基于pMTR1质粒的转基因小鼠突变研究模型的建立
作者：卢洋 黎怀星 李建秀 傅继梁
单位：卢洋(第二军医大学基础 医学部医学遗传学教研室，上海 200433)；黎怀星(第二军医大学基础 医学部医学遗传学教研室，上海 200433)；李建秀(细胞生物学教研室)；傅继梁(第二军医大学基础 医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
关键词：转基因小鼠；诱变；lac Ⅰ基因；质粒
第二军医大学学报000611 【摘要】 目的：建立在基因组中整合有pMTR1质粒的C57BL/6转基因小鼠家系，为体内基因突变研究提供有效的动物模型。方法：利用分子克隆技术构建pMTR1质粒。将其线性化后，用显微注射法注射入572只C57BL/6小鼠受精卵，再将它们分别移入45只受体母鼠的输卵管中，共产仔44只，存活35只，采用PCR，PCR-Southern和基因组Southern杂交三级筛选法鉴定子代小鼠。以4只经基因组Southern杂交证实在基因组DNA中整合有多拷贝结构完整的pMTR1质粒的小鼠作Founder小鼠，进行转基因小鼠的建系工作。对每个Founder小鼠已有的F1代及F2代转基因小鼠的基因组DNA进行pMTR1质粒回收实验。结果：从转基因小鼠基因组中可以回收出结构、功能完整的pMTR1质粒。 结论：(1)建立了在基因组DNA中整合有pMTR1质粒的C57BL/6转基因小鼠家系；(2)该转基因小鼠能用作哺乳动物体内突变研究模型。
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【中图分类号】 R 392.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 0258-879X(2000)06-0537-04
Development of pMTR1 plasmid-based transgenic mice model for studying gene mutation in vivo
LU Yang，LI Huai-Xing，FU Ji-Liang
(Department of Medical Genetics, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
LI Jian-Xiu
, 百拇医药
(Department of Cell Biology)
【ABSTRACT】 Objective: To establish C57BL/6 transgenic mice lineages containing pMTR1 plasmids as an efficient animal model for studying gene mutation in vivo. Methods: The linearized pMTR1 DNAs, constructed by molecular cloning, were injected into 572 fertilized eggs of C57BL/6 mice by microinjection. The manipulated embryos were transferred into the oviducts of 45 pseudopregnant mice respectively, from which 35 offsprings were obtained. The genomic DNAs of these offsprings were analyzed with PCR and genomic Southern blotting. Four mice whose genomes integrated with copies of intact pMTR1 vectors were chosen as founders to establish transgenic mice lineages. The recovery of pMTR1 plasmid were conducted on the genomic DNAs of F1 or F2 transgenic offsprings. Results: It was showed that intact and functional pMTR1 plasmid could be efficiently recovered from the genomic DNAs of these mice. Conclusion: (1) The transgenic mouse lineages containing copies of a stably integrated pMTR1 plasmid is established. (2) The transgenic mice are suitable models for studying gene mutation in vivo.
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【KEY WORDS】 transgenic mice; mutagenesis; gene, lac Ⅰ; plasmid
转基因小鼠突变研究模型是检测哺乳动物体内组织特异性基因突变的一个快速、有效的系统。目前注册商标为BigBlueTM，MutaTMMouse和Xenomouse 的一些小鼠模型已经进入商业销售渠道[1～3]。其中前两种模型因采用λ噬菌体为载体，在载体回收时受到体外包装分子大小的限制，对基因组片段大小依赖性较大；而后者虽以质粒为载体克服了这些缺点，但它是以较长的lac Z基因(3 087 bp)作突变靶基因，因而在进行突变子的序列分析时，工作量较大，而且从蓝色的野生型菌落中选择白色或无色的突变型菌落，易产生实验误差，从而增加了工作难度。黎怀星等在国内率先建立了以pSPORT1质粒为载体和以lacⅠ基因为诱变靶基因的转基因小鼠(D6-2)突变模型[4～6]，但该小鼠模型的遗传背景是我国的昆明种小白鼠，而目前所报道的大多数哺乳动物体内的突变研究数据都来源于C57BL/6小鼠体内。为了增加数据的可比性，本研究建立了几个以pMTR1 质粒为载体的C57BL/6转基因小鼠家系，它们除了具有D6-2小鼠的优点[5,6]外，还因pMTR1质粒具有incA不相容性位点而可以增加质粒产量，提高载体回收效率；此外，该转基因小鼠的遗传背景是C57BL/6，因而更有利于突变数据的比较分析。
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1 材料和方法
1.1 主要材料 C57BL/6小鼠由第二军医大学实验动物中心提供。pSPORT1和pSPORT2质粒以及DH10B宿主菌均购自Gibco BRL公司。标记探针的试剂盒(rediprime DNA labeling system)购自Amersham公司；lacⅠ基因的特异性PCR引物由Sangon生物工程公司合成，其序列为：P1: 5′-AGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGG-3′，P2: 5′-CTTTC-GCGGTATGGCATGATAGCGC-3′，能扩增出468 bp长的DNA片段；QIAquick Gel Extract Kit购自QIAgene公司；其他酶等试剂主要来源于Promega公司和Gibco BRL公司；α-32P-dCTP核素购自北京亚辉生物技术公司。
1.2 pMTR1载体的构建和鉴定 将pSPORT2和pSPORT1质粒DNA同时用EcoRⅠ+ Sca Ⅰ酶切，然后分别回收来源于pSPORT2的1.3 kb DNA片段和来源于pSPORT1的2.9 kb载体片段，并用T4 DNA连接酶进行连接重组。对获得的质粒DNA进行酶切鉴定和乳糖操纵子功能鉴定，然后将结构和功能正确的重组质粒命名为pMTR1，以Rca Ⅰ酶切线性化，用QIAquick Gel Extract Kit 回收、纯化4.2 kb片段，并溶于适量缓冲液中(5 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，0.2 mmol/L EDTA)至浓度为1～2 μg/ml，以备显微注射用。
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1.3 转基因小鼠的制备 实验用供体和受体母鼠的制备，受精卵的采集，显微注射和移植均按Hogan等[7]的方法进行。
1.4 仔鼠的鉴定 采用PCR, PCR-Southern杂交和基因组DNA的Southern杂交三级筛选法鉴定。
1.4.1 小鼠基因组DNA制备 取2周龄幼鼠的1.5 cm尾尖用蛋白酶K法[8]提取基因组DNA。
1.4.2 PCR分析 PCR循环条件94℃ 30 s，65℃ 45 s，72℃ 1 min共进行30个循环。采用质粒DNA和普通小鼠基因组DNA分别作阳性和阴性对照。扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.4.3 Southern杂交分析 将20 μg经96 U EcoR Ⅰ酶完全酶切后的小鼠基因组DNA 或PCR产物按常规方法进行电泳和转膜[8]后，于68℃杂交液(7% SDS, 0.5 mol/L NaH2PO4, 0.5 mol/L Na2HPO4,10 mmol/L EDTA, 1% BSA)中预杂交6 h，然后加入探针(取25 ng线性化的pMTR1 DNA作模板，采用Rediprime DNA Labeling System制备α-32P-dCTP核素标记的探针)，继续杂交16 h，将pMTR1质粒DNA和普通小鼠基因组DNA或其PCR产物分别用作阳性和阴性对照。用洗膜液A(0.5% BSA, 5% SDS, 1 mmol/L EDTA, 40 mmol/L Na2HPO4, 40 mmol/L NaH2PO4)于室温洗膜2次共30 min，再用洗膜液 B(1% SDS, 1 mmol/L EDTA, 40 mmol/L Na2HPO4, 40 mmol/L NaH2 PO4)于68℃ 30 min洗1次，最后用0.1×SSC漂洗, 按常规进行压片和放射自显影。
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1.5 从转基因小鼠的基因组DNA中回收pMTR1载体 取10 μg 经EcoRⅠ完全酶切的小鼠基因组DNA，75℃处理10 min，用双蒸水稀释至449 μl，加入50 μl 10×Buffer，1 μl(3U)T4 DNA连接酶，于16℃连接12 h。取5 μl连接环化的DNA液转化DH10B感受态细胞，涂布含X-gal的 Ampr LB琼脂平板，37℃孵育16～24 h。计数转化平板上的菌落数，确定回收效率，并随机挑取单菌落进行酶切鉴定，同时观察有无突变子(平板上的蓝色克隆)出现。
2 结果和讨论
本研究共对572只C57BL/6小鼠受精卵注射了线性化pMTR1质粒DNA，将注射后的受精卵分别移植入45只受体母鼠的输卵管中，共产仔44只，其中35只存活。经PCR和PCR-Southern杂交检测，有11只小鼠(M0-1～M0-11)呈阳性(图1)。为了证实pMTR1质粒在小鼠基因组中的结构完整性，对这11只小鼠基因组DNA进一步作Southern杂交，结果仅4只(M0-1, M0-2, M0-3, M0-4)为阳性(图2)。我们认为导致这种差异的主要原因有两方面：一是PCR结果可能有假阳性；二是基因组DNA的Southern杂交不如PCR灵敏，使得部分阳性小鼠在鉴定时呈阴性。从基因的整合效率来看，本研究中线性化的pMTR1质粒的整合率为11.4%(4/35)，与文献报道的10%～20%相当[7,9]。
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图 1 部分转基因小鼠PCR-Southern杂交结果
Fig 1 PCR-Southern blotting results of partial transgenic mice
1: pMTR1; 2: H2O; 3: Normal C57BL/6; 4a: M0-16; 5a～17a: M0-1～ M0-13;4b, 5b: M11-9, M11-10;
6b～9b: M11-1～ M11-4; 10b: M11-11; 11b,12b: M11-21, M11-22(M11-n: F1 generation of M0-1)
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图 2 部分转基因小鼠基因组DNA的 Southern杂交结果
Fig 2 Genomic Southern blotting results of partial transgenic mice
1: pMTR1; 2: Normal C57BL/6; 3a～5a: M12-8～M12-10(M12-n: F2 generation of M0-1); 6a: M12-4; 7a: M12-6;8a～10a: M12-12～M12-14; 3b: M0-4; 4b: M0-3; 5b: M0-2; 6b, 7b: M11-21, M11-22; 8b: M11-10; 9b: M11-19;3c～6c: M31-1～M31-4(M31-n: F1 generation of M0-3); 3d: M0-5; 4d: M0-10; 5d: M0-1; 3e～5e: M21-1～ M21-3(M21-n: F1 generation of M0-2)
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将经过基因组DNA Southern 杂交鉴定是阳性的这4只小鼠用作Founder小鼠，进行转基因小鼠的建系工作。目前除了M0-4 Founder小鼠尚无子代外，其余3只 Founder小鼠均已获得了F1子代小鼠，其中M0-1 Founder小鼠已有F2子代小鼠。对所有这些子代小鼠以PCR，PCR-Southern杂交和基因组DNA Southern杂交进行检测 (图1和图2是部分小鼠的检测结果)，结果表明：M0-1 Founder小鼠的22只子一代小鼠中有5只为阳性(M11-3, M11-10, M11-19, M11-21, M11-22)，转基因遗传率为22.7%(5/22)；在33只子二代小鼠中有8只为阳性(M12-4, M12-6, M12-8～M12-10, M12-12～M12-14)，转基因遗传率为24.2%(8/33)；M0-2 Founder小鼠的3只子一代小鼠中2只为阳性(M21-2, M21-3)，转基因遗传率为66.7%(2/3)；M0-3 Founder小鼠的8只子一代小鼠中3只为阳性(M31-1, M31-2, M31-4)，转基因遗传率为37.5%(3/8)。这些结果说明，pMTR1转基因在Founder小鼠中是可以稳定遗传至子代的。
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整合于小鼠基因组DNA中的pMTR1质粒是否结构和功能完整，能否有效地回收出来是决定该转基因小鼠能否用于突变研究的关键。本研究通过酶切环化方法分别从M0-1 Founder鼠的子一代和子二代小鼠、M0-2和M0-3 Founder鼠的子一代小鼠的基因组DNA中成功地回收出了pMTR1质粒，平均回收效率为219 cfu/μg DNA(表1)。对回收出的质粒采用限制性内切酶进行结构鉴定的结果表明，所回收质粒的大小和结构与pMTR1质粒完全相同，没有出现明显的缺失、插入和重排(图3)。进一步将回收质粒转化DH10B宿主菌，涂布含或不含 IPTG，而具有X-gal的Ampr的LB平板，分析lacⅠ基因的功能。结果表明，回收质粒中lac Zα报告基因的表达受lacⅠ基因产物的调节，能进行α互补，具有完整的乳糖操纵子功能(表2)。
表 1 转基因小鼠基因组DNAs中质粒的回收效率
, 百拇医药 Tab 1 Frequency of plasmids rescued from
transgenic mice genomic DNAs Origin of DNAs
Number
of colonies
DNA
(cfu/μg)
Nunmber
of mutants
F1 generation of M0-1
76
, 百拇医药
253
0
F1 generation of M0-2
42
140
0
F1 generation of M0-3
82
273
0
F2 generation of M0-1
, 百拇医药
63
210
0
Average
65.75
219
0
图 3 从转基因小鼠基因组DNA中回收的
质粒的酶切鉴定结果
Fig 3 Restriction map of plasmid rescued
from transgenic mice genomic DNAs
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1: pMTR1 plasmid DNA; 2: pMTR1/EcoRⅠ; 3: pMTR1/RcaⅠ; 4: pMTR1/EcoR Ⅰ+ScaⅠ; 5: a Plasmid/EcoRⅠ; 6: a Plasmid/RcaⅠ; 7: a Plasmid/EcoR Ⅰ+ScaⅠ; 8: λ/Hind Ⅲ DNA marker; a: Plasmids rescued from genomic DNA of the transgenic mice
表 2 回收质粒中lacⅠ 靶基因的功能鉴定结果
Tab 2 Functional analysis of lacⅠ target
gene in the rescued plasmids Origin of
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colonies
aIPTG
bX-gal
cAmpR
Color of
colonies
dPlasmid/DH10B
+
+
+
Blue
, 百拇医药
dPlasmid/DH10B…
+
+
White
pMTR1/DH10B
+
+
+
Blue
pMTR1/DH10B…
+
+
White
, 百拇医药
a：Isopropyl-β-D-thiogalactoside； b：5-Bromo-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactoside； c： Ampicillin resistance； d： Plasmids rescued from genomic DNAs of the transgenic mice
综上所述，本研究已成功地建立了基于pMTR1质粒的C57BL/6转基因小鼠家系，整合于转基因小鼠基因组中的pMTR1质粒结构是完整的，功能是正常的，并能有效地被回收出来，因此该转基因小鼠是能用于体内突变研究的。【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39570400)；军队“九五”重 点攻关课题基金资助项目(96Z033)
【作者简介】卢洋(1972～)，男(汉族)，博士生，现在第二军医 大学科研部国际合作肿瘤研究所
【参考文献】
, 百拇医药
[1] Gossen JA, de Leeuw WJ, Tan CH, et al. Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: a model for studying mutations in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86(20):7971-7975.
[2] Kohler SW, Provost GS, Fieck A, et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lac Ⅰ gene in transgenic mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1991,88(18):7958-7962.
[3] Gossen JA, Martus HJ, Wei JY, et al. Spontaneous and X-ray-induced deletion mutations in a Lac Z plasmid-based transgenic mouse model[J]. Mutat Res, 1995,331(1):89-97.
, 百拇医药
[4] Li HX, Li JX, Yang H, et al. Establishment of transgenic mouse lineages containing copies of an integrated pSPORT1 plasmid[J]. J Med Coll PLA, 1998,13(2):88-92.
[5] Li HX, Yang H, Li JX, et al. EMS-induced mutant frequency and spectrum in bone marrow of D6-2 transgenic mice[J]. Sci China， 1998,41(3):286-292.
[6] 黎怀星，李建秀，杨 桦，等.基于pSPORT1质粒的转基因小鼠家系的建立[J].第二军医大学学报，1998，19(1)：9-12.
[7] Hogan B, Beddington R, Costantini F, et al. Manipulating the mouse embryo, a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold spring harbor laboratory press， 1994.1-20, 58-76.
[8] 萨姆布鲁克J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯T, 著.金冬雁，黎孟枫 译. 分子克隆实验指南[M]. 第2版. 北京：科学出版社，1992. 463-468,474-495.
[9] 刘德培. 转基因动物. 见:卢圣栋 主编. 现代分子生物学实验技术[M]. 北京： 高等教育出版社，1993.518-541.
【收稿日期】1999-12-02
【修回日期】2000-04-28, 百拇医药
单位：卢洋(第二军医大学基础 医学部医学遗传学教研室，上海 200433)；黎怀星(第二军医大学基础 医学部医学遗传学教研室，上海 200433)；李建秀(细胞生物学教研室)；傅继梁(第二军医大学基础 医学部医学遗传学教研室，上海 200433)
关键词：转基因小鼠；诱变；lac Ⅰ基因；质粒
第二军医大学学报000611 【摘要】 目的：建立在基因组中整合有pMTR1质粒的C57BL/6转基因小鼠家系，为体内基因突变研究提供有效的动物模型。方法：利用分子克隆技术构建pMTR1质粒。将其线性化后，用显微注射法注射入572只C57BL/6小鼠受精卵，再将它们分别移入45只受体母鼠的输卵管中，共产仔44只，存活35只，采用PCR，PCR-Southern和基因组Southern杂交三级筛选法鉴定子代小鼠。以4只经基因组Southern杂交证实在基因组DNA中整合有多拷贝结构完整的pMTR1质粒的小鼠作Founder小鼠，进行转基因小鼠的建系工作。对每个Founder小鼠已有的F1代及F2代转基因小鼠的基因组DNA进行pMTR1质粒回收实验。结果：从转基因小鼠基因组中可以回收出结构、功能完整的pMTR1质粒。 结论：(1)建立了在基因组DNA中整合有pMTR1质粒的C57BL/6转基因小鼠家系；(2)该转基因小鼠能用作哺乳动物体内突变研究模型。
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【中图分类号】 R 392.2 【文献标识码】 A
【文章编号】 0258-879X(2000)06-0537-04
Development of pMTR1 plasmid-based transgenic mice model for studying gene mutation in vivo
LU Yang，LI Huai-Xing，FU Ji-Liang
(Department of Medical Genetics, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
LI Jian-Xiu
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(Department of Cell Biology)
【ABSTRACT】 Objective: To establish C57BL/6 transgenic mice lineages containing pMTR1 plasmids as an efficient animal model for studying gene mutation in vivo. Methods: The linearized pMTR1 DNAs, constructed by molecular cloning, were injected into 572 fertilized eggs of C57BL/6 mice by microinjection. The manipulated embryos were transferred into the oviducts of 45 pseudopregnant mice respectively, from which 35 offsprings were obtained. The genomic DNAs of these offsprings were analyzed with PCR and genomic Southern blotting. Four mice whose genomes integrated with copies of intact pMTR1 vectors were chosen as founders to establish transgenic mice lineages. The recovery of pMTR1 plasmid were conducted on the genomic DNAs of F1 or F2 transgenic offsprings. Results: It was showed that intact and functional pMTR1 plasmid could be efficiently recovered from the genomic DNAs of these mice. Conclusion: (1) The transgenic mouse lineages containing copies of a stably integrated pMTR1 plasmid is established. (2) The transgenic mice are suitable models for studying gene mutation in vivo.
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【KEY WORDS】 transgenic mice; mutagenesis; gene, lac Ⅰ; plasmid
转基因小鼠突变研究模型是检测哺乳动物体内组织特异性基因突变的一个快速、有效的系统。目前注册商标为BigBlueTM，MutaTMMouse和Xenomouse 的一些小鼠模型已经进入商业销售渠道[1～3]。其中前两种模型因采用λ噬菌体为载体，在载体回收时受到体外包装分子大小的限制，对基因组片段大小依赖性较大；而后者虽以质粒为载体克服了这些缺点，但它是以较长的lac Z基因(3 087 bp)作突变靶基因，因而在进行突变子的序列分析时，工作量较大，而且从蓝色的野生型菌落中选择白色或无色的突变型菌落，易产生实验误差，从而增加了工作难度。黎怀星等在国内率先建立了以pSPORT1质粒为载体和以lacⅠ基因为诱变靶基因的转基因小鼠(D6-2)突变模型[4～6]，但该小鼠模型的遗传背景是我国的昆明种小白鼠，而目前所报道的大多数哺乳动物体内的突变研究数据都来源于C57BL/6小鼠体内。为了增加数据的可比性，本研究建立了几个以pMTR1 质粒为载体的C57BL/6转基因小鼠家系，它们除了具有D6-2小鼠的优点[5,6]外，还因pMTR1质粒具有incA不相容性位点而可以增加质粒产量，提高载体回收效率；此外，该转基因小鼠的遗传背景是C57BL/6，因而更有利于突变数据的比较分析。
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1 材料和方法
1.1 主要材料 C57BL/6小鼠由第二军医大学实验动物中心提供。pSPORT1和pSPORT2质粒以及DH10B宿主菌均购自Gibco BRL公司。标记探针的试剂盒(rediprime DNA labeling system)购自Amersham公司；lacⅠ基因的特异性PCR引物由Sangon生物工程公司合成，其序列为：P1: 5′-AGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGG-3′，P2: 5′-CTTTC-GCGGTATGGCATGATAGCGC-3′，能扩增出468 bp长的DNA片段；QIAquick Gel Extract Kit购自QIAgene公司；其他酶等试剂主要来源于Promega公司和Gibco BRL公司；α-32P-dCTP核素购自北京亚辉生物技术公司。
1.2 pMTR1载体的构建和鉴定 将pSPORT2和pSPORT1质粒DNA同时用EcoRⅠ+ Sca Ⅰ酶切，然后分别回收来源于pSPORT2的1.3 kb DNA片段和来源于pSPORT1的2.9 kb载体片段，并用T4 DNA连接酶进行连接重组。对获得的质粒DNA进行酶切鉴定和乳糖操纵子功能鉴定，然后将结构和功能正确的重组质粒命名为pMTR1，以Rca Ⅰ酶切线性化，用QIAquick Gel Extract Kit 回收、纯化4.2 kb片段，并溶于适量缓冲液中(5 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，0.2 mmol/L EDTA)至浓度为1～2 μg/ml，以备显微注射用。
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1.3 转基因小鼠的制备 实验用供体和受体母鼠的制备，受精卵的采集，显微注射和移植均按Hogan等[7]的方法进行。
1.4 仔鼠的鉴定 采用PCR, PCR-Southern杂交和基因组DNA的Southern杂交三级筛选法鉴定。
1.4.1 小鼠基因组DNA制备 取2周龄幼鼠的1.5 cm尾尖用蛋白酶K法[8]提取基因组DNA。
1.4.2 PCR分析 PCR循环条件94℃ 30 s，65℃ 45 s，72℃ 1 min共进行30个循环。采用质粒DNA和普通小鼠基因组DNA分别作阳性和阴性对照。扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
1.4.3 Southern杂交分析 将20 μg经96 U EcoR Ⅰ酶完全酶切后的小鼠基因组DNA 或PCR产物按常规方法进行电泳和转膜[8]后，于68℃杂交液(7% SDS, 0.5 mol/L NaH2PO4, 0.5 mol/L Na2HPO4,10 mmol/L EDTA, 1% BSA)中预杂交6 h，然后加入探针(取25 ng线性化的pMTR1 DNA作模板，采用Rediprime DNA Labeling System制备α-32P-dCTP核素标记的探针)，继续杂交16 h，将pMTR1质粒DNA和普通小鼠基因组DNA或其PCR产物分别用作阳性和阴性对照。用洗膜液A(0.5% BSA, 5% SDS, 1 mmol/L EDTA, 40 mmol/L Na2HPO4, 40 mmol/L NaH2PO4)于室温洗膜2次共30 min，再用洗膜液 B(1% SDS, 1 mmol/L EDTA, 40 mmol/L Na2HPO4, 40 mmol/L NaH2 PO4)于68℃ 30 min洗1次，最后用0.1×SSC漂洗, 按常规进行压片和放射自显影。
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1.5 从转基因小鼠的基因组DNA中回收pMTR1载体 取10 μg 经EcoRⅠ完全酶切的小鼠基因组DNA，75℃处理10 min，用双蒸水稀释至449 μl，加入50 μl 10×Buffer，1 μl(3U)T4 DNA连接酶，于16℃连接12 h。取5 μl连接环化的DNA液转化DH10B感受态细胞，涂布含X-gal的 Ampr LB琼脂平板，37℃孵育16～24 h。计数转化平板上的菌落数，确定回收效率，并随机挑取单菌落进行酶切鉴定，同时观察有无突变子(平板上的蓝色克隆)出现。
2 结果和讨论
本研究共对572只C57BL/6小鼠受精卵注射了线性化pMTR1质粒DNA，将注射后的受精卵分别移植入45只受体母鼠的输卵管中，共产仔44只，其中35只存活。经PCR和PCR-Southern杂交检测，有11只小鼠(M0-1～M0-11)呈阳性(图1)。为了证实pMTR1质粒在小鼠基因组中的结构完整性，对这11只小鼠基因组DNA进一步作Southern杂交，结果仅4只(M0-1, M0-2, M0-3, M0-4)为阳性(图2)。我们认为导致这种差异的主要原因有两方面：一是PCR结果可能有假阳性；二是基因组DNA的Southern杂交不如PCR灵敏，使得部分阳性小鼠在鉴定时呈阴性。从基因的整合效率来看，本研究中线性化的pMTR1质粒的整合率为11.4%(4/35)，与文献报道的10%～20%相当[7,9]。
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图 1 部分转基因小鼠PCR-Southern杂交结果
Fig 1 PCR-Southern blotting results of partial transgenic mice
1: pMTR1; 2: H2O; 3: Normal C57BL/6; 4a: M0-16; 5a～17a: M0-1～ M0-13;4b, 5b: M11-9, M11-10;
6b～9b: M11-1～ M11-4; 10b: M11-11; 11b,12b: M11-21, M11-22(M11-n: F1 generation of M0-1)
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图 2 部分转基因小鼠基因组DNA的 Southern杂交结果
Fig 2 Genomic Southern blotting results of partial transgenic mice
1: pMTR1; 2: Normal C57BL/6; 3a～5a: M12-8～M12-10(M12-n: F2 generation of M0-1); 6a: M12-4; 7a: M12-6;8a～10a: M12-12～M12-14; 3b: M0-4; 4b: M0-3; 5b: M0-2; 6b, 7b: M11-21, M11-22; 8b: M11-10; 9b: M11-19;3c～6c: M31-1～M31-4(M31-n: F1 generation of M0-3); 3d: M0-5; 4d: M0-10; 5d: M0-1; 3e～5e: M21-1～ M21-3(M21-n: F1 generation of M0-2)
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将经过基因组DNA Southern 杂交鉴定是阳性的这4只小鼠用作Founder小鼠，进行转基因小鼠的建系工作。目前除了M0-4 Founder小鼠尚无子代外，其余3只 Founder小鼠均已获得了F1子代小鼠，其中M0-1 Founder小鼠已有F2子代小鼠。对所有这些子代小鼠以PCR，PCR-Southern杂交和基因组DNA Southern杂交进行检测 (图1和图2是部分小鼠的检测结果)，结果表明：M0-1 Founder小鼠的22只子一代小鼠中有5只为阳性(M11-3, M11-10, M11-19, M11-21, M11-22)，转基因遗传率为22.7%(5/22)；在33只子二代小鼠中有8只为阳性(M12-4, M12-6, M12-8～M12-10, M12-12～M12-14)，转基因遗传率为24.2%(8/33)；M0-2 Founder小鼠的3只子一代小鼠中2只为阳性(M21-2, M21-3)，转基因遗传率为66.7%(2/3)；M0-3 Founder小鼠的8只子一代小鼠中3只为阳性(M31-1, M31-2, M31-4)，转基因遗传率为37.5%(3/8)。这些结果说明，pMTR1转基因在Founder小鼠中是可以稳定遗传至子代的。
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整合于小鼠基因组DNA中的pMTR1质粒是否结构和功能完整，能否有效地回收出来是决定该转基因小鼠能否用于突变研究的关键。本研究通过酶切环化方法分别从M0-1 Founder鼠的子一代和子二代小鼠、M0-2和M0-3 Founder鼠的子一代小鼠的基因组DNA中成功地回收出了pMTR1质粒，平均回收效率为219 cfu/μg DNA(表1)。对回收出的质粒采用限制性内切酶进行结构鉴定的结果表明，所回收质粒的大小和结构与pMTR1质粒完全相同，没有出现明显的缺失、插入和重排(图3)。进一步将回收质粒转化DH10B宿主菌，涂布含或不含 IPTG，而具有X-gal的Ampr的LB平板，分析lacⅠ基因的功能。结果表明，回收质粒中lac Zα报告基因的表达受lacⅠ基因产物的调节，能进行α互补，具有完整的乳糖操纵子功能(表2)。
表 1 转基因小鼠基因组DNAs中质粒的回收效率
, 百拇医药 Tab 1 Frequency of plasmids rescued from
transgenic mice genomic DNAs Origin of DNAs
Number
of colonies
DNA
(cfu/μg)
Nunmber
of mutants
F1 generation of M0-1
76
, 百拇医药
253
0
F1 generation of M0-2
42
140
0
F1 generation of M0-3
82
273
0
F2 generation of M0-1
, 百拇医药
63
210
0
Average
65.75
219
0
图 3 从转基因小鼠基因组DNA中回收的
质粒的酶切鉴定结果
Fig 3 Restriction map of plasmid rescued
from transgenic mice genomic DNAs
, http://www.100md.com
1: pMTR1 plasmid DNA; 2: pMTR1/EcoRⅠ; 3: pMTR1/RcaⅠ; 4: pMTR1/EcoR Ⅰ+ScaⅠ; 5: a Plasmid/EcoRⅠ; 6: a Plasmid/RcaⅠ; 7: a Plasmid/EcoR Ⅰ+ScaⅠ; 8: λ/Hind Ⅲ DNA marker; a: Plasmids rescued from genomic DNA of the transgenic mice
表 2 回收质粒中lacⅠ 靶基因的功能鉴定结果
Tab 2 Functional analysis of lacⅠ target
gene in the rescued plasmids Origin of
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colonies
aIPTG
bX-gal
cAmpR
Color of
colonies
dPlasmid/DH10B
+
+
+
Blue
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dPlasmid/DH10B…
+
+
White
pMTR1/DH10B
+
+
+
Blue
pMTR1/DH10B…
+
+
White
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a：Isopropyl-β-D-thiogalactoside； b：5-Bromo-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactoside； c： Ampicillin resistance； d： Plasmids rescued from genomic DNAs of the transgenic mice
综上所述，本研究已成功地建立了基于pMTR1质粒的C57BL/6转基因小鼠家系，整合于转基因小鼠基因组中的pMTR1质粒结构是完整的，功能是正常的，并能有效地被回收出来，因此该转基因小鼠是能用于体内突变研究的。【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39570400)；军队“九五”重 点攻关课题基金资助项目(96Z033)
【作者简介】卢洋(1972～)，男(汉族)，博士生，现在第二军医 大学科研部国际合作肿瘤研究所
【参考文献】
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【收稿日期】1999-12-02
【修回日期】2000-04-28, 百拇医药