羧乙基锗倍半氧化物对肝癌的化学预防作用研究
作者：侯华新 黎丹戎 涂文升 陈艳华 黎远冬 邱莉
单位：华新(广西医科大学 南宁 530021)；黎丹戎 涂文升 陈艳华 黎远冬(广西肿瘤防治研究所)；邱莉(广西医科大学 南宁 530021)
关键词：羧乙基锗倍半氧化物；癌化学预防；超氧化物歧化酶
中国现代医学杂志000606
羧乙基锗倍半氧化物(Carboxyethylgermanium 简称Ge-132)对体外肝癌细胞无明显直接杀伤作用，但能降低肝癌细胞在软琼脂上的集落形成率。在AFB1致大鼠肝癌体内短期实验模型中发现，Ge-132具有抵抗黄曲霉素(Aflatoxin B1简称AFB1)降低超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase 简称SOD)活力的作用，Ge-132的摄入时间、剂量可影响SOD活力大小。提示Ge-132具有较强的抗氧化作用和癌的化学预防作用。
, 百拇医药
分类号 R735.7
LIVER CANCER CHEMOPREVENTION WITH
CARBOXYETHYLGERMANIUM (Ge-132)
Hou Huaxin，Li Danrong，Tu Wensheng
Guangxi Medical University, Nanning 530021
Abstract: This paper report that cell growth and proliferatio n of BEL-7402 could not be efficiently inhibited by carboxyethylgermanium Ge-132. But it can be deb ased the cells colony formation rate in soft-agar. Ge-132 possessed the remarkab le resistance effects on aflatoxinB1 AFB1 reduces Superoxide Dismutase (SOD) ac tivity in vivo during AFB1 -induced hepato-carcinogenesis for short term model e xperiments. The SOD activity can be effected by the time and the dosage of Ge-13 2 englobement. The results indicated that antioxidative ability of Ge-132 is rel ated to its anticarcinogenicity. Ge-12 can be used as a safe and effective chemo prevention agent.
, 百拇医药
Key words: Carboxyethylgermanium; Chemoprevention; Superoxide Di smutase (SOD)
大量实验结果和流行病学研究表明，癌的化学预防是一条合理且可行的途径，是降低癌症发病率的手段之一。所谓癌的化学预防是指预防剂能诱导分化、阻断致癌作用、增强免疫力、抑制癌前病变。而预防剂的高效、低毒则是进行化学预防的关键。多年实验表明羧乙基锗倍半氧化物(Carboxyethylgermanium简称Ge-132)具有一定的防癌、抗癌作用，且毒性很低，然而将Ge-132从癌化学预防角度进行研究尚未多见，本文通过观察Ge-132对肝癌细胞的抑癌实验和AFB1致大鼠肝癌过程中体内SOD的变化，探讨Ge-132的癌化学预防作用及机制。
1 材料与方法
1.1 人肝癌细胞株BEL-7402由广西肿瘤防治研究所免疫室传代保存。
, http://www.100md.com
1.2 试剂及受试样品
AFB1、N-2-乙酰氨基芴(2-AAF)、黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤、噻唑蓝(MTT)均为Sigma公司产品，Ge-132由广西医科大学应化所提供，RPMI1640为Gibco公司产品；其它试剂为国产分析纯试剂。岛津UV-120-02型紫外可见分光光度计。美国产MR-300酶标仪。
1.3 MTT法
取对数生长的人肝癌细胞1.0×105/ml，分装于96孔板，每孔0.1ml，细胞板内的细胞常规培养于含10%小牛血清，100μ/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，37℃5%CO2下培养24h后，分别加入不同浓度的Ge-132,各组设3个平行孔，空白对照为生理盐水。加药完毕继续孵育48h，实验终止前加入2mg/ml MTT液20μl，再培养4h，测试前加入2%DMSO100μl，充分振匀后，测定每孔490nm下的光密度OD值，按下列公式求出生长抑制率(IR)和通过作图求出半数抑制浓度IC50。生长抑制率(%)=(1-(用药组平均OD值)/(对照组平均OD值))×100%
, http://www.100md.com
1.4 软琼脂集落形成实验
将实验组(250ug/ml Ge-132作用24h)细胞与对照组细胞用培养液配制的0.6%琼脂等容积混匀，接种于6cm直径平皿内(105细胞/皿)，置于CO2培养箱内(37℃)培养3周，待长出肉眼可见集落，计算集落形成率。
1.5 实验动物分组与程序
近交系Wistar雄性大鼠60只，体重(123±12)g，随机分为5组，每组12只，一鼠一笼饲养。A组：饲含Ge-132(1?000mg/kg体重)实验饲料6w。B组：饲以含Ge-132(500mg/kg体重)实验饲料6w。C组：于注射AFB1前2w喂含Ge-132(1?000mg/kg体重)的饲料共2w。D组：停注射AFB1后喂含Ge-132(1?000mg/kg体重)的饲料共2w。E组：阳性对照组，饲以基础饲料。所有动物从第3周起腹腔注射AFB1400μg/kg体重，用DMSO配成注射液，1次/d，每周5次，共2周。从第7周开始，喂含0.015%(2-AAF)的饲料2周，停2-AAF饲料3d后，全部处死。取血清及肝组织，测定其SOD活力的变化。 血清、肝组织SOD活力测定按文献[1]进行。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 Ge-132对肝癌细胞生长增殖的影响
从表1看出在62.5，125，250，500，1?000，1?250μg/ml浓度下，Ge-132对BEL-7402的生长抑制率随药物浓度的升高而升高，IC50为1?200μg/ml。
表1 G-132对肝癌细胞BEL-7402生长抑制率及IC50值 药物浓度(μg/ml)
生长抑制率(%)
IC50(μg/ml)
62.5
125
, 百拇医药
250
500
1000
1250
5.63
8.74
15.28
31.15
42.06
56.29
1200
注：表内各剂量的抑制率均为3次实验结果的平均值。
, 百拇医药 2.2 肝癌细胞BEL-7402能在软琼脂上形成60个集落，该细胞经Ge-132 250μg/ml作用24h后，接种于软琼脂，只有15个集落产生，反映了Ge-132对BEL-7402细胞具有诱导分化作用。
2.3 体内实验结果表明，A、B、C、D组的大鼠，不管是血清还是肝组织，其SOD活力均高于E组，且有显著性差异(P<0.05)。结果见表2。表2 大鼠体内肝组织、血清中SOD值情况比较 组别
动物数
肝组织(Iu/mg)
P肝组织
血清(Iu/ml)
P血清
PA～B<0.001
, http://www.100md.com
PA～B<0.005
A
12
0.293±0.021
PA～D<0.001
250.64±12.23
PA～D<0.001
PA～E<0.001
PA～E<0.001
B
12
, 百拇医药
0.244±0.031
PB～E<0.005
232.56±9.82
PB～E<0.001
C
12
0.261±0.017
PC～E<0.001
237.78±10.06
PC～E<0.001
D
, 百拇医药
11
0.237±0.026
PC～D<0.005
194.91±10.74
PC～D<0.001
E
11
0.205±0.027
PD～E<0.005
157.87±9.15
PC～E<0.001
, 百拇医药
注：在实验结束之前，D、E组各有一只动物死亡。
2.4 A、C、D三组比较，其SOD活力也有差别。A组最高，D组最低。其中A、C组与D组比较均有显著差异(P<0.005)。这预示着Ge-132的剂量可影响SOD活力。A、B两组比较，SOD活力也有显著差异(P<0.05)。这表明Ge-132的剂量可影响SOD活力。3 讨论
已有资料表明：本实验采用的AFB1致大鼠肝癌体内短期实验模型，其诱发肝癌的概率较大[2]。所以观察此过程的SOD活力变化，有助于进一步了解化学因素致癌的自由基机制及化学预防机制。
Ge-132在剂量较大(高于其他常用抗癌药物)时，才产生细胞毒作用，这与Ge-132毒性较小和Ge-132抗癌不是直接作用癌细胞的实验结果相吻合。而软琼脂集落实验结果表明，Ge-132具有抑制人肝癌细胞的生长增殖，这些结果都提示Ge-132作为肝癌化学预防的可能性。
, http://www.100md.com
Ge-132对由AFB1直接诱发肝癌是否具有抑制作用，其抑制作用是否与抗氧化作用有关，尚未有肯定报道。我们在AFB1诱发肝癌过程中发现，无论是摄毒前或摄毒后给予Ge-132的大鼠，其体内血清和肝组织的SOD活力均高于阳性对照组。且在毒性允许的范围内[3]，Ge-132的剂量较大时，抑制SOD活力降低的作用较强。这从一个侧面说明，Ge-132能消除诱癌过程中产生的自由基，其癌化学预防作用的机制之一可能是通过抗氧化作用来实现的。
从化学预防时间来考虑，大鼠体内SOD活力与摄入Ge-132的时间有关。摄入Ge-132时间越长，其SOD活力越高，抑制SOD活力降低的作用越大。而且当Ge-132应用于致癌物前时，抑制SOD活力降低的能力强于应用致癌物之后。这也证明长时间或提前服用Ge-132的抗氧化作用较强，防癌效果较好。这与Ge-132的预防作用优于治疗作用的结论相吻合。可以设想，若在黄曲霉毒素污染地区采用Ge-132进行药物干预，可起到一定的预防作用。
, 百拇医药
已有报道说明，Ge-132的抗癌作用与增强机体的免疫能力有关[4]，而通过本文实验结果，可提示，Ge-132的抗氧化作用与增强机体免疫力一样，将成为Ge-132癌化学预防的机制之一。
广西区卫生厅青年基金资助项目(青9207)
参考文献
1，侯华新，秦 箐，黎丹戎，等.黄曲霉毒素B1与超氧化物歧化酶的关系.广西医学院学报，1993；10(4)：351
2，严瑞琪，李 瑗，覃国忠，等.黄曲霉毒素B1致肝癌作用的短期体内实验长期观察大鼠肝细胞r-GT阳性灶 与原发性肝癌发生关系的研究.肝脏病学，1988；18(10)：11
3，张树功.有机锗化合物的毒性.化学通报，1993；(9)：11
4，Aso H.Induction of interferon and activation of NK cells and macrophages in mice by oral administration of Ge-132.an organic germanium compound.Microbiol Immunol,1985;29:65, http://www.100md.com
单位：华新(广西医科大学 南宁 530021)；黎丹戎 涂文升 陈艳华 黎远冬(广西肿瘤防治研究所)；邱莉(广西医科大学 南宁 530021)
关键词：羧乙基锗倍半氧化物；癌化学预防；超氧化物歧化酶
中国现代医学杂志000606
羧乙基锗倍半氧化物(Carboxyethylgermanium 简称Ge-132)对体外肝癌细胞无明显直接杀伤作用，但能降低肝癌细胞在软琼脂上的集落形成率。在AFB1致大鼠肝癌体内短期实验模型中发现，Ge-132具有抵抗黄曲霉素(Aflatoxin B1简称AFB1)降低超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase 简称SOD)活力的作用，Ge-132的摄入时间、剂量可影响SOD活力大小。提示Ge-132具有较强的抗氧化作用和癌的化学预防作用。
, 百拇医药
分类号 R735.7
LIVER CANCER CHEMOPREVENTION WITH
CARBOXYETHYLGERMANIUM (Ge-132)
Hou Huaxin，Li Danrong，Tu Wensheng
Guangxi Medical University, Nanning 530021
Abstract: This paper report that cell growth and proliferatio n of BEL-7402 could not be efficiently inhibited by carboxyethylgermanium Ge-132. But it can be deb ased the cells colony formation rate in soft-agar. Ge-132 possessed the remarkab le resistance effects on aflatoxinB1 AFB1 reduces Superoxide Dismutase (SOD) ac tivity in vivo during AFB1 -induced hepato-carcinogenesis for short term model e xperiments. The SOD activity can be effected by the time and the dosage of Ge-13 2 englobement. The results indicated that antioxidative ability of Ge-132 is rel ated to its anticarcinogenicity. Ge-12 can be used as a safe and effective chemo prevention agent.
, 百拇医药
Key words: Carboxyethylgermanium; Chemoprevention; Superoxide Di smutase (SOD)
大量实验结果和流行病学研究表明，癌的化学预防是一条合理且可行的途径，是降低癌症发病率的手段之一。所谓癌的化学预防是指预防剂能诱导分化、阻断致癌作用、增强免疫力、抑制癌前病变。而预防剂的高效、低毒则是进行化学预防的关键。多年实验表明羧乙基锗倍半氧化物(Carboxyethylgermanium简称Ge-132)具有一定的防癌、抗癌作用，且毒性很低，然而将Ge-132从癌化学预防角度进行研究尚未多见，本文通过观察Ge-132对肝癌细胞的抑癌实验和AFB1致大鼠肝癌过程中体内SOD的变化，探讨Ge-132的癌化学预防作用及机制。
1 材料与方法
1.1 人肝癌细胞株BEL-7402由广西肿瘤防治研究所免疫室传代保存。
, http://www.100md.com
1.2 试剂及受试样品
AFB1、N-2-乙酰氨基芴(2-AAF)、黄嘌呤氧化酶、黄嘌呤、噻唑蓝(MTT)均为Sigma公司产品，Ge-132由广西医科大学应化所提供，RPMI1640为Gibco公司产品；其它试剂为国产分析纯试剂。岛津UV-120-02型紫外可见分光光度计。美国产MR-300酶标仪。
1.3 MTT法
取对数生长的人肝癌细胞1.0×105/ml，分装于96孔板，每孔0.1ml，细胞板内的细胞常规培养于含10%小牛血清，100μ/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中，37℃5%CO2下培养24h后，分别加入不同浓度的Ge-132,各组设3个平行孔，空白对照为生理盐水。加药完毕继续孵育48h，实验终止前加入2mg/ml MTT液20μl，再培养4h，测试前加入2%DMSO100μl，充分振匀后，测定每孔490nm下的光密度OD值，按下列公式求出生长抑制率(IR)和通过作图求出半数抑制浓度IC50。生长抑制率(%)=(1-(用药组平均OD值)/(对照组平均OD值))×100%
, http://www.100md.com
1.4 软琼脂集落形成实验
将实验组(250ug/ml Ge-132作用24h)细胞与对照组细胞用培养液配制的0.6%琼脂等容积混匀，接种于6cm直径平皿内(105细胞/皿)，置于CO2培养箱内(37℃)培养3周，待长出肉眼可见集落，计算集落形成率。
1.5 实验动物分组与程序
近交系Wistar雄性大鼠60只，体重(123±12)g，随机分为5组，每组12只，一鼠一笼饲养。A组：饲含Ge-132(1?000mg/kg体重)实验饲料6w。B组：饲以含Ge-132(500mg/kg体重)实验饲料6w。C组：于注射AFB1前2w喂含Ge-132(1?000mg/kg体重)的饲料共2w。D组：停注射AFB1后喂含Ge-132(1?000mg/kg体重)的饲料共2w。E组：阳性对照组，饲以基础饲料。所有动物从第3周起腹腔注射AFB1400μg/kg体重，用DMSO配成注射液，1次/d，每周5次，共2周。从第7周开始，喂含0.015%(2-AAF)的饲料2周，停2-AAF饲料3d后，全部处死。取血清及肝组织，测定其SOD活力的变化。 血清、肝组织SOD活力测定按文献[1]进行。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 Ge-132对肝癌细胞生长增殖的影响
从表1看出在62.5，125，250，500，1?000，1?250μg/ml浓度下，Ge-132对BEL-7402的生长抑制率随药物浓度的升高而升高，IC50为1?200μg/ml。
表1 G-132对肝癌细胞BEL-7402生长抑制率及IC50值 药物浓度(μg/ml)
生长抑制率(%)
IC50(μg/ml)
62.5
125
, 百拇医药
250
500
1000
1250
5.63
8.74
15.28
31.15
42.06
56.29
1200
注：表内各剂量的抑制率均为3次实验结果的平均值。
, 百拇医药 2.2 肝癌细胞BEL-7402能在软琼脂上形成60个集落，该细胞经Ge-132 250μg/ml作用24h后，接种于软琼脂，只有15个集落产生，反映了Ge-132对BEL-7402细胞具有诱导分化作用。
2.3 体内实验结果表明，A、B、C、D组的大鼠，不管是血清还是肝组织，其SOD活力均高于E组，且有显著性差异(P<0.05)。结果见表2。表2 大鼠体内肝组织、血清中SOD值情况比较 组别
动物数
肝组织(Iu/mg)
P肝组织
血清(Iu/ml)
P血清
PA～B<0.001
, http://www.100md.com
PA～B<0.005
A
12
0.293±0.021
PA～D<0.001
250.64±12.23
PA～D<0.001
PA～E<0.001
PA～E<0.001
B
12
, 百拇医药
0.244±0.031
PB～E<0.005
232.56±9.82
PB～E<0.001
C
12
0.261±0.017
PC～E<0.001
237.78±10.06
PC～E<0.001
D
, 百拇医药
11
0.237±0.026
PC～D<0.005
194.91±10.74
PC～D<0.001
E
11
0.205±0.027
PD～E<0.005
157.87±9.15
PC～E<0.001
, 百拇医药
注：在实验结束之前，D、E组各有一只动物死亡。
2.4 A、C、D三组比较，其SOD活力也有差别。A组最高，D组最低。其中A、C组与D组比较均有显著差异(P<0.005)。这预示着Ge-132的剂量可影响SOD活力。A、B两组比较，SOD活力也有显著差异(P<0.05)。这表明Ge-132的剂量可影响SOD活力。3 讨论
已有资料表明：本实验采用的AFB1致大鼠肝癌体内短期实验模型，其诱发肝癌的概率较大[2]。所以观察此过程的SOD活力变化，有助于进一步了解化学因素致癌的自由基机制及化学预防机制。
Ge-132在剂量较大(高于其他常用抗癌药物)时，才产生细胞毒作用，这与Ge-132毒性较小和Ge-132抗癌不是直接作用癌细胞的实验结果相吻合。而软琼脂集落实验结果表明，Ge-132具有抑制人肝癌细胞的生长增殖，这些结果都提示Ge-132作为肝癌化学预防的可能性。
, http://www.100md.com
Ge-132对由AFB1直接诱发肝癌是否具有抑制作用，其抑制作用是否与抗氧化作用有关，尚未有肯定报道。我们在AFB1诱发肝癌过程中发现，无论是摄毒前或摄毒后给予Ge-132的大鼠，其体内血清和肝组织的SOD活力均高于阳性对照组。且在毒性允许的范围内[3]，Ge-132的剂量较大时，抑制SOD活力降低的作用较强。这从一个侧面说明，Ge-132能消除诱癌过程中产生的自由基，其癌化学预防作用的机制之一可能是通过抗氧化作用来实现的。
从化学预防时间来考虑，大鼠体内SOD活力与摄入Ge-132的时间有关。摄入Ge-132时间越长，其SOD活力越高，抑制SOD活力降低的作用越大。而且当Ge-132应用于致癌物前时，抑制SOD活力降低的能力强于应用致癌物之后。这也证明长时间或提前服用Ge-132的抗氧化作用较强，防癌效果较好。这与Ge-132的预防作用优于治疗作用的结论相吻合。可以设想，若在黄曲霉毒素污染地区采用Ge-132进行药物干预，可起到一定的预防作用。
, 百拇医药
已有报道说明，Ge-132的抗癌作用与增强机体的免疫能力有关[4]，而通过本文实验结果，可提示，Ge-132的抗氧化作用与增强机体免疫力一样，将成为Ge-132癌化学预防的机制之一。
广西区卫生厅青年基金资助项目(青9207)
参考文献
1，侯华新，秦 箐，黎丹戎，等.黄曲霉毒素B1与超氧化物歧化酶的关系.广西医学院学报，1993；10(4)：351
2，严瑞琪，李 瑗，覃国忠，等.黄曲霉毒素B1致肝癌作用的短期体内实验长期观察大鼠肝细胞r-GT阳性灶 与原发性肝癌发生关系的研究.肝脏病学，1988；18(10)：11
3，张树功.有机锗化合物的毒性.化学通报，1993；(9)：11
4，Aso H.Induction of interferon and activation of NK cells and macrophages in mice by oral administration of Ge-132.an organic germanium compound.Microbiol Immunol,1985;29:65, http://www.100md.com