PCR查咽拭子物早期诊断儿童肺炎支原体感染
作者：董学君 阎晓勤
单位：浙江省绍兴市人民医院 312000
关键词：肺炎支原体；聚合酶链反应；呼吸道感染
中国现代医学杂志000644 分类号 R563.1
PCR技术可早期诊断肺炎支原体(Mycoplesma Pneumonic,MP)感染[2]，本文应用PCR技术查1?083例呼吸道感染儿童的咽拭子物，观察PCR早期诊断MP感染的价值，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
本院住院或门诊疑为MP感染者，咽拭子取材，共1?083例(男664例，女419例)。年龄4月～14岁。
, 百拇医药
1.2 标本处理
咽拭子洗涤在2ml生理盐水的取样试管中，取1ml置1.5ml Eppendorf管，15?000rpm离心10min，弃上清液。沉淀物中加50μl含Tritonx-100的裂解液，100℃煮沸10min。12?000rpm离心5min，上清液作PCR扩增模板。PCR试剂(杭州高乐生化制品有限公司提供)。
1.3 PCR扩增
含PCR反应体系21μl的反应管中，加4μl经处理标本上清液，离心片刻，置PCR扩增仪(MJPTC-200型，带热盖)扩增。扩增条件：94℃2min变性，后94℃30s，55℃30s，72℃1min，共循环35次，72℃延伸5min。每批均设阴、阳性对照。行2次PCR者，第2次扩增的反应体系与第1次相同，加入2μl第1次PCR产物为模板和2μl双蒸水，扩增条件同第1次。
1.4 产物鉴定
, 百拇医药
扩增产物在2%琼脂糖凝胶(含EB)100伏电泳，30min后，胶置紫外分析仪上观察结果。144bp处有明亮条带者为阳性。
2 结果
附表 MP感染的PCR检测结果 例(%) 内容
MP阳性数
MP阴性数
总测数
男
148(22.29)
516(77.71)
664
女
, http://www.100md.com
68(16.23)
351(83.77)
419
总计
126(19.95)
867(80.05)
1083
MP感染中男性(22.29%)高于女性(16.23%)，统计学处理：χ2＝5.91，P<0.05。
108例标本在第1次PCR后，再行第2次PCR，结果阳性率从21.30%(23/108)提高到34.26%(37/108)，2次间的阳性率差异具显著意义(P<0.05)。第2次PCR时，设阴性对照，结果证明无污染。3 讨论
, http://www.100md.com
本文PCR检测1?083例呼吸道感染儿童咽拭子物中MP阳性率19.95%。而文献报道的阳性率为26%[1]和75.7%，阳性率差异可能与流行周期的出没有关，还可能与PCR污染产生假阳性有关。抽样108例，作第2次PCR扩增，排除有污染，MP的阳性率有显著提高，说明PCR检测中假阴性现象严重。第1次和第2次PCR仅模板物不同，表明模板物是产生假阴性的原因所在。可能是由于咽拭子物中富含蛋白类物质，裂解后仍包裹目的DNA或其他PCR抑制因子的存在。用蛋白酶裂解标本，可明显提高PCR阳性率[2]，能表明主要是标本中蛋白类物质所致。因此，避免假阴性可从标本的裂解着手。现行检测MP的标本处理很少用蛋白酶裂解标本，采用2次PCR或套式PCR可能是一种好的对策。本组资料显示，男性中MP感染率(22.29%)高于女性中(16.23%)，有显著性差异(χ2＝5.91，P<0.05)，可能提示男女性间易感性不同或其它未知原因的影响。
综上所述，PCR技术是理想的支原体肺炎早期诊断方法。PCR法的缺点大多可从实验设计和操作过程中以克服。发展PCR定量检测MP将更具临床意义。
参考文献
1，李延壮，杨洪江，张 烨，等.聚合酶链式反应诊断肺炎支原体特异、灵敏性及咽拭子物标本检测研究.实用儿科杂志，1993；8(3)：211
2，黄庆华，卢 强，孙利伟，等.不同裂解液处理支原体肺炎临床标本对聚合酶链反应的影响，中华医学检验杂志，1995；18(2)：104, 百拇医药
单位：浙江省绍兴市人民医院 312000
关键词：肺炎支原体；聚合酶链反应；呼吸道感染
中国现代医学杂志000644 分类号 R563.1
PCR技术可早期诊断肺炎支原体(Mycoplesma Pneumonic,MP)感染[2]，本文应用PCR技术查1?083例呼吸道感染儿童的咽拭子物，观察PCR早期诊断MP感染的价值，结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
本院住院或门诊疑为MP感染者，咽拭子取材，共1?083例(男664例，女419例)。年龄4月～14岁。
, 百拇医药
1.2 标本处理
咽拭子洗涤在2ml生理盐水的取样试管中，取1ml置1.5ml Eppendorf管，15?000rpm离心10min，弃上清液。沉淀物中加50μl含Tritonx-100的裂解液，100℃煮沸10min。12?000rpm离心5min，上清液作PCR扩增模板。PCR试剂(杭州高乐生化制品有限公司提供)。
1.3 PCR扩增
含PCR反应体系21μl的反应管中，加4μl经处理标本上清液，离心片刻，置PCR扩增仪(MJPTC-200型，带热盖)扩增。扩增条件：94℃2min变性，后94℃30s，55℃30s，72℃1min，共循环35次，72℃延伸5min。每批均设阴、阳性对照。行2次PCR者，第2次扩增的反应体系与第1次相同，加入2μl第1次PCR产物为模板和2μl双蒸水，扩增条件同第1次。
1.4 产物鉴定
, 百拇医药
扩增产物在2%琼脂糖凝胶(含EB)100伏电泳，30min后，胶置紫外分析仪上观察结果。144bp处有明亮条带者为阳性。
2 结果
附表 MP感染的PCR检测结果 例(%) 内容
MP阳性数
MP阴性数
总测数
男
148(22.29)
516(77.71)
664
女
, http://www.100md.com
68(16.23)
351(83.77)
419
总计
126(19.95)
867(80.05)
1083
MP感染中男性(22.29%)高于女性(16.23%)，统计学处理：χ2＝5.91，P<0.05。
108例标本在第1次PCR后，再行第2次PCR，结果阳性率从21.30%(23/108)提高到34.26%(37/108)，2次间的阳性率差异具显著意义(P<0.05)。第2次PCR时，设阴性对照，结果证明无污染。3 讨论
, http://www.100md.com
本文PCR检测1?083例呼吸道感染儿童咽拭子物中MP阳性率19.95%。而文献报道的阳性率为26%[1]和75.7%，阳性率差异可能与流行周期的出没有关，还可能与PCR污染产生假阳性有关。抽样108例，作第2次PCR扩增，排除有污染，MP的阳性率有显著提高，说明PCR检测中假阴性现象严重。第1次和第2次PCR仅模板物不同，表明模板物是产生假阴性的原因所在。可能是由于咽拭子物中富含蛋白类物质，裂解后仍包裹目的DNA或其他PCR抑制因子的存在。用蛋白酶裂解标本，可明显提高PCR阳性率[2]，能表明主要是标本中蛋白类物质所致。因此，避免假阴性可从标本的裂解着手。现行检测MP的标本处理很少用蛋白酶裂解标本，采用2次PCR或套式PCR可能是一种好的对策。本组资料显示，男性中MP感染率(22.29%)高于女性中(16.23%)，有显著性差异(χ2＝5.91，P<0.05)，可能提示男女性间易感性不同或其它未知原因的影响。
综上所述，PCR技术是理想的支原体肺炎早期诊断方法。PCR法的缺点大多可从实验设计和操作过程中以克服。发展PCR定量检测MP将更具临床意义。
参考文献
1，李延壮，杨洪江，张 烨，等.聚合酶链式反应诊断肺炎支原体特异、灵敏性及咽拭子物标本检测研究.实用儿科杂志，1993；8(3)：211
2，黄庆华，卢 强，孙利伟，等.不同裂解液处理支原体肺炎临床标本对聚合酶链反应的影响，中华医学检验杂志，1995；18(2)：104, 百拇医药