杀莠素A对兔软骨细胞增殖和产生NO的影响
作者：王杰松 张俊平 张珉 钱定华
单位：王杰松(第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)；张俊平(第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)；张珉(第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)；钱定华(第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)
关键词：杀莠素A；软骨细胞；IL-1；增殖；NO
第二军医大学学报000622 【摘要】 目的：研究杀莠素A对IL-1抑制软骨细胞增殖和诱导NO产生的作用。方法：IL-1单独或与杀莠素A共育于软骨细胞，用结晶紫染色法测定软骨细胞增殖，Griess法测定NO的产生。结果：IL-1抑制软骨细胞增殖，杀莠素A剂量依赖地逆转IL-1的作用。杀莠素A还能剂量依赖地抑制IL-1诱导软骨细胞产生NO。结论: 杀莠素A逆转IL-1抑制软骨细胞增殖的作用可能是通过NO介导的。
, http://www.100md.com
【中图分类号】 R 593.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 0258-879X(2000)06-0572-03
Effects of herbimycin A on proliferation and nitric oxide production stimulated by interleukin-1 in chondrocytes
WANG Jie-Song，ZHANG Jun-Ping，ZHANG Min，QIAN Ding-Hua
(Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, 百拇医药
【ABSTRACT】 Objective: To study the effects of herbimycin A on proliferation and NO production stimulated by IL-1 in chondrocytes. Methods: IL-1 alone or in combination with herbimycin A was administered.Chondrocytes proliferation was detected by crystal violet dying method and NO production was detected by Griess method. Results: IL-1 inhibited chondrocytes proliferation. Herbimycin A dose-dependently reversed the effect. Also herbimycin A could inhibit NO production induced by IL-1. Conclusion: The reversing effect of herbimycin A on chondrocytes proliferation may be mediated by NO.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 herbimycin A; chondrocytes; IL-1; proliferation; NO
一些关节炎症性疾病，如类风湿性关节炎(RA)，在炎症后期以关节软骨破坏为主要特征。关节软骨破坏与炎性细胞因子刺激有关，IL-1是关节炎滑液中主要炎性细胞因子之一。IL-1在关节炎期间异常升高[1]，从而抑制软骨细胞增殖。IL-1还能刺激软骨细胞产生NO[2]，而NO具有较强的抑制软骨细胞增殖的作用。NO供体硝普钠(SNP)在体外能模拟IL-1的抗软骨细胞增殖的作用，IL-1抑制软骨细胞增殖可能是由NO介导的[3]。
杀莠素A是从链霉素菌株分离得到的抗生素，是一种特异性酪氨酸激酶(PTK)抑制剂。杀莠素A能抑制基质金属蛋白酶(MMPs)和IL-1的产生，从而具有保护软骨的作用。又由于杀莠素A能通过抑制PTK活性从而抑制鼠巨噬细胞和胰岛细胞产生NO[4]，所以我们选用杀莠素A进行研究，观察其对IL-1诱导兔关节软骨细胞产生NO和抑制软骨细胞增殖的作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 主要试剂 IL-1由日本Dainippon公司惠赠。杀莠素A、盐酸萘乙二胺、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶为Sigma公司产品。DMEM培养液、Ham F-12培养液为Gibco产品。结晶紫、磺胺购于上海化学试剂站。新生小牛血清(NBS)系杭州四季青生物工程材料研究所生产。杀莠素A溶于二甲基亚砜(DMSO)配成母液，再用培养液稀释至所需浓度。
1.2 软骨细胞分离培养[5] 取6～8周龄的新西兰大白兔(本校实验动物中心提供)，敲头处死，截取肩关节、肘关节和髋关节，用15号解剖刀削下胫骨近端，股骨远端及近端、肱骨近端关节表面软骨，用0.05%透明质酸酶常温消化3 min。将软骨切成1 mm×1 mm×1 mm左右小块，在37℃ 磁力搅拌100 r/min条件下，依次用0.2%胰酶30 min， 0.15%胶原酶60 min消化，1 500 r/min离心5 min，收集细胞。然后把细胞放入含10% NBS的Ham F-12培养液中，在37℃， 5%CO2的孵箱中培养，3 d后换液，以后隔日换液。待细胞长成单层后，加0.15%胰蛋白酶消化，用含10% FBS的DMEM培养液进行传代培养，每3 d换液1次。
, 百拇医药
1.3 NO的产生和测定[3] 取长成单层的第一代细胞，加0.15%胰蛋白酶消化5～10 min，加无酚红DMEM和NBS吹打，将细胞稀释至5×105个/ml。含10%NBS，每孔100 μl加到96孔板中，培养24 h后，倾去培养液。加不同浓度的IL-1和杀莠素A共100 μl，含5% NBS，用无酚红DMEM或含最高浓度(0.05%)的DMSO作对照，继续作用48 h。吸取50 μl上清，加50 μl 1%磺胺、0.1%盐酸萘乙二胺的25% H3PO4液，室温反应5 min，550 nm处测定D值，以NaNO2为标准，求出NO含量。
1.4 结晶紫染色法测软骨细胞增殖[6] 取原代软骨细胞，用DMEM稀释成1×105个/ml细胞悬液，含10%NBS，每孔100 μl加到96孔板中，培养3 d后，倾去培养液。加入IL-1和不同浓度杀莠素A的含5%NBS的培养液，继续培养5 d，用结晶紫染液染色20 min。洗去未被结合的染液，37℃干燥，每孔加100 μl结晶紫提取液，漩涡振荡，595 nm处测定D值。
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1.5 抑制率计算公式 抑制率(%)＝〔(对照-样品)/(对照-空白)〕×100%。
1.6 统计学处理 显著性检验用非配对t检验。
2 结 果
2.1 IL-1对软骨细胞增殖的影响 IL-1能抑制软骨细胞增殖，在1×104 U/L即达非常显著水平，在1×105 U/L时抑制率达38.94%，剂量再增加并不明显增加抑制水平(表1)。
2.2 杀莠素A对IL-1抑制软骨细胞增殖的作用 根据以上实验结果，选择1×105 U/L IL-1刺激。杀莠素A能浓度依赖地对抗IL-1对软骨细胞增殖的抑制作用，在0.5 μmol/L使细胞增殖恢复到85%的水平(表2)。
2.3 杀莠素A抑制软骨细胞产生NO 杀莠素 A (0.125～1 μmol/L)对IL-1(2×104 U/L)诱导软骨细胞产生NO有浓度依赖性抑制作用，在0.5和1 μmol/L时抑制率分别为77.3%和86.9%(表3)。
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表 1 IL-1对软骨细胞增殖的影响
Tab 1 Effects of IL-1 on chondrocytes proliferation(n=3，
±s) Group
D(595)
Inhibition(%)
Control
1.13±0.04
0.00
IL-1(zB/U.L-1)
, 百拇医药
1×102
1.13±0.10
0.00
1×103
1.02±0.14
9.73
1×104
0.75±0.02**
33.63
1×105
0.69±0.07**
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38.94
1×106
0.68±0.03**
39.82
**P<0.01 vs control表 2 杀莠素A对IL-1 (1×105 U/L)抑制软骨细胞增殖的作用
Tab 2 Effects of herbimycin A on chondrocytes
proliferation inhibited by IL-1 (1×105 U/L)(n=3，±s) Group
, 百拇医药
D(595)
Inhibition(%)
Mediuma
0.83±0.02
Control
0.63±0.02
0.0
Herbimycin A(cB/ μmol.L-1)
0.0625
0.70±0.04
, 百拇医药
35.0
0.125
0.72±0.05*
45.0
0.25
0.76±0.02**
65.0
0.5
0.80±0.04**
85.0
a With the highest concentration of DMSO;*P<0.05,*P<0.01 vs control表 3 杀莠素A对IL-1(2×104 U/L)诱导软骨细胞产生NO的影响
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Tab 3 Effects of herbimycin A on NO production of
chondrocytes stimulated by IL-1(2×104 U/L)(n=3，±s) Group
NO(cB/μmol.L-1)
Inhibition(%)
DMEMa
11.5±1.6
Control
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45.8±2.8
0.0
Herbimycin A(cB/μmol.L-1)
0.125
35.2±2.9*
30.9
0.25
23.5±2.5**
65.0
0.5
, 百拇医药
19.3±2.4**
77.3
1.0
16.0±1.8**
86.9
a With the highest concentration of DMSO;*P<0.05,**P<0.01 vs control3 讨 论
多种关节炎症性疾病都以软骨破坏为主要特征，关节软骨破坏与滑液中炎性细胞因子IL-1有着密切的关系。本实验结果表明，IL-1具有抑制软骨细胞增殖的作用，杀莠素A能浓度依赖地逆转IL-1的这种作用。由于NO具有较强的抑制软骨细胞增殖作用，为了研究杀莠素A是否是通过NO途径起作用，我们观察了杀莠素A对IL-1刺激软骨细胞产生NO的作用。结果表明，杀莠素A对IL-1刺激软骨细胞产生NO有剂量依赖的抑制作用。又由于杀莠素A是PTK特异性抑制剂，主要抑制pp60v-src[7]。资料表明，杀莠素A可以通过抑制PTK活性从而抑制鼠巨噬细胞和胰岛细胞产生NO，所以杀莠素A可能是通过PTK抑制IL-1诱导软骨细胞产生NO。从以上结果可以看出，杀莠素A能对抗IL-1抑制软骨细胞增殖，其作用可能是通过抑制NO产生介导的。
, 百拇医药
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39670837)
【作者简介】王杰松(1966～)，男(汉族)，博士生，主管药师【参考文献】
[1] Firestein GS, Alvaro-Garcia JM, Maki R. Quantitative analysis of cytokine gene expression in rheumatoid arthritis[J]. J Immunol, 1990, 144(9): 3347-3353.
[2] 王杰松,张俊平,张 珉,等.芹菜素抑制IL-1和脂多糖诱导软骨细胞产生NO[J].第二军医大学学报,1999,20(6):362-364.
[3] Franciscon J, Blanco R, Lotz M. IL-1 induced nitric oxide inhibits chondrocyte proliferation via PGE2[J]. Exp Cell Res, 1995, 218(1):319-325.
, 百拇医药
[4] Dong Z, Qi X, Xie K, et al. Protein tyrosine kinase inhibitors decrease induction of nitric oxide sythase activity in lipopolysaccharide-responsive and lipopolysaccharide-nonresponsive murine macrophages[J]. J Immunol,1993, 151 (5): 2717-2724.
[5] 魏西秦,曹峻岭,熊咏民.兔软骨细胞培养方法研究[J].中国地方病学杂志,1987,6(2):89-92.
[6] 张俊平,胡振林,冯增辉,等.水飞蓟宾对小鼠肝脏炎症损伤和肿瘤坏死因子的产生及活性的影响[J].药学学报,1996,31(8):577-580.
[7] 刘景生 主编.细胞信息与生物医学丛书[M].北京：北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1998.268.
【收稿日期】1999-12-27
【修回日期】2000-04-24, 百拇医药
单位：王杰松(第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)；张俊平(第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)；张珉(第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)；钱定华(第二军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)
关键词：杀莠素A；软骨细胞；IL-1；增殖；NO
第二军医大学学报000622 【摘要】 目的：研究杀莠素A对IL-1抑制软骨细胞增殖和诱导NO产生的作用。方法：IL-1单独或与杀莠素A共育于软骨细胞，用结晶紫染色法测定软骨细胞增殖，Griess法测定NO的产生。结果：IL-1抑制软骨细胞增殖，杀莠素A剂量依赖地逆转IL-1的作用。杀莠素A还能剂量依赖地抑制IL-1诱导软骨细胞产生NO。结论: 杀莠素A逆转IL-1抑制软骨细胞增殖的作用可能是通过NO介导的。
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【中图分类号】 R 593.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 0258-879X(2000)06-0572-03
Effects of herbimycin A on proliferation and nitric oxide production stimulated by interleukin-1 in chondrocytes
WANG Jie-Song，ZHANG Jun-Ping，ZHANG Min，QIAN Ding-Hua
(Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, 百拇医药
【ABSTRACT】 Objective: To study the effects of herbimycin A on proliferation and NO production stimulated by IL-1 in chondrocytes. Methods: IL-1 alone or in combination with herbimycin A was administered.Chondrocytes proliferation was detected by crystal violet dying method and NO production was detected by Griess method. Results: IL-1 inhibited chondrocytes proliferation. Herbimycin A dose-dependently reversed the effect. Also herbimycin A could inhibit NO production induced by IL-1. Conclusion: The reversing effect of herbimycin A on chondrocytes proliferation may be mediated by NO.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 herbimycin A; chondrocytes; IL-1; proliferation; NO
一些关节炎症性疾病，如类风湿性关节炎(RA)，在炎症后期以关节软骨破坏为主要特征。关节软骨破坏与炎性细胞因子刺激有关，IL-1是关节炎滑液中主要炎性细胞因子之一。IL-1在关节炎期间异常升高[1]，从而抑制软骨细胞增殖。IL-1还能刺激软骨细胞产生NO[2]，而NO具有较强的抑制软骨细胞增殖的作用。NO供体硝普钠(SNP)在体外能模拟IL-1的抗软骨细胞增殖的作用，IL-1抑制软骨细胞增殖可能是由NO介导的[3]。
杀莠素A是从链霉素菌株分离得到的抗生素，是一种特异性酪氨酸激酶(PTK)抑制剂。杀莠素A能抑制基质金属蛋白酶(MMPs)和IL-1的产生，从而具有保护软骨的作用。又由于杀莠素A能通过抑制PTK活性从而抑制鼠巨噬细胞和胰岛细胞产生NO[4]，所以我们选用杀莠素A进行研究，观察其对IL-1诱导兔关节软骨细胞产生NO和抑制软骨细胞增殖的作用。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 IL-1由日本Dainippon公司惠赠。杀莠素A、盐酸萘乙二胺、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、透明质酸酶为Sigma公司产品。DMEM培养液、Ham F-12培养液为Gibco产品。结晶紫、磺胺购于上海化学试剂站。新生小牛血清(NBS)系杭州四季青生物工程材料研究所生产。杀莠素A溶于二甲基亚砜(DMSO)配成母液，再用培养液稀释至所需浓度。
1.2 软骨细胞分离培养[5] 取6～8周龄的新西兰大白兔(本校实验动物中心提供)，敲头处死，截取肩关节、肘关节和髋关节，用15号解剖刀削下胫骨近端，股骨远端及近端、肱骨近端关节表面软骨，用0.05%透明质酸酶常温消化3 min。将软骨切成1 mm×1 mm×1 mm左右小块，在37℃ 磁力搅拌100 r/min条件下，依次用0.2%胰酶30 min， 0.15%胶原酶60 min消化，1 500 r/min离心5 min，收集细胞。然后把细胞放入含10% NBS的Ham F-12培养液中，在37℃， 5%CO2的孵箱中培养，3 d后换液，以后隔日换液。待细胞长成单层后，加0.15%胰蛋白酶消化，用含10% FBS的DMEM培养液进行传代培养，每3 d换液1次。
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1.3 NO的产生和测定[3] 取长成单层的第一代细胞，加0.15%胰蛋白酶消化5～10 min，加无酚红DMEM和NBS吹打，将细胞稀释至5×105个/ml。含10%NBS，每孔100 μl加到96孔板中，培养24 h后，倾去培养液。加不同浓度的IL-1和杀莠素A共100 μl，含5% NBS，用无酚红DMEM或含最高浓度(0.05%)的DMSO作对照，继续作用48 h。吸取50 μl上清，加50 μl 1%磺胺、0.1%盐酸萘乙二胺的25% H3PO4液，室温反应5 min，550 nm处测定D值，以NaNO2为标准，求出NO含量。
1.4 结晶紫染色法测软骨细胞增殖[6] 取原代软骨细胞，用DMEM稀释成1×105个/ml细胞悬液，含10%NBS，每孔100 μl加到96孔板中，培养3 d后，倾去培养液。加入IL-1和不同浓度杀莠素A的含5%NBS的培养液，继续培养5 d，用结晶紫染液染色20 min。洗去未被结合的染液，37℃干燥，每孔加100 μl结晶紫提取液，漩涡振荡，595 nm处测定D值。
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1.5 抑制率计算公式 抑制率(%)＝〔(对照-样品)/(对照-空白)〕×100%。
1.6 统计学处理 显著性检验用非配对t检验。
2 结 果
2.1 IL-1对软骨细胞增殖的影响 IL-1能抑制软骨细胞增殖，在1×104 U/L即达非常显著水平，在1×105 U/L时抑制率达38.94%，剂量再增加并不明显增加抑制水平(表1)。
2.2 杀莠素A对IL-1抑制软骨细胞增殖的作用 根据以上实验结果，选择1×105 U/L IL-1刺激。杀莠素A能浓度依赖地对抗IL-1对软骨细胞增殖的抑制作用，在0.5 μmol/L使细胞增殖恢复到85%的水平(表2)。
2.3 杀莠素A抑制软骨细胞产生NO 杀莠素 A (0.125～1 μmol/L)对IL-1(2×104 U/L)诱导软骨细胞产生NO有浓度依赖性抑制作用，在0.5和1 μmol/L时抑制率分别为77.3%和86.9%(表3)。
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表 1 IL-1对软骨细胞增殖的影响
Tab 1 Effects of IL-1 on chondrocytes proliferation(n=3，
±s) GroupD(595)
Inhibition(%)
Control
1.13±0.04
0.00
IL-1(zB/U.L-1)
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1×102
1.13±0.10
0.00
1×103
1.02±0.14
9.73
1×104
0.75±0.02**
33.63
1×105
0.69±0.07**
, http://www.100md.com
38.94
1×106
0.68±0.03**
39.82
**P<0.01 vs control表 2 杀莠素A对IL-1 (1×105 U/L)抑制软骨细胞增殖的作用
Tab 2 Effects of herbimycin A on chondrocytes
proliferation inhibited by IL-1 (1×105 U/L)(n=3，
±s) Group, 百拇医药
D(595)
Inhibition(%)
Mediuma
0.83±0.02
Control
0.63±0.02
0.0
Herbimycin A(cB/ μmol.L-1)
0.0625
0.70±0.04
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35.0
0.125
0.72±0.05*
45.0
0.25
0.76±0.02**
65.0
0.5
0.80±0.04**
85.0
a With the highest concentration of DMSO;*P<0.05,*P<0.01 vs control表 3 杀莠素A对IL-1(2×104 U/L)诱导软骨细胞产生NO的影响
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Tab 3 Effects of herbimycin A on NO production of
chondrocytes stimulated by IL-1(2×104 U/L)(n=3，
±s) GroupNO(cB/μmol.L-1)
Inhibition(%)
DMEMa
11.5±1.6
Control
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45.8±2.8
0.0
Herbimycin A(cB/μmol.L-1)
0.125
35.2±2.9*
30.9
0.25
23.5±2.5**
65.0
0.5
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19.3±2.4**
77.3
1.0
16.0±1.8**
86.9
a With the highest concentration of DMSO;*P<0.05,**P<0.01 vs control3 讨 论
多种关节炎症性疾病都以软骨破坏为主要特征，关节软骨破坏与滑液中炎性细胞因子IL-1有着密切的关系。本实验结果表明，IL-1具有抑制软骨细胞增殖的作用，杀莠素A能浓度依赖地逆转IL-1的这种作用。由于NO具有较强的抑制软骨细胞增殖作用，为了研究杀莠素A是否是通过NO途径起作用，我们观察了杀莠素A对IL-1刺激软骨细胞产生NO的作用。结果表明，杀莠素A对IL-1刺激软骨细胞产生NO有剂量依赖的抑制作用。又由于杀莠素A是PTK特异性抑制剂，主要抑制pp60v-src[7]。资料表明，杀莠素A可以通过抑制PTK活性从而抑制鼠巨噬细胞和胰岛细胞产生NO，所以杀莠素A可能是通过PTK抑制IL-1诱导软骨细胞产生NO。从以上结果可以看出，杀莠素A能对抗IL-1抑制软骨细胞增殖，其作用可能是通过抑制NO产生介导的。
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【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39670837)
【作者简介】王杰松(1966～)，男(汉族)，博士生，主管药师【参考文献】
[1] Firestein GS, Alvaro-Garcia JM, Maki R. Quantitative analysis of cytokine gene expression in rheumatoid arthritis[J]. J Immunol, 1990, 144(9): 3347-3353.
[2] 王杰松,张俊平,张 珉,等.芹菜素抑制IL-1和脂多糖诱导软骨细胞产生NO[J].第二军医大学学报,1999,20(6):362-364.
[3] Franciscon J, Blanco R, Lotz M. IL-1 induced nitric oxide inhibits chondrocyte proliferation via PGE2[J]. Exp Cell Res, 1995, 218(1):319-325.
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[4] Dong Z, Qi X, Xie K, et al. Protein tyrosine kinase inhibitors decrease induction of nitric oxide sythase activity in lipopolysaccharide-responsive and lipopolysaccharide-nonresponsive murine macrophages[J]. J Immunol,1993, 151 (5): 2717-2724.
[5] 魏西秦,曹峻岭,熊咏民.兔软骨细胞培养方法研究[J].中国地方病学杂志,1987,6(2):89-92.
[6] 张俊平,胡振林,冯增辉,等.水飞蓟宾对小鼠肝脏炎症损伤和肿瘤坏死因子的产生及活性的影响[J].药学学报,1996,31(8):577-580.
[7] 刘景生 主编.细胞信息与生物医学丛书[M].北京：北京医科大学.中国协和医科大学联合出版社,1998.268.
【收稿日期】1999-12-27
【修回日期】2000-04-24, 百拇医药