应用MRI和电镜观察pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞移植对损伤脊髓的修复作用
作者：陈礼刚 曾凡俊 顾明 李讯 黄茂清 高立达 毛伯镛
单位：陈礼刚 曾凡俊 顾明 李讯 黄茂清(成都军区总医院神经外科 610083)；毛伯镛(华西医科大学附一院神经外科高立达)
关键词：基因修饰；雪旺氏细胞；脊髓损伤；MRI电镜
中国现代医学杂志000601 目的：探讨pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞(SC)对损伤脊髓再生修复的作用。方法：采用切割法制备健康SD大鼠脊髓半横断损伤模型，随机植入pSVPoMcat微基因修饰的SC(A组) ，高纯化的SC(B组)，仅植入明胶海绵的损伤对照组(C组)。受体鼠存活3月，行MRI扫描，取材作电镜(TEM)观察。结果：MRI发现：A组动物，脊髓损伤(SCI)区脊髓信号已基本恢复正常，B组动物未恢复正常，而C组动物，SCI区有软化灶形成。TEM发现：A组动物SCI区大量有髓和无髓轴突再生，SC增殖；B组动物SCI区，可见有髓轴突出再生部分SC已变性坏死；C组动物，SCI区未见有髓及无髓轴突。结论：pSVPoMcat微基因修饰SC移植对SCI有促进修复的作用，具有潜在临床意义。
, 百拇医药
分类号 R651.2
MRI AND ULTRASTUCTURAL OBSERVATION OF THE REPAIRING
EFFECTS OF TRANSPLANTED pSVPoMcat GENETICALLY
MODIFIED SCHWANN CELLS IN INJURIED SPINAL CORD IN RATS
Chen Ligang，Gao Lide，Zeng Fanjun
(Department of Neutosurgery, Chengdu Army General Hospital, Chengdu 610083)
[Abstract] Objective: To approach the effect of genetically modified Schwann cell (SC) with pSVPoMcat in the regeneration of spinal cord injury (SCI). Methods: Experimental animal was divided into three groups: the pSVPoMcat genetically mod ified SC implantation group (A group), SC implantation group (B group), and cont rol group (C group). After three month the presence of axonal regeneration of th e injuried spinal cord was examined by means of MRI and TEM. Results: [ WTBZ The result s were found: (1) The MRI spinal cord signal of SCI region has basic recovered i n A group and has not recoved completely in B group. There was a malacia focus i n C group. (2) The outcome of TBM observation in A group, B group was purificati on SC and regenerated axons, necrotic SC partially and regenerated axons, respec tively. Otherwise, there were not regenerated axons in C group. Conclusi ons: Thi s result is considered to promote axonal regeneration and potential for further clinical application.
, 百拇医药
Key words: Genetically; Modified Schwann cell; Spinal cord injur y; MRI; Electron microscopy
Tuszyski(1994～1996年)等[1～2]将人神经生长因子(Human Nerve groth factor,hNGF)基因通过逆转录病毒载体导入雪旺氏细胞内(Schwann Cell,SC)，再将其移植到脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)处，结果发现这些基因修饰细胞在脊髓内能稳定地表达NGF，进一步促进了轴索的再生。由于NGF对SC的分裂和增殖不起作用，且NGF对受损伤脊髓起生物学效应的浓度有一定限度，而SC植入脊髓后存活时间短，功能低下[3～4]。为此，我们在构建Po-5'-flanking介导的21.5Ku人髓鞘碱性蛋白(Human Myelin basic protein,hMBP)微基因(暂命名为pSVPoMcat)基础上，通过阳离子脂质体将其导入人SC(由3～4月龄，水囊引产正常健康胎儿坐骨神经纯化培养)，进行了pSVPoMcat微基因在SC中的表达研究，结果表明，pSVPoMcat微基因能增强SC的活性并延长其生存时间[5]，并进一步证实将pSVPoMcat微基因修饰的SC移植入受伤脊髓内，能促进SCI的再生修复和拟制SCI的细胞凋亡[6～7]。本研究将pSVPocat微基因修饰的SC移植入脊髓内试图通过核磁共振成像(MRI)和SCI区透射电镜(TEM)的观察，进一步探讨pSVPoMcat微基因修饰SC移植对SCI的修复作用，为基因治疗SCI提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 SCI模型与移植程序
成年SD大鼠30只，体积200～300g，雌雄不拘，由华西医大动物中心提供。按我们前有的方法[6，7]用自制的双刀片(刀距固定为2mm)制备受体脊髓半横断损伤模型(在T8平面制成2mm左半侧腔隙)后，将含pSVPoMcat的SC及高纯化SC(细胞悬液均为2.5×104cell/ul，在华西医大基础医学院重组DNA研究制备)的可吸性明胶海绵(南京第三制药厂，其大小与宿主腔隙大小一致)以及可吸性明胶海绵分别植入上述受体鼠(依次为A、B、C三组)，每组10只。
1.2 MRI检查
术后12周，将A、B、C三组动物用10g/L戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉后，作MRI扫描(美国Signa 0.5T全身超导MRI成像系统)。采用SE系列，3.0英寸表面线圈，TR4.00MS；TE20MS，thk/1.0sp,Fov8×8；2.56×192/3NEX，矢状位观察。
, 百拇医药
1.3 TEM观察
将上述动物，依次用生理盐水、4%多聚甲醛与1%戊醛做心脏灌注固定，取材脊髓全长。将各组T8平面SCI区标本在解剖镜下制成1mm的小块，再投入2.5%戊二醛溶液于4℃下浸洗2h，移入10%饿酸后固定1h。再按丙酮常规梯度脱水后，用LKB-5型超薄切片机切片厚约400～600A°的超薄切片，用醋酸钿染色，JEM～100SX电镜(JEM～100S日本)观察和照像。
2 结果
2.1 MRI扫描结果
A组：脊髓大小形态正常，其内未见异常信号区，仅有胸脊髓中段处，见背部有局限性软骨组织缺损，其内组织信号不均匀，皮肤连续性中断，为手术入路之损伤痕迹。B组：脊髓大小基本正常形态，于胸脊髓中仍见脊髓有长T1信号区，边界清晰，信号均匀，其大小约2mm，提示SCI后未完全恢复，椎旁组织正常。C组：于胸脊髓中份见长约3mmT1低信号，偏背侧，信号接近脑脊液，提示软化灶形成，皮肤连续中断，呈损伤后改变。
, 百拇医药
2.2 TEM观察
A组：可见较多细胞的有髓与无髓的轴突，内含较多线粒体结构，同时，按严恒林[8]TEM鉴别SC的标准，发现有大量增殖SC。尚有新生的血管清晰可见。B组：再生的神经轴突少，髓鞘结构较薄，轴突细，线粒体的含量较少。部分SC肿胀，有严重空泡样变性，部分细胞核消失，胞体溶解，巨噬细胞吞噬坏死变性的SC现象较普通。C组：未发现再生的有髓及无髓轴突，偶可见正常的轴、树突触。
3 讨论
我们首次采用MRI扫描来直观察基因修饰SC移植SCI再生修复的作用。将pSVPoMcat微基因修饰的SC植入成鼠脊髓断损伤模型，3月后，MRIT1加权像发现，A组的脊髓信号正常，其内无异常信号，B组脊髓内仍有2mm的异常信号，而C组则提示有软化灶形成。鉴于MRI检查在SCI有着重要的意义，Edward(1992)等[9]曾将胚胎脊髓组织植入半横断猫脊髓腔隙(T11～LI平面)后，用MRI进行扫描观察。他们发现MRI的扫描结果与其神经病学检查及功能恢复情况等相符。因此，可以认为pSVPoMcat微基因修饰SC移植SCI的修复有一定的促进作用。同时，也间接表明SC移植治疗SCI在一定程度上要优于胚胎脊髓组织。
, 百拇医药
TEM观察发现：A、B两组损伤区结构成分包括有再生的有髓和无髓神经纤维，SC以及突触结构，此外，还有星形细胞，正常的毛细血管等，提示SCI后经移植pSVPoMcat修饰SC 3月后，在移植区具有正常的神经结构特征。而C组则无上述结构特征，虽偶可见正常的轴、树突触，仅说明CNS本身确定具有内在的再生潜力，但为数甚少，难以达到恢复功能的作用。我们认为更有意义的是A组的有髓纤维及SC数目，均较B组多，且B组SC可见部分变性、坏死。这一方面说明，SC本身具有促进SCI再生修复作用，另一方面说明pSVPoMcat微基因有增强SC的活性并延长其生存时间，这与我们的体外试验相一致[5]。
CNS的可塑性研究提示，哺乳动物CNS具有再生能力。且神经元受损后的再生过程表现出分化、发育阶段逆转、是胚胎早期神经元发育、分化的重演[10]。Po-5'-flanking能够指导外源基因在SC中特异性表达[1，2]。21.5KuMBP基因不仅在胚胎早期神经元表达特别强，而且在胚胎早期成熟神经元中也有表达，能够参与髓鞘的发生与形成[11]。由于我们采用的微基因pSVPoMcat及SC均来源于胎儿(其基因结构同鼠接近，即有很好的同源性达90%以上，特别是21.5KuMBP是该蛋白家族中唯一含7个外显子编码的分子，其它分子均缺少1个或2个外显子编码序列)[1]。因此，本研究结果为临床运用同种靶基因修饰的自体SC移植治疗SCI提供了有意义的实验依据。结合我们前有的研究[6，7]，作者认为pSVPoMcat微基因修饰SC移植对SCI有促进修复的作用，具有潜在的临床意义。
, 百拇医药
参考文献
1，Tuszymski MH,Peterson DA,Jadodhara Rag,et al.Firbroblasts gentically modiffied to produce nerve growth factor induce robust neuritic ingrowth after grfting to the spinal cord.Exp Neurol,1994;126:4～14
2，Tuszynski MH,Gabriel K,Gage FH,et al.Nerve growth factor delivery by gene transfer induce differential outgrowth of sensory,motor and noradrenegic neurites after spinal cord ijury.Exp Neurol,1996;167：157～177
, 百拇医药
3，龚炎培，顾玉东，李青峰，等.神经再生条件液中6.16～10.26KD蛋白粗制品对雪旺氏细胞的动力学影响.中华手外科杂志，1997；13(1)：12～15
4，Xu Xiaoming.Roles of schwann cells in the repair and regeneration of the central nervous system.Chinese Journal of Neuroanatiomy,1996;12(4):291～302
5，陈礼刚，高立达，胡威夷，等.pSVPoMcat微基因修饰在雪旺氏细胞中的表达.中华实验外科杂志，1998；15(6)：584～586
6，陈礼刚，高立达，毛伯镛，等.pSVPoMcat微基因修饰在雪旺氏细胞脊髓内移植对损伤脊髓再生的影响.中国修复重建外科杂志，1998；12(5)：257～259
, 百拇医药
7，陈礼刚，高立达，曾凡俊，等.移植pSVPoMcat微基因修饰在雪旺氏细胞对脊髓损伤后细胞凋的影响.中华创伤杂志，1998；14(3)：157～159
8，严恒林，沈馨亚，刘才栋，等.脊神经来源的雪旺氏细胞的体外培养.解剖学杂志，1995；18(3)：203
9，Edwad D,Wirth BA,Daniel P,et al.In vivo mangetic resouance imaging of fetal cat neural tissue transplants in the adult cat spinal cord.J Neurosurg,1992;76(1):261～274
10，Brown MC.The cellular basis segmentation in the developing hinlbrain.TINS,1984;7(1):10
11，Campagonni AT.Molecular biolegy of myelin protein from the central nervous systm.J Neurochem,1988;5(1):514
12，程汉华，陈俊杰.髓鞘碱性蛋白基因结构与功能.中华医学遗传杂志，1993；10(5)：348～351
(1999-12-29收稿), http://www.100md.com
单位：陈礼刚 曾凡俊 顾明 李讯 黄茂清(成都军区总医院神经外科 610083)；毛伯镛(华西医科大学附一院神经外科高立达)
关键词：基因修饰；雪旺氏细胞；脊髓损伤；MRI电镜
中国现代医学杂志000601 目的：探讨pSVPoMcat微基因修饰雪旺氏细胞(SC)对损伤脊髓再生修复的作用。方法：采用切割法制备健康SD大鼠脊髓半横断损伤模型，随机植入pSVPoMcat微基因修饰的SC(A组) ，高纯化的SC(B组)，仅植入明胶海绵的损伤对照组(C组)。受体鼠存活3月，行MRI扫描，取材作电镜(TEM)观察。结果：MRI发现：A组动物，脊髓损伤(SCI)区脊髓信号已基本恢复正常，B组动物未恢复正常，而C组动物，SCI区有软化灶形成。TEM发现：A组动物SCI区大量有髓和无髓轴突再生，SC增殖；B组动物SCI区，可见有髓轴突出再生部分SC已变性坏死；C组动物，SCI区未见有髓及无髓轴突。结论：pSVPoMcat微基因修饰SC移植对SCI有促进修复的作用，具有潜在临床意义。
, 百拇医药
分类号 R651.2
MRI AND ULTRASTUCTURAL OBSERVATION OF THE REPAIRING
EFFECTS OF TRANSPLANTED pSVPoMcat GENETICALLY
MODIFIED SCHWANN CELLS IN INJURIED SPINAL CORD IN RATS
Chen Ligang，Gao Lide，Zeng Fanjun
(Department of Neutosurgery, Chengdu Army General Hospital, Chengdu 610083)
[Abstract] Objective: To approach the effect of genetically modified Schwann cell (SC) with pSVPoMcat in the regeneration of spinal cord injury (SCI). Methods: Experimental animal was divided into three groups: the pSVPoMcat genetically mod ified SC implantation group (A group), SC implantation group (B group), and cont rol group (C group). After three month the presence of axonal regeneration of th e injuried spinal cord was examined by means of MRI and TEM. Results: [ WTBZ The result s were found: (1) The MRI spinal cord signal of SCI region has basic recovered i n A group and has not recoved completely in B group. There was a malacia focus i n C group. (2) The outcome of TBM observation in A group, B group was purificati on SC and regenerated axons, necrotic SC partially and regenerated axons, respec tively. Otherwise, there were not regenerated axons in C group. Conclusi ons: Thi s result is considered to promote axonal regeneration and potential for further clinical application.
, 百拇医药
Key words: Genetically; Modified Schwann cell; Spinal cord injur y; MRI; Electron microscopy
Tuszyski(1994～1996年)等[1～2]将人神经生长因子(Human Nerve groth factor,hNGF)基因通过逆转录病毒载体导入雪旺氏细胞内(Schwann Cell,SC)，再将其移植到脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)处，结果发现这些基因修饰细胞在脊髓内能稳定地表达NGF，进一步促进了轴索的再生。由于NGF对SC的分裂和增殖不起作用，且NGF对受损伤脊髓起生物学效应的浓度有一定限度，而SC植入脊髓后存活时间短，功能低下[3～4]。为此，我们在构建Po-5'-flanking介导的21.5Ku人髓鞘碱性蛋白(Human Myelin basic protein,hMBP)微基因(暂命名为pSVPoMcat)基础上，通过阳离子脂质体将其导入人SC(由3～4月龄，水囊引产正常健康胎儿坐骨神经纯化培养)，进行了pSVPoMcat微基因在SC中的表达研究，结果表明，pSVPoMcat微基因能增强SC的活性并延长其生存时间[5]，并进一步证实将pSVPoMcat微基因修饰的SC移植入受伤脊髓内，能促进SCI的再生修复和拟制SCI的细胞凋亡[6～7]。本研究将pSVPocat微基因修饰的SC移植入脊髓内试图通过核磁共振成像(MRI)和SCI区透射电镜(TEM)的观察，进一步探讨pSVPoMcat微基因修饰SC移植对SCI的修复作用，为基因治疗SCI提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 SCI模型与移植程序
成年SD大鼠30只，体积200～300g，雌雄不拘，由华西医大动物中心提供。按我们前有的方法[6，7]用自制的双刀片(刀距固定为2mm)制备受体脊髓半横断损伤模型(在T8平面制成2mm左半侧腔隙)后，将含pSVPoMcat的SC及高纯化SC(细胞悬液均为2.5×104cell/ul，在华西医大基础医学院重组DNA研究制备)的可吸性明胶海绵(南京第三制药厂，其大小与宿主腔隙大小一致)以及可吸性明胶海绵分别植入上述受体鼠(依次为A、B、C三组)，每组10只。
1.2 MRI检查
术后12周，将A、B、C三组动物用10g/L戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔麻醉后，作MRI扫描(美国Signa 0.5T全身超导MRI成像系统)。采用SE系列，3.0英寸表面线圈，TR4.00MS；TE20MS，thk/1.0sp,Fov8×8；2.56×192/3NEX，矢状位观察。
, 百拇医药
1.3 TEM观察
将上述动物，依次用生理盐水、4%多聚甲醛与1%戊醛做心脏灌注固定，取材脊髓全长。将各组T8平面SCI区标本在解剖镜下制成1mm的小块，再投入2.5%戊二醛溶液于4℃下浸洗2h，移入10%饿酸后固定1h。再按丙酮常规梯度脱水后，用LKB-5型超薄切片机切片厚约400～600A°的超薄切片，用醋酸钿染色，JEM～100SX电镜(JEM～100S日本)观察和照像。
2 结果
2.1 MRI扫描结果
A组：脊髓大小形态正常，其内未见异常信号区，仅有胸脊髓中段处，见背部有局限性软骨组织缺损，其内组织信号不均匀，皮肤连续性中断，为手术入路之损伤痕迹。B组：脊髓大小基本正常形态，于胸脊髓中仍见脊髓有长T1信号区，边界清晰，信号均匀，其大小约2mm，提示SCI后未完全恢复，椎旁组织正常。C组：于胸脊髓中份见长约3mmT1低信号，偏背侧，信号接近脑脊液，提示软化灶形成，皮肤连续中断，呈损伤后改变。
, 百拇医药
2.2 TEM观察
A组：可见较多细胞的有髓与无髓的轴突，内含较多线粒体结构，同时，按严恒林[8]TEM鉴别SC的标准，发现有大量增殖SC。尚有新生的血管清晰可见。B组：再生的神经轴突少，髓鞘结构较薄，轴突细，线粒体的含量较少。部分SC肿胀，有严重空泡样变性，部分细胞核消失，胞体溶解，巨噬细胞吞噬坏死变性的SC现象较普通。C组：未发现再生的有髓及无髓轴突，偶可见正常的轴、树突触。
3 讨论
我们首次采用MRI扫描来直观察基因修饰SC移植SCI再生修复的作用。将pSVPoMcat微基因修饰的SC植入成鼠脊髓断损伤模型，3月后，MRIT1加权像发现，A组的脊髓信号正常，其内无异常信号，B组脊髓内仍有2mm的异常信号，而C组则提示有软化灶形成。鉴于MRI检查在SCI有着重要的意义，Edward(1992)等[9]曾将胚胎脊髓组织植入半横断猫脊髓腔隙(T11～LI平面)后，用MRI进行扫描观察。他们发现MRI的扫描结果与其神经病学检查及功能恢复情况等相符。因此，可以认为pSVPoMcat微基因修饰SC移植SCI的修复有一定的促进作用。同时，也间接表明SC移植治疗SCI在一定程度上要优于胚胎脊髓组织。
, 百拇医药
TEM观察发现：A、B两组损伤区结构成分包括有再生的有髓和无髓神经纤维，SC以及突触结构，此外，还有星形细胞，正常的毛细血管等，提示SCI后经移植pSVPoMcat修饰SC 3月后，在移植区具有正常的神经结构特征。而C组则无上述结构特征，虽偶可见正常的轴、树突触，仅说明CNS本身确定具有内在的再生潜力，但为数甚少，难以达到恢复功能的作用。我们认为更有意义的是A组的有髓纤维及SC数目，均较B组多，且B组SC可见部分变性、坏死。这一方面说明，SC本身具有促进SCI再生修复作用，另一方面说明pSVPoMcat微基因有增强SC的活性并延长其生存时间，这与我们的体外试验相一致[5]。
CNS的可塑性研究提示，哺乳动物CNS具有再生能力。且神经元受损后的再生过程表现出分化、发育阶段逆转、是胚胎早期神经元发育、分化的重演[10]。Po-5'-flanking能够指导外源基因在SC中特异性表达[1，2]。21.5KuMBP基因不仅在胚胎早期神经元表达特别强，而且在胚胎早期成熟神经元中也有表达，能够参与髓鞘的发生与形成[11]。由于我们采用的微基因pSVPoMcat及SC均来源于胎儿(其基因结构同鼠接近，即有很好的同源性达90%以上，特别是21.5KuMBP是该蛋白家族中唯一含7个外显子编码的分子，其它分子均缺少1个或2个外显子编码序列)[1]。因此，本研究结果为临床运用同种靶基因修饰的自体SC移植治疗SCI提供了有意义的实验依据。结合我们前有的研究[6，7]，作者认为pSVPoMcat微基因修饰SC移植对SCI有促进修复的作用，具有潜在的临床意义。
, 百拇医药
参考文献
1，Tuszymski MH,Peterson DA,Jadodhara Rag,et al.Firbroblasts gentically modiffied to produce nerve growth factor induce robust neuritic ingrowth after grfting to the spinal cord.Exp Neurol,1994;126:4～14
2，Tuszynski MH,Gabriel K,Gage FH,et al.Nerve growth factor delivery by gene transfer induce differential outgrowth of sensory,motor and noradrenegic neurites after spinal cord ijury.Exp Neurol,1996;167：157～177
, 百拇医药
3，龚炎培，顾玉东，李青峰，等.神经再生条件液中6.16～10.26KD蛋白粗制品对雪旺氏细胞的动力学影响.中华手外科杂志，1997；13(1)：12～15
4，Xu Xiaoming.Roles of schwann cells in the repair and regeneration of the central nervous system.Chinese Journal of Neuroanatiomy,1996;12(4):291～302
5，陈礼刚，高立达，胡威夷，等.pSVPoMcat微基因修饰在雪旺氏细胞中的表达.中华实验外科杂志，1998；15(6)：584～586
6，陈礼刚，高立达，毛伯镛，等.pSVPoMcat微基因修饰在雪旺氏细胞脊髓内移植对损伤脊髓再生的影响.中国修复重建外科杂志，1998；12(5)：257～259
, 百拇医药
7，陈礼刚，高立达，曾凡俊，等.移植pSVPoMcat微基因修饰在雪旺氏细胞对脊髓损伤后细胞凋的影响.中华创伤杂志，1998；14(3)：157～159
8，严恒林，沈馨亚，刘才栋，等.脊神经来源的雪旺氏细胞的体外培养.解剖学杂志，1995；18(3)：203
9，Edwad D,Wirth BA,Daniel P,et al.In vivo mangetic resouance imaging of fetal cat neural tissue transplants in the adult cat spinal cord.J Neurosurg,1992;76(1):261～274
10，Brown MC.The cellular basis segmentation in the developing hinlbrain.TINS,1984;7(1):10
11，Campagonni AT.Molecular biolegy of myelin protein from the central nervous systm.J Neurochem,1988;5(1):514
12，程汉华，陈俊杰.髓鞘碱性蛋白基因结构与功能.中华医学遗传杂志，1993；10(5)：348～351
(1999-12-29收稿), http://www.100md.com