三氧化二砷对NCI-H69肺癌细胞增殖和凋亡的影响
作者:姚和瑞 向燕群 谢德荣 陈岱佳 曾宪平 何剑峰
单位:中山医科大学孙逸仙纪念医院 广州 510120
关键词:肺肿瘤;三氧化二砷;细胞凋亡;增殖细胞核抗原
中国现代医学杂志000602 目的:探讨三氧化二砷(AS2O3)对肺癌细胞株NCI-H69的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法:MTT法观察不同浓度AS2O3作用不同时间后的NCI-H69生长的影响;增殖细胞核抗原(PCNA)单抗LSAB免疫组化染色-流式细胞仪检测PCNA阳性细胞百分比;FTIC-TUNEL法-流式细胞仪检测细胞凋亡指数。结果:随AS2O3浓度增加和作用时间延长,NCI-H69肺癌细胞的细胞活度渐下降。随AS2O3浓度增加,PCNA阳性细胞百分比逐渐下降,而凋亡指数逐渐升高。结论:三氧化二砷可明显抑制肺癌细胞株NCI-H69的生长,并能诱导细胞凋亡,有治疗肺癌的潜在价值。
, 百拇医药
分类号 R734.2
PROLIFERATION INHIBITION AND
APOPTOSIS INDUCED BY ARSENIC TRIOXIDE ON
LUNG NEOPLASMS CELL LINE NCI-H69
Yao Herui,Xiang Yanqun,Xie Derong
(Department of Oncology, Sun Yat-sen Memorial Hospital,Sun Yat-sen Uni versity of Medical Sciences, Guangzhou Guangdong, 510120)
[Abstract] Objective: To observe the effect of proliferatio n inhibition and apop tosis indution of Arsenic Trioxide (AS2O3) on lung neoplasms cell line NCI-H69. Methods: MTT assay was used to observe the proliferation status. Flow cytometry was used to measure the percentage of proliferation cell nuclear antigen (PCNA) positive cell and apoptosis index. Results: AS2O3 could signific antly inhibit th e growth of NCI-H69 cell, this effect was dose and time dependent. The percentag e of PCNA positive cell was decreased gradually when concentration of AS2O3 was increased. The apoptosis index increased by the increasing of concentration of A S2O3. Conclusions: Arsenic Trioxide could inhibit the proliferat ion activity and induce apoptosis of lung neoplasms cell line NCI-H69. It may have potential val ue in the treatment of lung cancer.
, 百拇医药
Key words: Lung Neoplasms; Arsenic Trioxide; Proliferating Cell Nuclear Antigen; Apoptosis
肺癌发病率及死亡率逐年上升,80%的病人在第1次就诊时已属晚期阶段,失去外科手术机会。其总的治愈率不高。寻找新的治疗手段乃当务之急。诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的新思路。三氧化二砷已成功用于临床治疗急性早幼粒细胞白血病,其机制为诱导肿瘤细胞凋亡,其对肺癌临床是否有治疗作用,有待进一步研究。我们对此进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
肺癌细胞株NCI-H69由本院宋尔卫博士惠赠,传代培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中,培养条件为37℃,5%CO2。AS2O3注射液(5mmol×10ml)由本院陈其奎副教授惠赠,临用时用PBS稀释至所须浓度。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 细胞活度检测 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法:NCI-H69细胞接种于96孔板,100ul完全培养基中,每孔细胞数为7×103。分别加终浓度为0.5,1.0,2.0,4μmol/L的AS2O3。对照组和不同浓度组各设5个实验孔。分别培养1,3和6d后倾示培养基,加入10ul MTT/RBS(Boehringer Mannheim产品),37℃下孵育4h,加入含0.04M HCl的异丙醇100ul,振荡仪上振荡15min。酶标仪(SLT Spectra)上测定波长540nm的吸光度值(OD)换算成细胞活力:细胞活力=(实验组OD/对照组OD)×100%。
1.2.2 增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞检测 用PCNA单抗LSAB免疫组化染色-流式细胞仪法:细胞诱导处理方法同前,诱导3d后检测。置生长成片的单层细胞于冰上冷却,吸去培养液。4℃PBS洗涤。用含0.1%Triton X-100的2%PFA冰上固定30min。3%过氧化氢室温孵育10min,10%血清封闭。加入1∶25稀释的抗PCNA鼠抗人单抗(Santa Cruz产品)于培养皿中,使其恰好覆盖细胞,室温湿合内孵育1h。加入1∶40稀释的生物素标记羊抗鼠单抗(Santa Cruz),室温湿盒内孵育45min。PBS洗3次,加入荧光素标记链霉亲和素室温暗盒内孵育15min。PBS洗2次,使细胞重悬于PBS中,行流式细胞仪检测PCNA阳性细胞数,经LYSISⅡ软件(Becton dickinson产品)收集处理数据。
, 百拇医药
1.2.3 细胞凋亡检测 TUNEL染色-流式细胞仪检测:细胞诱导处理方法同前,培养3d后倾去培养基,PBS洗2次。加入细胞穿孔剂(0.1%TritonX-100+0.1%柠檬酸钠)于冰上孵育2min。PBS洗2次,加入TUNEL反应液(Boehringer Mannheim产品:含10.0ulTdT反应缓冲液、8.0ul荧光标记dUTP、32.25ul蒸馏水和0.75ulTdT),37℃下孵育60min。终止反应后PBS洗2次,重悬于PBS中,流式细胞检测,并用LYSIS Ⅱ软件进行分析。
2 结果
2.1 AS2O3对NCI-H69细胞株的生长抑制作用
AS2O3的作用呈剂量和时间依赖性,随AS2O3浓度升高和作用时间延长,细胞活力下降,具体见图1。
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图1 AS2O3对NCI-H69细胞株的生长抑制作用(n=5)
2.2 PCNA阳性细胞检测结果
流式细胞仪检测结果提示,AS2O3作用3d后,随AS2O3浓度升高,NCI-H69细胞系PCNA阳性细胞百分比逐渐下降(附表和图2)。
附表 NCI-H69细胞系PCNA阳性细胞百分数及凋亡指标数检测 (n=5) 指标
浓度(umol/L)
0
0.5
1.0
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2
4
PCNA阳性细胞百分数(%)
95.3±2.2
71.4±20.5
52.2±15.3
22.6±7.9
9.8±3.0
凋亡指数(AI%)
2.0±0.72
2.8±0.84
11.4±4.6
, 百拇医药
18.2±7.4
18.7±6.9
图2 NCI-H69细胞株流式的细胞仪检测结果(A,B)
2.3 三氧化二砷诱导后大肠癌细胞的凋亡指数(AI%)
随浓度增加,肺癌细胞株NCI-H69的凋亡指数(AI%)逐渐上升(见附表及图2)。
3 讨论
众多研究表明肺癌发生、发展不仅与肿瘤细胞分化异常、细胞增殖过渡有关,而且与细胞凋亡减少有关,近年随着对细胞凋亡机制的深入研究,发现目前临床应用的大多数抗肿瘤药物有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。设法诱导肿瘤细胞凋亡将成为新的治疗方向。近年来我国学者研究发现三氧化二砷(AS2O3)对急性早幼粒细胞白血病等多种肿瘤有良好效果[4~6]。在这些研究中,AS2O3一方面能抑制细胞增殖,另一方面还表现出诱导凋亡的作用。三氧化二砷在肿瘤治疗中显示了良好的前景,值得进一步研究。
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我们的初步研究发现,三氧化二砷能明显抑制脑癌细胞株NCI-H69的生长,其作用呈剂量及时间依赖性。进一步的实验结果提示,AS2O3作用后,随其浓度升高,NCI-H69细胞系PCNA阳性细胞数逐渐下降。PCNA又称周期素(Cyclin),是真核细胞DNA合成所必须的一种酸性核蛋白,分子量为36KD,近年研究表明它是NDA聚合酶的辅助蛋白之一,调控DNA合成,并在细胞周期中起着重要的调控作用[7]。PCNA在DNA合成的G1期开始增加,至S期达到高峰,G2/M期又迅速降低。已证明PCNA合成和表达与细胞增殖状态相关[8],其量的变化与DNA合成一致。由此,我们根据实验结果推测,在AS2O3作用下,参与DNA合成的PCNA被抑制,DNA合成受阻,这可能是三氧化二砷抑制肺癌细胞株NCI-H69生长的机制之一。
与在其他肿瘤中的研究结果相似[5,6,9],我们发现,三氧化二砷能诱导肺癌细胞株NCI-H69发生细胞凋亡,随浓度升高,凋亡指数逐年上升,提示其作用呈剂量依赖性。结合其他作者的研究,三氧化砷可能成为一种有效的凋亡诱导剂。
, http://www.100md.com
三氧化二砷临床应用的安全性已被众多的研究证实[1~3],CHEN报道[9]用AS2O3治疗16例维甲酸治疗后复发的APL患者,15例达到完全缓解,且无明显副作用。按他们所用的临床剂量,体内血药高峰浓度为4.2~6.7umol/L,多数时间血药浓度为0.5~3umol/L。在我们的体外研究中,0.5~4umol/L的AS2O3能有效抑制NCI-H69细胞的增殖,而正如前述,在体内应用时要达到这一浓度所用的临床剂量是安全的。
综合我们的研究结果,三氧化二砷能有效抑制NCI-H69肺癌细胞株的生长并诱导凋亡,有潜在治疗肺癌的价值,值得进一步进行研究。
参考文献
1,张 鹏,王树叶,胡龙虎,等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志,1996;17(2):58~60
, 百拇医药
2,李广华,宋春芳,苏宝库,等.肝叶切除配合中草药治疗原发性肝癌.实用外科杂志,1981;1:95~96
3,李元善,张亭栋,李成文,等.中西医结合治疗淋巴瘤27例.中华肿瘤杂志,1988;10:61~62
4,谭立军,陈新宇,张 岚,等.DMSO和AS2O3对人食管癌细胞增殖的抑制作用.上海第二医科大学学报,1999;19(1):5~8
5,涂水平,江石湖,谭继宏,等.氧化砷抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和诱导凋亡作用.世界华人消化杂志,1999;7(1):18~21
6,伍 钢,周云锋,应大明,等.三氧化二砷对神经母细胞瘤细胞增殖的影响.癌症,1999;18(3):263~265
7,Waga S,Hannon GJ,Beach D,et al.The p21 inhibitor of Cyclyin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA.Nature,1994;369(6481):574~578
, http://www.100md.com
8,Van-Dierendonck JH,Wijsman JH,Keijzer R,et al.Cellcycle-related staining patterns of anti-proliferating cell nuclear antigen monoclonal antibodies.Comparison with BrdUrd labeling and Ki-67 staining.Am J Pathol,1991;138(5):1165~1172
9,Chen GQ,Zhu J,Shi XG,et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (AS2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemiaL AS2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RArα proteins.Blood,1996;88(3):1052~1061
(2000-01-26收稿), 百拇医药
单位:中山医科大学孙逸仙纪念医院 广州 510120
关键词:肺肿瘤;三氧化二砷;细胞凋亡;增殖细胞核抗原
中国现代医学杂志000602 目的:探讨三氧化二砷(AS2O3)对肺癌细胞株NCI-H69的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法:MTT法观察不同浓度AS2O3作用不同时间后的NCI-H69生长的影响;增殖细胞核抗原(PCNA)单抗LSAB免疫组化染色-流式细胞仪检测PCNA阳性细胞百分比;FTIC-TUNEL法-流式细胞仪检测细胞凋亡指数。结果:随AS2O3浓度增加和作用时间延长,NCI-H69肺癌细胞的细胞活度渐下降。随AS2O3浓度增加,PCNA阳性细胞百分比逐渐下降,而凋亡指数逐渐升高。结论:三氧化二砷可明显抑制肺癌细胞株NCI-H69的生长,并能诱导细胞凋亡,有治疗肺癌的潜在价值。
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分类号 R734.2
PROLIFERATION INHIBITION AND
APOPTOSIS INDUCED BY ARSENIC TRIOXIDE ON
LUNG NEOPLASMS CELL LINE NCI-H69
Yao Herui,Xiang Yanqun,Xie Derong
(Department of Oncology, Sun Yat-sen Memorial Hospital,Sun Yat-sen Uni versity of Medical Sciences, Guangzhou Guangdong, 510120)
[Abstract] Objective: To observe the effect of proliferatio n inhibition and apop tosis indution of Arsenic Trioxide (AS2O3) on lung neoplasms cell line NCI-H69. Methods: MTT assay was used to observe the proliferation status. Flow cytometry was used to measure the percentage of proliferation cell nuclear antigen (PCNA) positive cell and apoptosis index. Results: AS2O3 could signific antly inhibit th e growth of NCI-H69 cell, this effect was dose and time dependent. The percentag e of PCNA positive cell was decreased gradually when concentration of AS2O3 was increased. The apoptosis index increased by the increasing of concentration of A S2O3. Conclusions: Arsenic Trioxide could inhibit the proliferat ion activity and induce apoptosis of lung neoplasms cell line NCI-H69. It may have potential val ue in the treatment of lung cancer.
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Key words: Lung Neoplasms; Arsenic Trioxide; Proliferating Cell Nuclear Antigen; Apoptosis
肺癌发病率及死亡率逐年上升,80%的病人在第1次就诊时已属晚期阶段,失去外科手术机会。其总的治愈率不高。寻找新的治疗手段乃当务之急。诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的新思路。三氧化二砷已成功用于临床治疗急性早幼粒细胞白血病,其机制为诱导肿瘤细胞凋亡,其对肺癌临床是否有治疗作用,有待进一步研究。我们对此进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料
肺癌细胞株NCI-H69由本院宋尔卫博士惠赠,传代培养于含10%小牛血清的DMEM培养基中,培养条件为37℃,5%CO2。AS2O3注射液(5mmol×10ml)由本院陈其奎副教授惠赠,临用时用PBS稀释至所须浓度。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 细胞活度检测 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法:NCI-H69细胞接种于96孔板,100ul完全培养基中,每孔细胞数为7×103。分别加终浓度为0.5,1.0,2.0,4μmol/L的AS2O3。对照组和不同浓度组各设5个实验孔。分别培养1,3和6d后倾示培养基,加入10ul MTT/RBS(Boehringer Mannheim产品),37℃下孵育4h,加入含0.04M HCl的异丙醇100ul,振荡仪上振荡15min。酶标仪(SLT Spectra)上测定波长540nm的吸光度值(OD)换算成细胞活力:细胞活力=(实验组OD/对照组OD)×100%。
1.2.2 增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞检测 用PCNA单抗LSAB免疫组化染色-流式细胞仪法:细胞诱导处理方法同前,诱导3d后检测。置生长成片的单层细胞于冰上冷却,吸去培养液。4℃PBS洗涤。用含0.1%Triton X-100的2%PFA冰上固定30min。3%过氧化氢室温孵育10min,10%血清封闭。加入1∶25稀释的抗PCNA鼠抗人单抗(Santa Cruz产品)于培养皿中,使其恰好覆盖细胞,室温湿合内孵育1h。加入1∶40稀释的生物素标记羊抗鼠单抗(Santa Cruz),室温湿盒内孵育45min。PBS洗3次,加入荧光素标记链霉亲和素室温暗盒内孵育15min。PBS洗2次,使细胞重悬于PBS中,行流式细胞仪检测PCNA阳性细胞数,经LYSISⅡ软件(Becton dickinson产品)收集处理数据。
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1.2.3 细胞凋亡检测 TUNEL染色-流式细胞仪检测:细胞诱导处理方法同前,培养3d后倾去培养基,PBS洗2次。加入细胞穿孔剂(0.1%TritonX-100+0.1%柠檬酸钠)于冰上孵育2min。PBS洗2次,加入TUNEL反应液(Boehringer Mannheim产品:含10.0ulTdT反应缓冲液、8.0ul荧光标记dUTP、32.25ul蒸馏水和0.75ulTdT),37℃下孵育60min。终止反应后PBS洗2次,重悬于PBS中,流式细胞检测,并用LYSIS Ⅱ软件进行分析。
2 结果
2.1 AS2O3对NCI-H69细胞株的生长抑制作用
AS2O3的作用呈剂量和时间依赖性,随AS2O3浓度升高和作用时间延长,细胞活力下降,具体见图1。
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图1 AS2O3对NCI-H69细胞株的生长抑制作用(n=5)
2.2 PCNA阳性细胞检测结果
流式细胞仪检测结果提示,AS2O3作用3d后,随AS2O3浓度升高,NCI-H69细胞系PCNA阳性细胞百分比逐渐下降(附表和图2)。
附表 NCI-H69细胞系PCNA阳性细胞百分数及凋亡指标数检测 (n=5) 指标
浓度(umol/L)
0
0.5
1.0
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2
4
PCNA阳性细胞百分数(%)
95.3±2.2
71.4±20.5
52.2±15.3
22.6±7.9
9.8±3.0
凋亡指数(AI%)
2.0±0.72
2.8±0.84
11.4±4.6
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18.2±7.4
18.7±6.9
图2 NCI-H69细胞株流式的细胞仪检测结果(A,B)
2.3 三氧化二砷诱导后大肠癌细胞的凋亡指数(AI%)
随浓度增加,肺癌细胞株NCI-H69的凋亡指数(AI%)逐渐上升(见附表及图2)。
3 讨论
众多研究表明肺癌发生、发展不仅与肿瘤细胞分化异常、细胞增殖过渡有关,而且与细胞凋亡减少有关,近年随着对细胞凋亡机制的深入研究,发现目前临床应用的大多数抗肿瘤药物有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。设法诱导肿瘤细胞凋亡将成为新的治疗方向。近年来我国学者研究发现三氧化二砷(AS2O3)对急性早幼粒细胞白血病等多种肿瘤有良好效果[4~6]。在这些研究中,AS2O3一方面能抑制细胞增殖,另一方面还表现出诱导凋亡的作用。三氧化二砷在肿瘤治疗中显示了良好的前景,值得进一步研究。
, 百拇医药
我们的初步研究发现,三氧化二砷能明显抑制脑癌细胞株NCI-H69的生长,其作用呈剂量及时间依赖性。进一步的实验结果提示,AS2O3作用后,随其浓度升高,NCI-H69细胞系PCNA阳性细胞数逐渐下降。PCNA又称周期素(Cyclin),是真核细胞DNA合成所必须的一种酸性核蛋白,分子量为36KD,近年研究表明它是NDA聚合酶的辅助蛋白之一,调控DNA合成,并在细胞周期中起着重要的调控作用[7]。PCNA在DNA合成的G1期开始增加,至S期达到高峰,G2/M期又迅速降低。已证明PCNA合成和表达与细胞增殖状态相关[8],其量的变化与DNA合成一致。由此,我们根据实验结果推测,在AS2O3作用下,参与DNA合成的PCNA被抑制,DNA合成受阻,这可能是三氧化二砷抑制肺癌细胞株NCI-H69生长的机制之一。
与在其他肿瘤中的研究结果相似[5,6,9],我们发现,三氧化二砷能诱导肺癌细胞株NCI-H69发生细胞凋亡,随浓度升高,凋亡指数逐年上升,提示其作用呈剂量依赖性。结合其他作者的研究,三氧化砷可能成为一种有效的凋亡诱导剂。
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三氧化二砷临床应用的安全性已被众多的研究证实[1~3],CHEN报道[9]用AS2O3治疗16例维甲酸治疗后复发的APL患者,15例达到完全缓解,且无明显副作用。按他们所用的临床剂量,体内血药高峰浓度为4.2~6.7umol/L,多数时间血药浓度为0.5~3umol/L。在我们的体外研究中,0.5~4umol/L的AS2O3能有效抑制NCI-H69细胞的增殖,而正如前述,在体内应用时要达到这一浓度所用的临床剂量是安全的。
综合我们的研究结果,三氧化二砷能有效抑制NCI-H69肺癌细胞株的生长并诱导凋亡,有潜在治疗肺癌的价值,值得进一步进行研究。
参考文献
1,张 鹏,王树叶,胡龙虎,等.三氧化二砷注射液治疗72例急性早幼粒细胞白血病.中华血液学杂志,1996;17(2):58~60
, 百拇医药
2,李广华,宋春芳,苏宝库,等.肝叶切除配合中草药治疗原发性肝癌.实用外科杂志,1981;1:95~96
3,李元善,张亭栋,李成文,等.中西医结合治疗淋巴瘤27例.中华肿瘤杂志,1988;10:61~62
4,谭立军,陈新宇,张 岚,等.DMSO和AS2O3对人食管癌细胞增殖的抑制作用.上海第二医科大学学报,1999;19(1):5~8
5,涂水平,江石湖,谭继宏,等.氧化砷抑制胃癌SGC-7901细胞增殖和诱导凋亡作用.世界华人消化杂志,1999;7(1):18~21
6,伍 钢,周云锋,应大明,等.三氧化二砷对神经母细胞瘤细胞增殖的影响.癌症,1999;18(3):263~265
7,Waga S,Hannon GJ,Beach D,et al.The p21 inhibitor of Cyclyin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA.Nature,1994;369(6481):574~578
, http://www.100md.com
8,Van-Dierendonck JH,Wijsman JH,Keijzer R,et al.Cellcycle-related staining patterns of anti-proliferating cell nuclear antigen monoclonal antibodies.Comparison with BrdUrd labeling and Ki-67 staining.Am J Pathol,1991;138(5):1165~1172
9,Chen GQ,Zhu J,Shi XG,et al.In vitro studies on cellular and molecular mechanisms of arsenic trioxide (AS2O3) in the treatment of acute promyelocytic leukemiaL AS2O3 induces NB4 cell apoptosis with downregulation of Bcl-2 expression and modulation of PML-RArα proteins.Blood,1996;88(3):1052~1061
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