深低温保存角膜缘干细胞活性实验研究
作者：周善璧 陈家祺 黄挺 陈龙山 许丽英
单位：周善璧(重庆医科大学附属一院眼科 400016)；陈家祺 黄挺 陈龙山 许丽英(中山医科大学中山眼科中心 510060)
关键词：深低温保存；角膜缘干细胞；自体；移植；活性；新西兰白兔
重庆医学000601
摘 要 目的 评价深低温冷冻保存兔眼角膜缘干细胞活性。 方法 12只(12眼)新西兰白兔，制备2mm周边角膜和2mm球结膜的环形 浅层角膜缘植片及角膜干细胞缺乏眼表疾病模型。角膜缘植片通过程序降温仪程序降温后-1 96℃深低温保存，30天和60天后行角膜缘自体移植。组化及免疫组化证实深低温保存的角膜 缘干细胞活性。结果 角膜干细胞缺乏导致角膜上皮愈合延迟，上皮 结膜化，PAS染色阳性，AE5染色弱阳性；基质水肿，角膜血管化。深低温保存角膜缘干细胞 自体移植能促进角膜上皮愈合，为角膜表型，PAS染色阴性，AE5染色阳性。基质水肿逐渐吸 收，新生血管消退、变细。结论 深低温保存法能保存角膜缘干细胞 活性；能随时按需为临床提供活性角膜缘材料；为深低温保存角膜缘干细胞移植治疗临床眼 表疾病提供了实验依据。
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A Experimental Study on Limbal Stem Cells Viability with Cryop reservation
Zhou Shan-Bi，Chen Jia-Qi, Huang Ting,et al.
(Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospit al,Chongqing University of Medical Sciences 400016)
Abstract:Objective:To evaluate the viability of limbal stem cells with cryopreservation.Methods:Limbal grats inc lude 2mm of peripheralcornea and 2mm of conjunctiva and ocular surface disorders (OSDs) models of corneal stem cells deficiency were created in right eyes of 12 rabbits. The grafts were cryopreserved in -196℃ liquid nitrogen by program- controlled Bio-Freezer. The limbal autograft transplantations for ocular surfac ereconstruction were performmed after cryopreserved 60 days and 30 days. The via bility of limbal stem cells with cryopreservation was proved by histochemistry a nd immunohistochemistry.Results:The stem cells deficiency results in corneal epithelium delay healing, it showed conjunctival epithelial p henotype by a positive staining PAS and a weak positive staining of the immunohi stochemistry of monoclonal antobody AE5 and the stromatic swelling and neovascul arization. The cryopreserved limbal autograft transplantion can promote corneal epithelium healing, it showed corneal epithelial phenotype by a negative stainin g PAS and a positive staining of the immunohistochemistry of monoclonal antobody AE5. It was observed that corneal stromal swelling and neovascularization were markedly decreased.Conclusion:Cryopreservation in liquid n itrogen can preserve the viability of limbal stem cells, and provide viable limb al grafts to treat OSDs at any time. It provide a experimental evidence for cry opreserved limbal stem cells to treatment OSDs.
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Key words:Cryopreservation Limbus Stem cells Autograft transplantation Animal
角膜缘干细胞移植治疗眼表疾病已越来越受到临床医生的重视，许多作者用新鲜自体或同种 异体角膜缘移植术进行眼表重建，取得了满意的治疗效果[1]。但这些新鲜材料难 以达到按需要随时提供给临床患者的要求，在一定程度上影响了角膜缘干细胞移植的广泛开 展，而穿透性角膜移植所剩下的角膜缘干细胞材料未充分利用又产生相对浪费。我们将兔眼 角膜缘干细胞进行深低温保存再自体移植，证实了深低温保存的角膜缘干细胞的活性，为角 膜缘干细胞的长期保存提供了实验依据。目前国内外尚无类似报告，现将我们的实验研究报 告如下。
1 材料与方法
1.1 供体角膜缘干细胞材料及角膜缘干细胞缺乏动物模型的制备[2 ]：
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12只(12眼)新西兰白兔(中山医科大学实验动物中心提供，2-2.5Kg，雌雄不限)用氯氨酮和 氯丙嗪混合肌肉注射。右眼为实验眼。全麻后消毒结膜囊及周围组织。地卡因局麻，铺巾开 睑后，上、下、内、外直肌牵引缝线固定眼球。显微镜下用10mm-11mm直径环钻作留有2mm宽 的周边角膜的浅层划界，用剃须刀制备约带2mm周边角膜和2mm球结膜的角膜缘干细胞移植片 。去除余下的角膜上皮，球结膜不缝合，此眼即为角膜干细胞缺乏模型。术后妥布霉素2万 单位加地塞米松2.5mg球结膜下注射。术后每日涂妥布霉素眼膏第1周3-4次，第2周2次，第 3周1次。
1.2 角膜缘干细胞移植片深低温保存及复温[3]：
取下的角膜缘干细胞放入湿房，置4℃冰箱，4-6小时内进行程序降温：将角膜缘干细胞移植 片从湿房移入装有2.5ml的1号抗冻剂(含92.5%的20%人血清白蛋白，5%二甲基亚砜，2.5% 硫酸软骨素)的保存瓶中，置4℃冰箱10分钟，再将角膜缘干细胞移植片移入装有2.5ml的2 号抗冻剂(含90.0%的20%人血清白蛋白，7.5%二甲基亚砜，2.5%硫酸软骨素)的保存瓶中 ，置4℃冰箱10分钟，将装有角膜缘干细胞移植片的2号保存瓶置于程序降温仪中进行程序降 温：即以-1.5℃/分从4℃降至-5℃、以-2.5℃/分降至-10℃、以-1.5℃/分降至-30℃、 以-8.0℃/分降至-80℃，最后将2号保存瓶放入-196℃液氮罐内长期保存。分别于30天和6 0天后取出，在40℃恒温水浴中复温，用20%人血清白蛋白洗除2号保存液后，放入冰壶内送 动物手术室备用。
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1.3 深低温保存后兔眼角膜缘干细胞的活性：
1.3.1 角膜缘干细胞自体移植
仔细清除兔眼角膜干细胞缺乏模型眼表面上的新生血管膜样组织，将深低温保存的角膜缘干 细胞进行自体移植。保证植片上皮面向上，周边角膜侧朝向瞳孔区，10-0无损伤缝线间断缝 合角膜侧，8-0可吸收线缝合球结膜侧(与巩膜缝合)，术后处理同前，观察1月。
1.3.2 组织病理学及免疫组织化学检查
第一次手术后60天和30天各处死1只动物，第二次手术后30天动物全部处死。取双眼角膜，1 0%福尔马林固定，石蜡包埋，切片。常规HE染色，PAS特殊染色及单克隆抗体AE5(由Dr Sun T-T of New York University School of Medicine赠送，SABC试剂盒由武汉博士德公司提 供)免疫组化染色。PAS能特异与杯状细胞所分泌的粘蛋白糖基部分结合，染色阳性说明为结 膜上皮表型。单克隆抗体AE5能特异与角膜上皮K3角蛋白结合，染色阳性说明为角膜上皮表 型。
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2 结果
2.1 兔眼角膜干细胞缺乏模型临床表现
12只(12眼)实验兔第一次术后(2号动物术后16天死亡)，5只动物观察60天，6只动物观察30 天。7眼角膜上皮术后22-26天愈合，平均24±1天，4眼复发性上皮糜烂(观察30及60天各2眼 )，反复荧光着色；基质混浊水肿；4-7天出现新生血管，平均5±1天。到第二次手术前，8 眼新生血管布满全角膜(观察30及60天各4眼)，3眼占据全周边角膜缘内3-5mm(观察30天2眼 ，60天1眼)。
2.2 深低温保存后兔眼角膜缘干细胞自体移植临床表现
第一次手术后9只动物行角膜缘干细胞自体移植手术，术后第四天即有角膜上皮生长，荧光 着色面逐日缩小，7-14天角膜上皮全部愈合，平均10±2天，随上皮愈合基质水肿逐渐吸收 ，新生血管翳逐渐消退、变细，2眼全部消失。
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2.3 组织病理学及免疫组织化学改变
正常对照组：角膜上皮细胞排列规则，厚薄均匀，PAS染色阴性，单克隆抗体AE5染色阳性， 基质纤维板层排列规则，无新生血管及炎症细胞。
第一次手术后：角膜上皮细胞排列极不规则，厚薄不均匀，可见大量的PAS染色阳性的杯状 细胞，单克隆抗体AE5染色弱阳性，基质水肿，纤维板层排列不规则，可见大量炎症细胞浸 润及管腔内有大量红细胞的新生血管形成。
第二次手术后：角膜上皮细胞排列较规则，厚薄较一致，PAS染色阴性，单克隆抗体AE5染色 阳性。炎症细胞吸收，新生血管消退、变细、消失。
3 讨论
3.1 角膜干细胞缺乏性眼表疾病
正常眼球表面被角膜、角膜缘及结膜三种不同表型的上皮覆盖[4]。正常情况下， 角膜缘能阻止结膜上皮及血管向角膜内生长，起到眼表上皮屏障作用，一旦角膜缘干细胞受 到破坏或功能减退，如眼酸、碱化学烧伤，热烧伤等，角膜缘即失去了这种屏障功能，表现 为角膜上皮结膜化，血管化，慢性炎症，角膜上皮结膜化为其特征性改变[5]。通 过动物实验，我们观察到兔眼角膜缘干细胞环形切除加上皮去除后，角膜上皮只能依靠结膜 干细胞的增殖和分化来修复，这种上皮修复时间明显较角膜干细胞来源的上皮修复延迟，甚 至出现复发性上皮糜烂或长期不愈；角膜基质水肿，炎症细胞浸润及角膜血管化。修复的角 膜上皮PAS染色阳性，表现为结膜上皮表型；单克隆抗体AE5免疫组织化学染色弱阳性，说明 伴有角膜上皮表型的特征。这与兔眼结膜上皮本身对单克隆抗体AE5免疫组化染色阳性的特 异性K3角蛋白产生表达有关[6]，另外结膜干细胞可能存在两种分化潜能，一方面 向结膜上皮分化，另一方面也可向角膜上皮分化即结膜转向分化(conjunctival transdiffe rentiation)，这种转向分化受细胞内环境等多种因素的影响，从而促进了结膜上皮对K3角 蛋白的表达[7]。
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3.2 深低温保存后兔眼角膜缘干细胞自体移植
我们通过程序降温仪将兔眼角膜缘干细胞移植片进行程序降温后放入-196℃液氮中保存，按 设计需要及时复温。由于角膜干细胞缺乏致炎症细胞浸润，大量新生血管形成，使得同种异 体移植排斥反应的危险性大大增加[5]。为了避免这种排斥反应对深低温保存的角 膜缘干细胞移植手术后活性观察的影响，我们采用角膜缘干细胞自体移植对第一次手术后的 角膜干细胞缺乏模型进行治疗。9只兔眼角膜缘干细胞移植片均成活，移植的角膜干细胞不 断增殖、分化，促进角膜上皮在短时间内修复，平均愈合时间为10±2天，PAS染色阴性，单 克隆抗体AE5免疫组化染色阳性，修复的角膜上皮为真正的角膜上皮表型。由于角膜上皮的 完整性--屏障功能的恢复，减少了炎症反应的刺激，角膜基质中的炎症细胞、新生血管逐 渐消退，基质水肿逐渐吸收。本实验9只兔眼中，术后1个月全部新生血管变细，有2眼新生 血管消失，达到了满意的治疗效果。
实验表明：角膜缘干细胞程序降温深低温保存法：①能保存角膜缘干细胞的活性，我们可以 将穿透性角膜移植剩下的角膜缘干细胞进行长期保存，使供体材料得到充分利用，达到为临 床随时提供类似新鲜活性干细胞的目的；②能随时接收捐献的角膜干细胞组织进行活性保存 ；③制备角膜缘干细胞植片不破坏眼表结构，容易被捐献者及家属接受而获得较多植片组织 ，将其深低温保存有效地解决临床供体紧缺矛盾；④为眼库技术的发挥开辟了新的应用途径 。
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参考文献
1，Tan DTH, Ficker LA, Buckley RJ. Limbal transplantation. Ophtha lmology, 1996,103:29～36
2，Huang AJW, Tseng SCG. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci,1991,32:96～195
3，黄挺，陈家祺，郑湖玲.硫酸软骨素在深低温角膜保存中对内皮细胞的 保护作用.中国实用眼科杂志，1998，16：95～98
4，Chen JJY, Tseng SCG. Corneal epithelial wound healing in parti al limbal deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990,31:1301～1314
, 百拇医药
5，Puangsricharern V, Tseng SCG. Cytologic evidence of corneal di seases with limbal stem cell deficiency. Ophthalmology,1995,102:1476～1485
6，Kiritoshi A, Nishida K, Ohashi Y, et al. 64kd keratin expressi on in normal conjunctival epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci,1992,33:1241
7，Kinoshit S, Nishida K, Kiritoshi A, et al. Keratin expression in conjunctival epithelium can be greatly influented by the external environment . Invest Ophthalmol Vis Sci,1992,33:1176
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单位：周善璧(重庆医科大学附属一院眼科 400016)；陈家祺 黄挺 陈龙山 许丽英(中山医科大学中山眼科中心 510060)
关键词：深低温保存；角膜缘干细胞；自体；移植；活性；新西兰白兔
重庆医学000601
摘 要 目的 评价深低温冷冻保存兔眼角膜缘干细胞活性。 方法 12只(12眼)新西兰白兔，制备2mm周边角膜和2mm球结膜的环形 浅层角膜缘植片及角膜干细胞缺乏眼表疾病模型。角膜缘植片通过程序降温仪程序降温后-1 96℃深低温保存，30天和60天后行角膜缘自体移植。组化及免疫组化证实深低温保存的角膜 缘干细胞活性。结果 角膜干细胞缺乏导致角膜上皮愈合延迟，上皮 结膜化，PAS染色阳性，AE5染色弱阳性；基质水肿，角膜血管化。深低温保存角膜缘干细胞 自体移植能促进角膜上皮愈合，为角膜表型，PAS染色阴性，AE5染色阳性。基质水肿逐渐吸 收，新生血管消退、变细。结论 深低温保存法能保存角膜缘干细胞 活性；能随时按需为临床提供活性角膜缘材料；为深低温保存角膜缘干细胞移植治疗临床眼 表疾病提供了实验依据。
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A Experimental Study on Limbal Stem Cells Viability with Cryop reservation
Zhou Shan-Bi，Chen Jia-Qi, Huang Ting,et al.
(Department of Ophthalmology,the First Affiliated Hospit al,Chongqing University of Medical Sciences 400016)
Abstract:Objective:To evaluate the viability of limbal stem cells with cryopreservation.Methods:Limbal grats inc lude 2mm of peripheralcornea and 2mm of conjunctiva and ocular surface disorders (OSDs) models of corneal stem cells deficiency were created in right eyes of 12 rabbits. The grafts were cryopreserved in -196℃ liquid nitrogen by program- controlled Bio-Freezer. The limbal autograft transplantations for ocular surfac ereconstruction were performmed after cryopreserved 60 days and 30 days. The via bility of limbal stem cells with cryopreservation was proved by histochemistry a nd immunohistochemistry.Results:The stem cells deficiency results in corneal epithelium delay healing, it showed conjunctival epithelial p henotype by a positive staining PAS and a weak positive staining of the immunohi stochemistry of monoclonal antobody AE5 and the stromatic swelling and neovascul arization. The cryopreserved limbal autograft transplantion can promote corneal epithelium healing, it showed corneal epithelial phenotype by a negative stainin g PAS and a positive staining of the immunohistochemistry of monoclonal antobody AE5. It was observed that corneal stromal swelling and neovascularization were markedly decreased.Conclusion:Cryopreservation in liquid n itrogen can preserve the viability of limbal stem cells, and provide viable limb al grafts to treat OSDs at any time. It provide a experimental evidence for cry opreserved limbal stem cells to treatment OSDs.
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Key words:Cryopreservation Limbus Stem cells Autograft transplantation Animal
角膜缘干细胞移植治疗眼表疾病已越来越受到临床医生的重视，许多作者用新鲜自体或同种 异体角膜缘移植术进行眼表重建，取得了满意的治疗效果[1]。但这些新鲜材料难 以达到按需要随时提供给临床患者的要求，在一定程度上影响了角膜缘干细胞移植的广泛开 展，而穿透性角膜移植所剩下的角膜缘干细胞材料未充分利用又产生相对浪费。我们将兔眼 角膜缘干细胞进行深低温保存再自体移植，证实了深低温保存的角膜缘干细胞的活性，为角 膜缘干细胞的长期保存提供了实验依据。目前国内外尚无类似报告，现将我们的实验研究报 告如下。
1 材料与方法
1.1 供体角膜缘干细胞材料及角膜缘干细胞缺乏动物模型的制备[2 ]：
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12只(12眼)新西兰白兔(中山医科大学实验动物中心提供，2-2.5Kg，雌雄不限)用氯氨酮和 氯丙嗪混合肌肉注射。右眼为实验眼。全麻后消毒结膜囊及周围组织。地卡因局麻，铺巾开 睑后，上、下、内、外直肌牵引缝线固定眼球。显微镜下用10mm-11mm直径环钻作留有2mm宽 的周边角膜的浅层划界，用剃须刀制备约带2mm周边角膜和2mm球结膜的角膜缘干细胞移植片 。去除余下的角膜上皮，球结膜不缝合，此眼即为角膜干细胞缺乏模型。术后妥布霉素2万 单位加地塞米松2.5mg球结膜下注射。术后每日涂妥布霉素眼膏第1周3-4次，第2周2次，第 3周1次。
1.2 角膜缘干细胞移植片深低温保存及复温[3]：
取下的角膜缘干细胞放入湿房，置4℃冰箱，4-6小时内进行程序降温：将角膜缘干细胞移植 片从湿房移入装有2.5ml的1号抗冻剂(含92.5%的20%人血清白蛋白，5%二甲基亚砜，2.5% 硫酸软骨素)的保存瓶中，置4℃冰箱10分钟，再将角膜缘干细胞移植片移入装有2.5ml的2 号抗冻剂(含90.0%的20%人血清白蛋白，7.5%二甲基亚砜，2.5%硫酸软骨素)的保存瓶中 ，置4℃冰箱10分钟，将装有角膜缘干细胞移植片的2号保存瓶置于程序降温仪中进行程序降 温：即以-1.5℃/分从4℃降至-5℃、以-2.5℃/分降至-10℃、以-1.5℃/分降至-30℃、 以-8.0℃/分降至-80℃，最后将2号保存瓶放入-196℃液氮罐内长期保存。分别于30天和6 0天后取出，在40℃恒温水浴中复温，用20%人血清白蛋白洗除2号保存液后，放入冰壶内送 动物手术室备用。
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1.3 深低温保存后兔眼角膜缘干细胞的活性：
1.3.1 角膜缘干细胞自体移植
仔细清除兔眼角膜干细胞缺乏模型眼表面上的新生血管膜样组织，将深低温保存的角膜缘干 细胞进行自体移植。保证植片上皮面向上，周边角膜侧朝向瞳孔区，10-0无损伤缝线间断缝 合角膜侧，8-0可吸收线缝合球结膜侧(与巩膜缝合)，术后处理同前，观察1月。
1.3.2 组织病理学及免疫组织化学检查
第一次手术后60天和30天各处死1只动物，第二次手术后30天动物全部处死。取双眼角膜，1 0%福尔马林固定，石蜡包埋，切片。常规HE染色，PAS特殊染色及单克隆抗体AE5(由Dr Sun T-T of New York University School of Medicine赠送，SABC试剂盒由武汉博士德公司提 供)免疫组化染色。PAS能特异与杯状细胞所分泌的粘蛋白糖基部分结合，染色阳性说明为结 膜上皮表型。单克隆抗体AE5能特异与角膜上皮K3角蛋白结合，染色阳性说明为角膜上皮表 型。
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2 结果
2.1 兔眼角膜干细胞缺乏模型临床表现
12只(12眼)实验兔第一次术后(2号动物术后16天死亡)，5只动物观察60天，6只动物观察30 天。7眼角膜上皮术后22-26天愈合，平均24±1天，4眼复发性上皮糜烂(观察30及60天各2眼 )，反复荧光着色；基质混浊水肿；4-7天出现新生血管，平均5±1天。到第二次手术前，8 眼新生血管布满全角膜(观察30及60天各4眼)，3眼占据全周边角膜缘内3-5mm(观察30天2眼 ，60天1眼)。
2.2 深低温保存后兔眼角膜缘干细胞自体移植临床表现
第一次手术后9只动物行角膜缘干细胞自体移植手术，术后第四天即有角膜上皮生长，荧光 着色面逐日缩小，7-14天角膜上皮全部愈合，平均10±2天，随上皮愈合基质水肿逐渐吸收 ，新生血管翳逐渐消退、变细，2眼全部消失。
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2.3 组织病理学及免疫组织化学改变
正常对照组：角膜上皮细胞排列规则，厚薄均匀，PAS染色阴性，单克隆抗体AE5染色阳性， 基质纤维板层排列规则，无新生血管及炎症细胞。
第一次手术后：角膜上皮细胞排列极不规则，厚薄不均匀，可见大量的PAS染色阳性的杯状 细胞，单克隆抗体AE5染色弱阳性，基质水肿，纤维板层排列不规则，可见大量炎症细胞浸 润及管腔内有大量红细胞的新生血管形成。
第二次手术后：角膜上皮细胞排列较规则，厚薄较一致，PAS染色阴性，单克隆抗体AE5染色 阳性。炎症细胞吸收，新生血管消退、变细、消失。
3 讨论
3.1 角膜干细胞缺乏性眼表疾病
正常眼球表面被角膜、角膜缘及结膜三种不同表型的上皮覆盖[4]。正常情况下， 角膜缘能阻止结膜上皮及血管向角膜内生长，起到眼表上皮屏障作用，一旦角膜缘干细胞受 到破坏或功能减退，如眼酸、碱化学烧伤，热烧伤等，角膜缘即失去了这种屏障功能，表现 为角膜上皮结膜化，血管化，慢性炎症，角膜上皮结膜化为其特征性改变[5]。通 过动物实验，我们观察到兔眼角膜缘干细胞环形切除加上皮去除后，角膜上皮只能依靠结膜 干细胞的增殖和分化来修复，这种上皮修复时间明显较角膜干细胞来源的上皮修复延迟，甚 至出现复发性上皮糜烂或长期不愈；角膜基质水肿，炎症细胞浸润及角膜血管化。修复的角 膜上皮PAS染色阳性，表现为结膜上皮表型；单克隆抗体AE5免疫组织化学染色弱阳性，说明 伴有角膜上皮表型的特征。这与兔眼结膜上皮本身对单克隆抗体AE5免疫组化染色阳性的特 异性K3角蛋白产生表达有关[6]，另外结膜干细胞可能存在两种分化潜能，一方面 向结膜上皮分化，另一方面也可向角膜上皮分化即结膜转向分化(conjunctival transdiffe rentiation)，这种转向分化受细胞内环境等多种因素的影响，从而促进了结膜上皮对K3角 蛋白的表达[7]。
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3.2 深低温保存后兔眼角膜缘干细胞自体移植
我们通过程序降温仪将兔眼角膜缘干细胞移植片进行程序降温后放入-196℃液氮中保存，按 设计需要及时复温。由于角膜干细胞缺乏致炎症细胞浸润，大量新生血管形成，使得同种异 体移植排斥反应的危险性大大增加[5]。为了避免这种排斥反应对深低温保存的角 膜缘干细胞移植手术后活性观察的影响，我们采用角膜缘干细胞自体移植对第一次手术后的 角膜干细胞缺乏模型进行治疗。9只兔眼角膜缘干细胞移植片均成活，移植的角膜干细胞不 断增殖、分化，促进角膜上皮在短时间内修复，平均愈合时间为10±2天，PAS染色阴性，单 克隆抗体AE5免疫组化染色阳性，修复的角膜上皮为真正的角膜上皮表型。由于角膜上皮的 完整性--屏障功能的恢复，减少了炎症反应的刺激，角膜基质中的炎症细胞、新生血管逐 渐消退，基质水肿逐渐吸收。本实验9只兔眼中，术后1个月全部新生血管变细，有2眼新生 血管消失，达到了满意的治疗效果。
实验表明：角膜缘干细胞程序降温深低温保存法：①能保存角膜缘干细胞的活性，我们可以 将穿透性角膜移植剩下的角膜缘干细胞进行长期保存，使供体材料得到充分利用，达到为临 床随时提供类似新鲜活性干细胞的目的；②能随时接收捐献的角膜干细胞组织进行活性保存 ；③制备角膜缘干细胞植片不破坏眼表结构，容易被捐献者及家属接受而获得较多植片组织 ，将其深低温保存有效地解决临床供体紧缺矛盾；④为眼库技术的发挥开辟了新的应用途径 。
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参考文献
1，Tan DTH, Ficker LA, Buckley RJ. Limbal transplantation. Ophtha lmology, 1996,103:29～36
2，Huang AJW, Tseng SCG. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci,1991,32:96～195
3，黄挺，陈家祺，郑湖玲.硫酸软骨素在深低温角膜保存中对内皮细胞的 保护作用.中国实用眼科杂志，1998，16：95～98
4，Chen JJY, Tseng SCG. Corneal epithelial wound healing in parti al limbal deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990,31:1301～1314
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5，Puangsricharern V, Tseng SCG. Cytologic evidence of corneal di seases with limbal stem cell deficiency. Ophthalmology,1995,102:1476～1485
6，Kiritoshi A, Nishida K, Ohashi Y, et al. 64kd keratin expressi on in normal conjunctival epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci,1992,33:1241
7，Kinoshit S, Nishida K, Kiritoshi A, et al. Keratin expression in conjunctival epithelium can be greatly influented by the external environment . Invest Ophthalmol Vis Sci,1992,33:1176
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