地高辛标记探针原位杂交检测肝外组织中经血传播病毒DNA
作者：赵有为 许家璋 杨志国 朗振为 闫惠平 黄祖瑚
单位：赵有为(211900仪征，南京医科大学第三附属医院)；许家璋 杨志国(解放军第81医院)；朗振为 闫惠平(北京佑安医院)；黄祖瑚(南京医科大学第一附属医院)
关键词：核酸杂交；经血传播病毒
江苏医药000605 【摘要】 目的 探讨血清单一经血传播病毒(TTV)阳性患者肝外组织中TTVDNA的表达。方法 采用地高辛标记TTVDNA探针原位杂交技术检测免疫组织化学检测肝组织中丙肝病毒NS3、庚肝病毒NS5等为阴性的5例尸检肝外组织标本。结果 3例(3/3)胰腺组织、2例(2/2)睾丸组织、1例(1/1)卵巢组织、2例(2/3)心肌组织、3例(3/5)肾组织检出阳性信号。杂交阳性信号主要为胞核型，仅在部分胰腺组织中出现胞浆型。阳性细胞呈散在分布。结论 TTV具有组织泛嗜性。
, 百拇医药
Preparation of digoxignin labelled probe and detection of transfusion transmitted virus in extrahepatic tissue with in situ hybridization
ZHAO Youwei XU Jiazhang YANG Zhiguo
(The Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Yizhen 211900)
【Abstract】 Objective To study the existence of TTV (transfusion transmitted virus)in extrahepatic tissue of patients with non A-G hepatitis.Methods Five specimens of formalin-paraffin-embedded extrahepatic tissue of the patients with non A-G hepatitis were studied by in situ hybridization with Dig-TTV DNA probe.Results Positive hybridization signals to TTV nuclei acid were observed in pancreatic islet cells，testicular spermatogenic cells，ovarian alveoli cells，myocardial cells and renal tubule epithelial cells.Conclusion The result shows that TTV is not stringently hepatotropic.
, 百拇医药
【Key words】 Nucleic acid hybridization Transfusion transmitted virus
研究发现[1，2]，经血传播病毒(TTV)并非专一嗜肝病毒，在外周血淋巴细胞、单核细胞内检出TTVDNA。因此，为研究TTV肝外组织嗜性，我们采用地高辛标记TTVDNA探针(Dig-TTVDNA)，检测5例血清单一TTVDNA阳性患者尸解标本。
资料与方法
一、对象：选取1995年～1999年期间保存的5例因肝病死亡患者尸解组织标本，包括肝脏、肾脏、胰腺、心脏、睾丸或卵巢组织。血清学检测排除HAV、HBV、HCV、HEV、HGV感染，均为单一TTVDNA阳性。其中男性4例，女性1例，平均年龄34.5±11.2岁。每例组织标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，HE染色，肝组织免疫组织化学检测HBsAg、HBcAg、HCVNS3、HGVNS5。
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二、TTVDNA探针制备：探针采用PCR法标记。引物是P1∶5′-ACAGACAGAGGA GAAGGC-3′，P2∶5′-AACAGGCACATTACTACT-3′。用Dig-d-UTP标记，标记位置在TTVDNAORF1区段内，基本步骤参考文献[3]，取扩增产物，与不同标准化浓度DNA共同加样于2%琼脂糖凝胶中电泳，在紫外灯下进行粗略定量，标记条带单一，探针浓度约为1 mg/L。
三、TTVDNA原位杂交特异性及探针最适工作浓度检测：空白对照以预杂液替代Dig-TTVDNA探针对TTVDNA阳性肝组织切片进行杂交；以地高辛标记试剂盒(德国Boehringer Mannheim)提供对照探针替代Dig-TTVDNA；斑点杂交法验证原位杂交阳性结果；以预杂交液对探针作1∶50、1∶100、1∶200稀释，用不同浓度的探针进行原位杂交实验。
四、杂交阳性信号判定：原发杂交阳性信号为蓝紫色，呈细颗粒状。
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结 果
一、TTVDNA原位杂交特异性：使用三种不同稀释浓度的探针进行杂交，以1∶100稀释浓度杂交效果最好，1∶50、1∶200稀释浓度均难以获得稳定效果。空白对照杂交结果均为阴性，斑点杂交和原位杂交结果符合率为100%。
二、肝外组织中TTVDNA检出情况见表1：5例肝组织免疫组织化学检测均为阴性。其中例2为女性，取卵巢组织作原位杂交试验。3例(3/3)胰腺组织、2例(2/2)睾丸组织、1例(1/1)卵巢组织、2例(2/3)心肌组织、3例(3/5)肾组织检出阳性信号。
表1 肝外组织TTVDNA杂交结果 编号
血清PCR
肾脏
胰腺
, http://www.100md.com
心肌
睾丸/卵巢
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注：“+”阳性、“-”阴性、“/”未检
三、TTV基因的表达和分布：TTVDNA阳性杂交信号可见于胰腺腺泡细胞、睾丸生精细胞、卵巢细胞、心肌实质细胞、肾小球实质和间质细胞、肾小管上皮细胞等。阳性信号主要为胞核型，仅在部分胰腺组织中出现胞浆型。阳性细胞呈散在分布。
讨 论
研究发现[4，5]，TTV是一种单链无包膜DNA病毒，肝组织内病毒滴度大于血清水平10～100倍，血清中单一TTVDNA阳性患者病毒滴度与ALT水平存在一定平行关系，说明TTV可能是一种嗜肝病毒。近来又有报道，在外周血淋巴细胞、单核细胞内检出TTVDNA，提示TTV并非专一嗜肝病毒。据此，我们采用原位杂交技术，检测部分肝外重要脏器中TTV感染情况。
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原位杂交是一项分子病理学技术，定位性强，可作为血清学指标的佐证和补充。本次实验标记探针条带单一，探针工作浓度适宜，空白对照均为阴性，斑点杂交符合率100%，具有较好的灵敏度和特异度，实验重复性好，结果可靠。在肾小球实质细胞、肾小管上皮细胞、心肌实质细胞、睾丸生精细胞、卵巢细胞、胰腺腺泡细胞中均出现阳性杂交信号，证明TTV具有组织泛嗜性。其中3例胰腺组织，2例睾丸组织，1例卵巢组织均检出TTVDNA，5例肾组织中有2例，3例心肌组织中有1例杂交阴性，可能是由于(1)该组织中TTVDNA滴度相对偏低，未检出；(2)标本保存时间较长，部分组织标本中完整病毒模板被破坏；(3)TTV对不同个体组织亲嗜性存在差异等。杂交阳性信号主要为胞核型，仅在部分胰腺组织中出现胞浆型，阳性细胞呈散在分布，这与TTV在肝细胞内的分布特征基本相符[6]。
TTV的泛嗜性具有一定意义，如在生殖细胞内发现TTVDNA，提示TTV可能会通过垂直传播，也可能通过性接触传播给性伴侣。TTV泛嗜性对其致病性的意义，尚难明确。5例尸检肝外组织标本常规HE染色，未发现明显组织学损伤。
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本课题为江苏省自然科学基金资助项目(BK99154)
参考文献
1，Hasebe C，Kawashima T，Kohgo Y，et al.Histological findings of TTV-positive non-B non-C chronic hepatitis patients.Nippon Rinsho，1999，57：1350-1355.
2，Okamura A，Yoshioka M，Kubota H，et al.Detection of a novel DNA virus(TTV) sequence in peripheral blood mononuclear cells.J Med Virol，1999，58：174-177.
3，黄德庄，闫惠平，郎振为，等.地高辛标记探针原位杂交检测肝组织中丙型肝炎病毒RNA.中华实验和临床病毒学杂志，1996，10：262-266.
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4，Nishizawa T，Okamoto H，Konishi K，et al.A novel DNA virus(TTV)associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Biochem Biophys Res Commun，1997，24：92～97.
5，Okamoto H，Nishizawa T，Kato N，et al.Molecular Cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Hepatol Res，1998，10：1-16.
6，许德军，郎振为，王国玉，等.非甲-非庚型肝炎肝组织中经输血传播病毒DNA的原位检测.中华肝脏病杂志，1999，2：96-97.
(收稿：1999-09-28 修回：2000-01-05), 百拇医药
单位：赵有为(211900仪征，南京医科大学第三附属医院)；许家璋 杨志国(解放军第81医院)；朗振为 闫惠平(北京佑安医院)；黄祖瑚(南京医科大学第一附属医院)
关键词：核酸杂交；经血传播病毒
江苏医药000605 【摘要】 目的 探讨血清单一经血传播病毒(TTV)阳性患者肝外组织中TTVDNA的表达。方法 采用地高辛标记TTVDNA探针原位杂交技术检测免疫组织化学检测肝组织中丙肝病毒NS3、庚肝病毒NS5等为阴性的5例尸检肝外组织标本。结果 3例(3/3)胰腺组织、2例(2/2)睾丸组织、1例(1/1)卵巢组织、2例(2/3)心肌组织、3例(3/5)肾组织检出阳性信号。杂交阳性信号主要为胞核型，仅在部分胰腺组织中出现胞浆型。阳性细胞呈散在分布。结论 TTV具有组织泛嗜性。
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ZHAO Youwei XU Jiazhang YANG Zhiguo
(The Third Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Yizhen 211900)
【Abstract】 Objective To study the existence of TTV (transfusion transmitted virus)in extrahepatic tissue of patients with non A-G hepatitis.Methods Five specimens of formalin-paraffin-embedded extrahepatic tissue of the patients with non A-G hepatitis were studied by in situ hybridization with Dig-TTV DNA probe.Results Positive hybridization signals to TTV nuclei acid were observed in pancreatic islet cells，testicular spermatogenic cells，ovarian alveoli cells，myocardial cells and renal tubule epithelial cells.Conclusion The result shows that TTV is not stringently hepatotropic.
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【Key words】 Nucleic acid hybridization Transfusion transmitted virus
研究发现[1，2]，经血传播病毒(TTV)并非专一嗜肝病毒，在外周血淋巴细胞、单核细胞内检出TTVDNA。因此，为研究TTV肝外组织嗜性，我们采用地高辛标记TTVDNA探针(Dig-TTVDNA)，检测5例血清单一TTVDNA阳性患者尸解标本。
资料与方法
一、对象：选取1995年～1999年期间保存的5例因肝病死亡患者尸解组织标本，包括肝脏、肾脏、胰腺、心脏、睾丸或卵巢组织。血清学检测排除HAV、HBV、HCV、HEV、HGV感染，均为单一TTVDNA阳性。其中男性4例，女性1例，平均年龄34.5±11.2岁。每例组织标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，5 μm厚连续切片，HE染色，肝组织免疫组织化学检测HBsAg、HBcAg、HCVNS3、HGVNS5。
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二、TTVDNA探针制备：探针采用PCR法标记。引物是P1∶5′-ACAGACAGAGGA GAAGGC-3′，P2∶5′-AACAGGCACATTACTACT-3′。用Dig-d-UTP标记，标记位置在TTVDNAORF1区段内，基本步骤参考文献[3]，取扩增产物，与不同标准化浓度DNA共同加样于2%琼脂糖凝胶中电泳，在紫外灯下进行粗略定量，标记条带单一，探针浓度约为1 mg/L。
三、TTVDNA原位杂交特异性及探针最适工作浓度检测：空白对照以预杂液替代Dig-TTVDNA探针对TTVDNA阳性肝组织切片进行杂交；以地高辛标记试剂盒(德国Boehringer Mannheim)提供对照探针替代Dig-TTVDNA；斑点杂交法验证原位杂交阳性结果；以预杂交液对探针作1∶50、1∶100、1∶200稀释，用不同浓度的探针进行原位杂交实验。
四、杂交阳性信号判定：原发杂交阳性信号为蓝紫色，呈细颗粒状。
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结 果
一、TTVDNA原位杂交特异性：使用三种不同稀释浓度的探针进行杂交，以1∶100稀释浓度杂交效果最好，1∶50、1∶200稀释浓度均难以获得稳定效果。空白对照杂交结果均为阴性，斑点杂交和原位杂交结果符合率为100%。
二、肝外组织中TTVDNA检出情况见表1：5例肝组织免疫组织化学检测均为阴性。其中例2为女性，取卵巢组织作原位杂交试验。3例(3/3)胰腺组织、2例(2/2)睾丸组织、1例(1/1)卵巢组织、2例(2/3)心肌组织、3例(3/5)肾组织检出阳性信号。
表1 肝外组织TTVDNA杂交结果 编号
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三、TTV基因的表达和分布：TTVDNA阳性杂交信号可见于胰腺腺泡细胞、睾丸生精细胞、卵巢细胞、心肌实质细胞、肾小球实质和间质细胞、肾小管上皮细胞等。阳性信号主要为胞核型，仅在部分胰腺组织中出现胞浆型。阳性细胞呈散在分布。
讨 论
研究发现[4，5]，TTV是一种单链无包膜DNA病毒，肝组织内病毒滴度大于血清水平10～100倍，血清中单一TTVDNA阳性患者病毒滴度与ALT水平存在一定平行关系，说明TTV可能是一种嗜肝病毒。近来又有报道，在外周血淋巴细胞、单核细胞内检出TTVDNA，提示TTV并非专一嗜肝病毒。据此，我们采用原位杂交技术，检测部分肝外重要脏器中TTV感染情况。
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原位杂交是一项分子病理学技术，定位性强，可作为血清学指标的佐证和补充。本次实验标记探针条带单一，探针工作浓度适宜，空白对照均为阴性，斑点杂交符合率100%，具有较好的灵敏度和特异度，实验重复性好，结果可靠。在肾小球实质细胞、肾小管上皮细胞、心肌实质细胞、睾丸生精细胞、卵巢细胞、胰腺腺泡细胞中均出现阳性杂交信号，证明TTV具有组织泛嗜性。其中3例胰腺组织，2例睾丸组织，1例卵巢组织均检出TTVDNA，5例肾组织中有2例，3例心肌组织中有1例杂交阴性，可能是由于(1)该组织中TTVDNA滴度相对偏低，未检出；(2)标本保存时间较长，部分组织标本中完整病毒模板被破坏；(3)TTV对不同个体组织亲嗜性存在差异等。杂交阳性信号主要为胞核型，仅在部分胰腺组织中出现胞浆型，阳性细胞呈散在分布，这与TTV在肝细胞内的分布特征基本相符[6]。
TTV的泛嗜性具有一定意义，如在生殖细胞内发现TTVDNA，提示TTV可能会通过垂直传播，也可能通过性接触传播给性伴侣。TTV泛嗜性对其致病性的意义，尚难明确。5例尸检肝外组织标本常规HE染色，未发现明显组织学损伤。
, http://www.100md.com
本课题为江苏省自然科学基金资助项目(BK99154)
参考文献
1，Hasebe C，Kawashima T，Kohgo Y，et al.Histological findings of TTV-positive non-B non-C chronic hepatitis patients.Nippon Rinsho，1999，57：1350-1355.
2，Okamura A，Yoshioka M，Kubota H，et al.Detection of a novel DNA virus(TTV) sequence in peripheral blood mononuclear cells.J Med Virol，1999，58：174-177.
3，黄德庄，闫惠平，郎振为，等.地高辛标记探针原位杂交检测肝组织中丙型肝炎病毒RNA.中华实验和临床病毒学杂志，1996，10：262-266.
, http://www.100md.com
4，Nishizawa T，Okamoto H，Konishi K，et al.A novel DNA virus(TTV)associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Biochem Biophys Res Commun，1997，24：92～97.
5，Okamoto H，Nishizawa T，Kato N，et al.Molecular Cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV)associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology.Hepatol Res，1998，10：1-16.
6，许德军，郎振为，王国玉，等.非甲-非庚型肝炎肝组织中经输血传播病毒DNA的原位检测.中华肝脏病杂志，1999，2：96-97.
(收稿：1999-09-28 修回：2000-01-05), 百拇医药