致平均60.7%,依万斯蓝和苏丹Ⅳ对动脉染色,在扫描电镜下观察内皮形态,计算形态指数。结果:未狭窄动脉依万斯蓝和苏丹Ⅳ染色阴性。紧接狭窄近、远侧各有1毫米的固定环行染色阳性区域,距狭窄8毫米远侧区域有散在点状染色,在阳性区,狭窄近侧内皮细胞呈长纺锤形,细胞形态指数小于正常,远侧内皮细胞近似圆形,形态指数最大(p<0.01)。结论:剪切力变化(高或者低)能导致内皮通透性增高和内皮细胞形态(SI)改变,三者有内在关系。
关键词:内皮细胞 通透性 脂质沉积 剪切力
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动脉粥样硬化的发生部位绝大部分发生于动脉的分叉部和弯曲部[1]。因此,该动脉壁与其它部位相比受到血液动力学因素的影响更加明显,作为血液动力学因子的血压、剪切力等中、剪切力对动脉壁的影响愈加受到人们的重视[2]。动脉内皮通透性的增高,脂质沉积于动脉壁内是早期动脉硬化发生的重要因素[3]。在动脉硬化发生机制中有低剪切力和高剪切力发生学说[4]。本实验通过手术缩窄兔腹主动脉,使血液动力学改变,造成狭窄近侧高剪切力区域和狭窄远侧低剪切力区域,来研究两种不同剪切力对动脉内皮细胞形态和大分子物质通透性的影响。
1 材料和方法
1.1 腹主动脉狭窄术 选用日本大耳白兔(体重约2.5公斤,雄性),饲以普通固体或高脂肪食(100克/只/日,含1%胆固醇,5%猪油),分为两组一组饲以普通食物,另一组饲以高高肪食(表1),麻醉后,在无菌条件下开腹,用1号丝线在左肾动脉下5厘米处(无血管分支)绕腹主动脉3周将其缩至60.7%,关腹。屠杀前6小时禁食,耳静脉采血,用COD,DACOS法测定血清胆固醇值。
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表1 实验组、动物数,血清胆固醇值
组
高脂肪食天数
胆固醇值
狭窄天数
动物数
A1
73.0
0
5
A2
40.7
3
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3
A3
74.7
7
4
A4
50.5
14
3
B1
14
1539.8
0
3
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B2
10
1923.4
3
3
B3
14
1322.3
7
3
B4
21
2102.7
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3
1.2 狭窄度测定 狭窄术后,用肝素化0.1M磷酸盐缓冲液(PB)(pH7.4,室温),在距离5厘米的近段插管(110mmHg)冲洗动脉内血液,然后用2.5%戊二醛(溶于PB)灌流固定60分钟,之后,用5%明胶水溶液(40℃)灌注铸型,动脉摘除后,将明胶铸型取出,分别在距狭窄近段5毫米和狭窄处横断,测其直径,用计算公式=[1-(d/D)]2×%(d和D分别是狭窄部和近段5毫米的直径)测其狭窄度。动物数为10只。
1.3 肉眼观察 将2%依万斯蓝(溶于生理盐水),以2.5ml/Kg体重静脉注射,30分钟后用0.01M磷酸生理盐水缓冲液(PBS,pH7.4)在生理压力下心脏穿刺灌流冲洗,2.5%戊二醛(溶于0.1M磷酸缓冲液)灌流固定2小时,将动脉移出,纵行剖开;饲以高脂肪食的动物的动脉用苏丹Ⅳ染色。观察动脉的蓝色和红色染区。
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1.4 扫描电镜 首先,100毫升Hepes缓冲液将血管内血液冲洗净,然后,以0.25%硝酸银水溶液灌流30秒,然后再用100毫升Hepes缓冲液冲洗血管腔,紧接用2.5%戊二醛(溶于0.1M磷酸缓冲液)灌流固定2小时,将动脉移出,修剪,纵行剖开;被依万斯蓝或苏丹Ⅳ所染阳性和阴性区域的交接部用注射针尖画痕作标记,标本梯度酒精脱水,临界点干燥,喷金。在JSM-T220扫描电镜(日本电子)下观察。
1.5 细胞形态指数(shape index,SI) 对狭窄部近、远各5毫米的蓝染或红染区内皮进行非重叠摄影(700倍),每幅照片含20-30个细胞。照片的细胞借助扫描仪输入计算机内,细胞的面积和周长借助软件NIH image5.0求得。细胞指数=4π×面积/周长2。
1.6 统计学分析 数据为均数±标准差,组间用StatView 4.0软件行t检验。
2 结果
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2.1 大体观察 腹主动脉狭窄度为60.7±7%。A1不和B1组未见依万斯蓝和苏丹Ⅳ染色阳性区域。A2~4组和B2~4组血管在狭窄区可见明显被染阳性区域,狭窄近、远侧紧接狭窄各有1毫米的固定环行染色阳性区域,距狭窄5毫米的近侧区域和8毫米远侧区域内有散在点片状染色,B2~4组的染色区域与A2~4组相似,蓝染程度强于A2~4组。
饲以高脂肪食14日的非狭窄组(B1组),未见染色阳性区域。狭窄组术后3日即可见距紧贴狭窄近、远段1毫米环行带状强染区域,狭窄部未见脂质沉积。距狭窄远侧8毫米和到近侧5毫米可见散在点片状脂质沉积,沉积区域的范围和强度较近侧更为明显。依万斯蓝染区和苏丹Ⅳ染色阳性区域相同。
2.2 扫描电镜观察 A1组:肾动脉以下的腹主动脉的内皮细胞SI为0.24±0.05,内皮细胞的长轴与血管平行。
A2~4组:紧邻狭窄近侧1毫米区域内皮细胞呈长纺锤形。紧邻狭窄远侧部位细胞变为近似圆形,这种倾向一直致狭窄远侧8毫米。狭窄近侧段,蓝染区域的内皮细胞的SI比相同段白色区域的小(p<0.05),狭窄远侧则相反((p<0.05)(表2)。
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表2 普通食兔腹主动脉狭窄后的内皮细胞形态指数(SI) (X±s)
天
近段白区(n)
远段白区(n)
近段蓝区(n)
远段蓝区(n)
3
0.22±0.08(231)
0.35±0.10(199)
0.20±0.05(201)▲★
0.34±0.20(187)★
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7
0.22±0.05(221)
0.28±0.04(201)
0.19±0.04(178)▲★
0.40±0.12(191)★
14
0.21±0.03(219)
0.29±0.09(199)
0.20±0.04(168)▲★
0.51±0.19(183)★
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普通食兔非狭窄腹主动脉的内皮形态指数:0.24±0.05(298),n:内皮细胞数,与相同段白区SI比★p<0.05,与远段蓝区SI比▲p<0.01,表内均值与非狭窄腹主动脉的内皮SI比p<0.05
B1组:肾动脉下腹主动脉的内皮细胞的横径稍有增加,SI为0.28±0.06,与普通食物组的有差别(p<0.05)。
B2~4组:SI与A组相比有增大的倾向,狭窄部则相同,狭窄近侧段,苏丹Ⅳ染色阳性区域的内皮细胞的SI比相同段白色区域的小(p<0.05),狭窄远侧,苏丹Ⅳ染色阳性区域的内皮细胞的SI比相同段白色区域的大(p<0.05)(表3)(图)。在远侧段,依苏丹Ⅳ染色阴性,弱阳性,强阳性顺序,SI逐渐增大。
表3 高脂肪食兔腹主动脉狭窄后的内皮细胞形态指数(SI) (X±s)
, 百拇医药 天
近段白区(n)
远段白区(n)
近段蓝区(n)
远段蓝区(n)
3
0.23±0.08(241)
0.35±0.10(271)
0.20±0.04(187)▲★
0.43±0.10(191)★
7
, 百拇医药 0.22±0.04(275)
0.31±0.09(276)
0.21±0.07(193)▲★
0.51±0.11(184)★
14
0.24±0.05(221)
0.34±0.09(278)
0.21±0.10(181)▲★
0.53±0.12(197)★
高脂肪食兔非狭窄腹主动脉的内皮形态指数:0.28±0.06(287),n:内皮细胞数,与相同段白区SI比★p<0.05,与远段红区SI比▲p<0.01,表内均值与非狭窄腹主动脉的内皮SI比p<0.05
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图 高脂肪食10日狭窄后3日,内皮细胞银染后的扫描电镜图像,A.据狭窄1毫米范围内近段脂质沉着区;B.狭窄部;
C.据狭窄1毫米范围内远段脂质沉着区;D.据狭窄5毫米的远段。箭头为血流方向。
在各组,狭窄远段的染色阳性和阴性区内皮细胞的SI分别比近段染色阳性和阴性区的SI大(p<0.01)。
3 讨论
本实验通过用平均缩窄60.7%的兔腹主动脉狭窄模型,来研究在血液动力学改变后内皮通透性的变化,在本实验中未狭窄的正常和高脂血症兔的腹主动脉未见依万斯蓝染区或苏丹Ⅳ阳性区域,而狭窄的腹主动脉3天开始即可见在狭窄近侧和远侧可见依万斯蓝染区或苏丹Ⅳ阳性区域,证明血流改变对内皮细胞大分子物质白蛋白和脂质的影响。血液动力学的刺激有血管壁受到的压力和内皮受到的剪切力,从白蛋白和脂质的沉积的局部分布特点来看,在狭窄远侧,沉积部位范围较广,而近侧的沉积区域主要在紧接狭窄部。本实验显示狭窄远侧血管的腹侧阳性区域明显较背侧大,而从筑形标本和血液流变学分析,我们发现,由于血管腹侧无组织结构的压迫,曲度明显大于受脊柱的限制背侧,涡流更加明显。加之,狭窄近侧的血压大远侧。我们推论内皮对大分子物质如白蛋白,脂蛋白通透性的增加与局部的剪切力有明显的关系。
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狭窄的的近侧血流为层流,内皮受到几乎一致方向的高剪切力作用,内皮细胞成长纺锤形,SI小于正常值,而狭窄远段血流呈涡流、返流、分流和停滞,内皮细胞受到低剪切力的作用,内皮细胞呈近似圆形。本实验观察到的不同部位内皮细胞形态(SI)、排列方向和相对应部位的剪切力值反映出细胞形态和剪切力的密切关系。这为根据动物和人的局部内皮形态(SI)推测相应部位的剪切力相对大小提供有力参考[5]。
狭窄近侧部的长纺锤形内皮以及远侧部近似圆形内皮处均有较强的脂质沉积。这揭示血液剪切力和脂质沉着之间的因果关系。人的粥状硬化一般好发于低剪切力区域已经被确认[7]。在本实验腹主动脉狭窄模型中,狭窄远侧的低剪切力区域有明显的脂质沉着,这是本实验所期待的结果。然而狭窄近侧高剪切力区域也见脂质沉积,这可能是内皮受到超过生理状态的高剪切力的作用所致。在狭窄部位未发现有内皮剥离。因此,大分子物质的沉积与内皮通透性增高有关,而内皮通透性增高是由于内皮细胞被激活所致[8]。在我们的实验中发现内皮细胞通透性增高区域DNA合成和IL-1表达阳性细胞明显增多,而正常未狭窄区域的内皮细胞为阴性。
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以上结果揭示大分子物质,如白蛋白,脂质(脂蛋白)沉积与狭窄远段的低剪切力和近段的非生理的高剪切力有明显关系。
作者单位:舒强(中国医科大学附属第一医院外科局解教研室 (沈阳110001))
金鑫(中国医科大学附属第一医院外科局解教研室 (沈阳110001))
凌光烈(中国医科大学附属第一医院外科局解教研室 (沈阳110001))
参考文献:
[1]Glagov S,Zarins C,Giddens DP,et al.Hemodynamics and atherosclerosis.Insights and perspectives gained from studies of arteries.Arch Pathol Lab Med,1988,112:1018-1031.
, 百拇医药
[2]Okano M,Yoshida Y.Endothelial cell morphometry of atherosclerotic lesions and flow profiles at aortic bifurcations in cholesteral-fed rabbits.J Biomech Eng,1992,114:301-308.
[3]Ishikawa Y.Ishii T.Asuwa N.Masuda S.Absence of atherosclerosis evolution in the coronary arterial segment covered by myocardial tissue in cholesterol-fed rabbits.Virchows Archiv,1997,430:163-71.
[4]Asakura T,Karino T.Flow patterns and spatial distribution of atherosclerotic lesions in buman coronary arteries.Circ Res,1990,66:1045-1066.
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[5]Houle S,Roach MR.Flow studies in a rigid model of an aortarenal junction.A case for high shear as a cause of the localiation of sudanophilic lesions in rabbits.Atherosclerosis,1981,40:231-244.
[6]Lei M.Kleeinstreuer C.Truskey GA.A focal stress gradientdependent mass transfer mechanism for atherogenesis in branching arteries.Med Eng Phys.1996,18(4):326-32.
[7]Friedman MH,Deters OJ,Bargeron CB,et al:Shear-dependent thickening of the human arterial intima.Atherosclerosis,1986,60:161-171.
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[8]Lum H,Malik AB.Regulation of vascular endothelial barrier function.Am J Physiol,1994,11:L223-241.
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兔腹主动脉狭窄后局部内皮通透性和细胞形态的变化
舒强 金鑫 凌光烈
摘 要:目的:了解血液动力学改变后内皮通透性,内皮细胞形态变化和三者之间的关系。方法:正常及高脂血症兔腹主动脉狭窄致平均60.7%,依万斯蓝和苏丹Ⅳ对动脉染色,在扫描电镜下观察内皮形态,计算形态指数。结果:未狭窄动脉依万斯蓝和苏丹Ⅳ染色阴性。紧接狭窄近、远侧各有1毫米的固定环行染色阳性区域,距狭窄8毫米远侧区域有散在点状染色,在阳性区,狭窄近侧内皮细胞呈长纺锤形,细胞形态指数小于正常,远侧内皮细胞近似圆形,形态指数最大(p<0.01)。结论:剪切力变化(高或者低)能导致内皮通透性增高和内皮细胞形态(SI)改变,三者有内在关系。
关键词:内皮细胞 通透性 脂质沉积 剪切力
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动脉粥样硬化的发生部位绝大部分发生于动脉的分叉部和弯曲部[1]。因此,该动脉壁与其它部位相比受到血液动力学因素的影响更加明显,作为血液动力学因子的血压、剪切力等中、剪切力对动脉壁的影响愈加受到人们的重视[2]。动脉内皮通透性的增高,脂质沉积于动脉壁内是早期动脉硬化发生的重要因素[3]。在动脉硬化发生机制中有低剪切力和高剪切力发生学说[4]。本实验通过手术缩窄兔腹主动脉,使血液动力学改变,造成狭窄近侧高剪切力区域和狭窄远侧低剪切力区域,来研究两种不同剪切力对动脉内皮细胞形态和大分子物质通透性的影响。
1 材料和方法
1.1 腹主动脉狭窄术 选用日本大耳白兔(体重约2.5公斤,雄性),饲以普通固体或高脂肪食(100克/只/日,含1%胆固醇,5%猪油),分为两组一组饲以普通食物,另一组饲以高高肪食(表1),麻醉后,在无菌条件下开腹,用1号丝线在左肾动脉下5厘米处(无血管分支)绕腹主动脉3周将其缩至60.7%,关腹。屠杀前6小时禁食,耳静脉采血,用COD,DACOS法测定血清胆固醇值。
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表1 实验组、动物数,血清胆固醇值
组
高脂肪食天数
胆固醇值
狭窄天数
动物数
A1
73.0
0
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A2
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A3
74.7
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A4
50.5
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3
B1
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1539.8
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B2
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1923.4
3
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1322.3
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1.2 狭窄度测定 狭窄术后,用肝素化0.1M磷酸盐缓冲液(PB)(pH7.4,室温),在距离5厘米的近段插管(110mmHg)冲洗动脉内血液,然后用2.5%戊二醛(溶于PB)灌流固定60分钟,之后,用5%明胶水溶液(40℃)灌注铸型,动脉摘除后,将明胶铸型取出,分别在距狭窄近段5毫米和狭窄处横断,测其直径,用计算公式=[1-(d/D)]2×%(d和D分别是狭窄部和近段5毫米的直径)测其狭窄度。动物数为10只。
1.3 肉眼观察 将2%依万斯蓝(溶于生理盐水),以2.5ml/Kg体重静脉注射,30分钟后用0.01M磷酸生理盐水缓冲液(PBS,pH7.4)在生理压力下心脏穿刺灌流冲洗,2.5%戊二醛(溶于0.1M磷酸缓冲液)灌流固定2小时,将动脉移出,纵行剖开;饲以高脂肪食的动物的动脉用苏丹Ⅳ染色。观察动脉的蓝色和红色染区。
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1.4 扫描电镜 首先,100毫升Hepes缓冲液将血管内血液冲洗净,然后,以0.25%硝酸银水溶液灌流30秒,然后再用100毫升Hepes缓冲液冲洗血管腔,紧接用2.5%戊二醛(溶于0.1M磷酸缓冲液)灌流固定2小时,将动脉移出,修剪,纵行剖开;被依万斯蓝或苏丹Ⅳ所染阳性和阴性区域的交接部用注射针尖画痕作标记,标本梯度酒精脱水,临界点干燥,喷金。在JSM-T220扫描电镜(日本电子)下观察。
1.5 细胞形态指数(shape index,SI) 对狭窄部近、远各5毫米的蓝染或红染区内皮进行非重叠摄影(700倍),每幅照片含20-30个细胞。照片的细胞借助扫描仪输入计算机内,细胞的面积和周长借助软件NIH image5.0求得。细胞指数=4π×面积/周长2。
1.6 统计学分析 数据为均数±标准差,组间用StatView 4.0软件行t检验。
2 结果
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2.1 大体观察 腹主动脉狭窄度为60.7±7%。A1不和B1组未见依万斯蓝和苏丹Ⅳ染色阳性区域。A2~4组和B2~4组血管在狭窄区可见明显被染阳性区域,狭窄近、远侧紧接狭窄各有1毫米的固定环行染色阳性区域,距狭窄5毫米的近侧区域和8毫米远侧区域内有散在点片状染色,B2~4组的染色区域与A2~4组相似,蓝染程度强于A2~4组。
饲以高脂肪食14日的非狭窄组(B1组),未见染色阳性区域。狭窄组术后3日即可见距紧贴狭窄近、远段1毫米环行带状强染区域,狭窄部未见脂质沉积。距狭窄远侧8毫米和到近侧5毫米可见散在点片状脂质沉积,沉积区域的范围和强度较近侧更为明显。依万斯蓝染区和苏丹Ⅳ染色阳性区域相同。
2.2 扫描电镜观察 A1组:肾动脉以下的腹主动脉的内皮细胞SI为0.24±0.05,内皮细胞的长轴与血管平行。
A2~4组:紧邻狭窄近侧1毫米区域内皮细胞呈长纺锤形。紧邻狭窄远侧部位细胞变为近似圆形,这种倾向一直致狭窄远侧8毫米。狭窄近侧段,蓝染区域的内皮细胞的SI比相同段白色区域的小(p<0.05),狭窄远侧则相反((p<0.05)(表2)。
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表2 普通食兔腹主动脉狭窄后的内皮细胞形态指数(SI) (X±s)
天
近段白区(n)
远段白区(n)
近段蓝区(n)
远段蓝区(n)
3
0.22±0.08(231)
0.35±0.10(199)
0.20±0.05(201)▲★
0.34±0.20(187)★
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0.22±0.05(221)
0.28±0.04(201)
0.19±0.04(178)▲★
0.40±0.12(191)★
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0.21±0.03(219)
0.29±0.09(199)
0.20±0.04(168)▲★
0.51±0.19(183)★
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普通食兔非狭窄腹主动脉的内皮形态指数:0.24±0.05(298),n:内皮细胞数,与相同段白区SI比★p<0.05,与远段蓝区SI比▲p<0.01,表内均值与非狭窄腹主动脉的内皮SI比p<0.05
B1组:肾动脉下腹主动脉的内皮细胞的横径稍有增加,SI为0.28±0.06,与普通食物组的有差别(p<0.05)。
B2~4组:SI与A组相比有增大的倾向,狭窄部则相同,狭窄近侧段,苏丹Ⅳ染色阳性区域的内皮细胞的SI比相同段白色区域的小(p<0.05),狭窄远侧,苏丹Ⅳ染色阳性区域的内皮细胞的SI比相同段白色区域的大(p<0.05)(表3)(图)。在远侧段,依苏丹Ⅳ染色阴性,弱阳性,强阳性顺序,SI逐渐增大。
表3 高脂肪食兔腹主动脉狭窄后的内皮细胞形态指数(SI) (X±s)
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近段白区(n)
远段白区(n)
近段蓝区(n)
远段蓝区(n)
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0.23±0.08(241)
0.35±0.10(271)
0.20±0.04(187)▲★
0.43±0.10(191)★
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0.21±0.10(181)▲★
0.53±0.12(197)★
高脂肪食兔非狭窄腹主动脉的内皮形态指数:0.28±0.06(287),n:内皮细胞数,与相同段白区SI比★p<0.05,与远段红区SI比▲p<0.01,表内均值与非狭窄腹主动脉的内皮SI比p<0.05
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图 高脂肪食10日狭窄后3日,内皮细胞银染后的扫描电镜图像,A.据狭窄1毫米范围内近段脂质沉着区;B.狭窄部;
C.据狭窄1毫米范围内远段脂质沉着区;D.据狭窄5毫米的远段。箭头为血流方向。
在各组,狭窄远段的染色阳性和阴性区内皮细胞的SI分别比近段染色阳性和阴性区的SI大(p<0.01)。
3 讨论
本实验通过用平均缩窄60.7%的兔腹主动脉狭窄模型,来研究在血液动力学改变后内皮通透性的变化,在本实验中未狭窄的正常和高脂血症兔的腹主动脉未见依万斯蓝染区或苏丹Ⅳ阳性区域,而狭窄的腹主动脉3天开始即可见在狭窄近侧和远侧可见依万斯蓝染区或苏丹Ⅳ阳性区域,证明血流改变对内皮细胞大分子物质白蛋白和脂质的影响。血液动力学的刺激有血管壁受到的压力和内皮受到的剪切力,从白蛋白和脂质的沉积的局部分布特点来看,在狭窄远侧,沉积部位范围较广,而近侧的沉积区域主要在紧接狭窄部。本实验显示狭窄远侧血管的腹侧阳性区域明显较背侧大,而从筑形标本和血液流变学分析,我们发现,由于血管腹侧无组织结构的压迫,曲度明显大于受脊柱的限制背侧,涡流更加明显。加之,狭窄近侧的血压大远侧。我们推论内皮对大分子物质如白蛋白,脂蛋白通透性的增加与局部的剪切力有明显的关系。
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狭窄的的近侧血流为层流,内皮受到几乎一致方向的高剪切力作用,内皮细胞成长纺锤形,SI小于正常值,而狭窄远段血流呈涡流、返流、分流和停滞,内皮细胞受到低剪切力的作用,内皮细胞呈近似圆形。本实验观察到的不同部位内皮细胞形态(SI)、排列方向和相对应部位的剪切力值反映出细胞形态和剪切力的密切关系。这为根据动物和人的局部内皮形态(SI)推测相应部位的剪切力相对大小提供有力参考[5]。
狭窄近侧部的长纺锤形内皮以及远侧部近似圆形内皮处均有较强的脂质沉积。这揭示血液剪切力和脂质沉着之间的因果关系。人的粥状硬化一般好发于低剪切力区域已经被确认[7]。在本实验腹主动脉狭窄模型中,狭窄远侧的低剪切力区域有明显的脂质沉着,这是本实验所期待的结果。然而狭窄近侧高剪切力区域也见脂质沉积,这可能是内皮受到超过生理状态的高剪切力的作用所致。在狭窄部位未发现有内皮剥离。因此,大分子物质的沉积与内皮通透性增高有关,而内皮通透性增高是由于内皮细胞被激活所致[8]。在我们的实验中发现内皮细胞通透性增高区域DNA合成和IL-1表达阳性细胞明显增多,而正常未狭窄区域的内皮细胞为阴性。
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以上结果揭示大分子物质,如白蛋白,脂质(脂蛋白)沉积与狭窄远段的低剪切力和近段的非生理的高剪切力有明显关系。
作者单位:舒强(中国医科大学附属第一医院外科局解教研室 (沈阳110001))
金鑫(中国医科大学附属第一医院外科局解教研室 (沈阳110001))
凌光烈(中国医科大学附属第一医院外科局解教研室 (沈阳110001))
参考文献:
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