人肺癌细胞NHE-1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建
作者：黄桂君 吴国明 张青 钱桂生
单位：黄桂君(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；吴国明(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；张青(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：NHE-1基因；肺肿瘤；反义技术；重组载体
第三军医大学学报000609 提 要： 目的 构建人肺癌细胞Na+/H+交换泵-1 (Na+/H+ exchanger-1,NHE-1)基因的反义表达载体，为将来能在体内应用抑制NHE-1基因表达的肿瘤治疗奠定基础。方法 采用PCR技术从人肺癌A549细胞基因组中克隆出长为454 bp的NHE-1基因外显子部分序列，在上、下游引物的5'-端带上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。然后将该片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点。最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定，所克隆的目的片段大约为467 bp，并成功地连接到pLXSN载体上，而DNA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的片段。结论 本实验已成功地克隆了NHE-1的目的片段，并将其反向插入到pLXSN中，构建了NHE-1反义表达载体pNHE-1。
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中图法分类号： R394-3;R734.2 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)06-0538-03
Cloning of Na+/H+ exchanger-1 gene fragment from human lung cancer cells and construction of its antisense expression vector
HUANG Gui-jun, WU Guo-ming, ZHANG Qing, QIAN Gui-sheng
(Research Institute of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
, 百拇医药
Abstract： Objective To construct an antisense expression vector of Na+/H+ exchanger-1 (NHE-1) of human lung cancer cell in order to found a basis for tumor gene therapy by inhibiting the expression of NHE-1 gene in vivo. Methods Partial sequence of the exon of NHE-1 gene was cloned with the length of 454bp from genomic DNA of A549 cells with PCR method. BamHI and EcoRI cleaving sites were added to 5' ends of the upstream and downstream primers respectively. The cloned fragment was reversely inserted into the multiclone site of plasmid reverse transcription virus vector pLXSN. Finally, the constructed recombinant was identified with agarose gel electrophresis and DNA sequencing. Results The cloned fragment was in the length of 461bp and successfully bound to pLXSN. It also proved to be the objective one by DNA sequencing. Conclusion The objective fragment was cloned and reversely inserted into pLXSN in our study. The antisense vector of NHE-1, namely, pNHE-1 was constructed successfully.
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Key words: NHE-1 gene; pulmonary neoplasm; antisense technology; recombinant vector
Na+/H+交换泵(Na+/H+ exchanger, NHE)基因家族有5个亚型，分别命名为NHE-1，2，3，4及β-NHE。其中NHE-1是一种管家基因，能通过Na+/H+交换将胞内H+排出，从而维持细胞内pH(pHi)的稳定。肿瘤细胞由于其糖酵解的反巴士德效应，导致酸性产物异常增加，但肿瘤细胞可依靠其表达增强的NHE-1膜蛋白，将细胞内H+泵出细胞外，阻止癌细胞酸化[1,2]。而目前已经证实细胞内的H+蓄积和pHi降低将会诱发细胞凋亡[3]。我们的前期工作亦已证明人肺癌组织NHE-1基因的表达比正常肺组织高12倍左右[5]。因此，抑制人肺癌细胞NHE-1基因上调表达将可能诱发细胞酸化和凋亡，达到肿瘤治疗的目的。本研究试图从人肺癌细胞株A549细胞中克隆NHE-1基因的部分序列，并构建其反义表达重组载体。为将来能在体内应用NHE-1基因抑制的肿瘤治疗研究奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 A549细胞NHE-1基因片段的克隆
1.1.1A549细胞的培养 采用RPMI1640培养基按常规方法培养肿瘤细胞。
1.1.2 基因组DNA的提取 按常规方法提取A549细胞基因组DNA。
1.1.3 PCR引物的设计与合成 根据Sardet等[4]克隆的人NHE-1基因序列，设计以下一对引物(由上海生工生物工程公司合成)：
P1(正义引物)：5'-tcg gat cca gtc act ttc ctc agc-3'
BamHⅠ
P2(反义引物)：5'-cga att caa cca cca cga gta agg-3'
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EcoRⅠ
该对引物可扩增NHE-1基因第1外显子序列，相当于其cDNA的-384 bp至+70 bp处的序列，长为454 bp。引物5'端带上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点便于反向连接于病毒载体的5'-LTR启动子下游(含酶切位点PCR产物长为467 bp)。
1.1.4 PCR条件 95℃预变性5 min后加入Taq酶(sangon产品)，然后94℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸45 s。作35个循环，末次循环72℃延伸5 min。
1.1.5 PCR产物纯化及酶切 取PCR产物走1%琼脂糖电泳，待引物二聚体与扩增片段分离后，切下扩增片段，再用“V”型DNA电泳洗脱回收槽回收该凝胶中的目的片段，用酚/氯仿抽提、纯化；纯化片段用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，反应完毕后加等体积酚/氯仿抽提1次，无水乙醇沉淀、离心，用20 μl去离子水溶解后，置-20℃保存备用。
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1.2 NHE-1基因反义表达载体的构建
1.2.1构建策略，见图1
图1 构建策略图
Fig 1 Construction strategy
1.2.2 pLXSN质粒(5 843 bp, Dr. Miller惠赠) 用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，等体积酚/氯仿抽提1次，离心沉淀，用去离子水溶解，并置-20℃保存备用。
1.2.3 DNA重组连接 连接反应体系由10×Buffer 10 μl，酶切后的PCR扩增片段3 μl(3.9 μg)，上述酶切后的pLXSN载体1.3 μl(1.3 μg)，T4连接酶8 μl，水77.7 μl组成，合计100 μl；在16℃条件下连接16 h。
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1.2.4 重组载体(pNHE-1)的细菌转导 采用电穿孔法。取45 μl XL1-Blue感受态细菌，加入2 μl重组载体(连接反应液)，混匀后加入电穿孔杯中，采用电穿孔仪(美国Bio-Rad产品)在电压为1.25 kV，电容25 μF，电阻200Ω的条件下电击细菌4～5 ms。立即用1 ml SOC轻轻冲洗细菌并转移至培养管中，于37℃，225 r/min振摇1 h。取100 μl转化细菌涂布于半固体培养基(含100 μg/ml Amp)筛选平板上，37℃孵育箱中过夜。
1.3 pNHE-1的鉴定
1.3.1酶切鉴定 从筛选平板上挑取菌落，接种于3ml LB培养基中(含100 μg/ml Amp)，37℃振摇过夜。收集细菌采用碱裂解法小量提取质粒。采用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切提取的质粒DNA，进行电泳鉴定。
1.3.2 测序鉴定 经初步鉴定pNHE-1为设计的反义重组子后，对重组质粒DNA进行序列测定。测序引物为我们设计的上游引物，采用 ABI377全自动DNA测序仪(基康公司)， 应用四色荧光、双脱氧终止法进行测序。
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2 结果
2.1 目的片段的克隆，见图2
结果显示PCR产物与预期的长度相吻合，提示扩增的DNA片段为目的片段。
图2 目的片段及pNHE-1的酶切电泳鉴定结果
泳道1：小分子量marker；泳道2：PCR产物；泳道3：pNHE-1双酶切后释放的目的片段；泳道4：双酶切的 pLXSN ；泳道5：Marker(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)
Fig 2 Electrophoresis of objective DNA fragment
and enzyme cleaving pNHE-1
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Lane 1:low molecular marker; Lane 2:PCR product; Lane 3:pNHE-1 double enzyme cleaving; Lane 4:pLXSN double enzyme cleaving; Lane 5:DNA marker (λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)
2.2 pNHE-1的酶切鉴定，见图2
重组载体在双酶切后释放出一约462 bp的短片段，提示扩增的片段已成功地插入载体DNA中。
2.3 pNHE-1中目的片段的测序结果
测序结果表明我们所克隆的目的片段与Sardet等人于1989年报道的几乎完全一致，只是在-360和-364分别有C和G插入。
3 讨论
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实验结果表明，我们已经成功地克隆了目的片段，并将该片段反向插入到逆转录病毒载体pLXSN上，成功构建了NHE-1的反义表达载体pNHE-1。测序结果显示所克隆的目的片段与他人报道的NHE-1相应序列有细微差异，这种差异可能与肿瘤组织细胞NHE-1基因突变有关；亦不排除为PCR扩增时所产生的错配所致，但我们扩增的序列不足500 bp，2个碱基的差异以前者的可能性更大。因此直接从肿瘤细胞克隆NHE-1基因片段并构建其反义表达载体，对肿瘤细胞基因表达的抑制可能具有一定的选择性。
以往采用PCR克隆基因及构建其反义表达载体均从mRNA入手，而RNA提取条件严格，还需逆转录步骤，耗时耗力。由于在反义技术中，一般针对基因cDNA的任何序列均可产生抑制效应，因此，在本实验中我们设计引物直接从基因组DNA扩增对应于NHE-1 cDNA的序列，而该序列含5'端非翻译区和翻译起始密码子，并从基因组直接转录而来，不经剪接加工。这样既可获得反义抑制的最有效靶序列，又省时省力。我们在引物设计时还加入了酶切位点，使NHE-1基因片段按反向插入要求连接到pLXSN上，从而也使重组载体构建工作高效简便。目前，以缺陷病毒为载体在有机整体中表达外源基因，仍然是肿瘤基因治疗的活跃领域。近年我们的研究发现，人肺癌组织细胞的NHE-1基因mRNA表达较正常肺组织增高约12倍[5]；在细胞培养的实验中亦证明，针对NHE-1的反义寡聚脱氧核苷酸对人肺癌细胞具有抑制NHE-1活性，酸化肿瘤细胞的作用，并能诱导肺癌细胞的凋亡[6]。因此，NHE-1基因反义表达载体的构建，为将来实施NHE-1基因抑制的肿瘤治疗研究奠定了基础。我们相信这一工作将具有重要价值。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900067)
作者简介：黄桂君(1964-)，男，广西省南宁市人，博士，主治医师，讲师，主要从事肺癌、疾病基因组方面的研究，发表论文12篇。电话：(023)68755644
参考文献：
[1] Garcia-Canero R, Trilla C, Perez de Diego J, et al. Na+/H+ exchange inhibition induces intracellular acidosis and differentially impairs cell growth and viability of human and rat hepatocarcinoma cells[J]. Toxicol Lett, 1999,106(2-3):215-228.
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[2] Strazzabosw M, Poci C, Zsembery A, et al. Intracellular pH re-gulation in Hep G2 cells: effects of epidermal growth factor, transforming growth factor-α and insulinlike growth factor-Ⅱ in Na+/H+ exchange activity[J]. Hepatology,1995,22(2):588-597.
[3] 黄桂君，钱桂生.pH对细胞凋亡的调控及pH调节的肿瘤治疗研究[J].科学，1997,228(8):51-52.
[4] Sardet C, Franchi A, Pouyssegur J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiport[J]. Cell,1989,56:271-280.
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[5] 黄桂君，厉为良，钱桂生，等.人肺癌组织细胞NHE-1mRNA表达及其意义的研究[J]. 中华结核和呼吸杂志,1998,21(10):636.
[6] Wu Guoming, Huang Guijun, Qian Guisheng, et al. Acidification and apoptosis of human lung cancer cells induced with antisense nucleotides against NHE-1[J]. J Med Coll PLA, 1998,13(4):291-293.
收稿日期：2000-02-17；修回日期：2000-04-28, 百拇医药
单位：黄桂君(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；吴国明(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；张青(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)；钱桂生(第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所，重庆 400037)
关键词：NHE-1基因；肺肿瘤；反义技术；重组载体
第三军医大学学报000609 提 要： 目的 构建人肺癌细胞Na+/H+交换泵-1 (Na+/H+ exchanger-1,NHE-1)基因的反义表达载体，为将来能在体内应用抑制NHE-1基因表达的肿瘤治疗奠定基础。方法 采用PCR技术从人肺癌A549细胞基因组中克隆出长为454 bp的NHE-1基因外显子部分序列，在上、下游引物的5'-端带上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点。然后将该片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点。最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。结果 经琼脂糖凝胶电泳鉴定，所克隆的目的片段大约为467 bp，并成功地连接到pLXSN载体上，而DNA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的片段。结论 本实验已成功地克隆了NHE-1的目的片段，并将其反向插入到pLXSN中，构建了NHE-1反义表达载体pNHE-1。
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中图法分类号： R394-3;R734.2 文献标识码： A
文章编号：1000-5404(2000)06-0538-03
Cloning of Na+/H+ exchanger-1 gene fragment from human lung cancer cells and construction of its antisense expression vector
HUANG Gui-jun, WU Guo-ming, ZHANG Qing, QIAN Gui-sheng
(Research Institute of Respiratory Diseases, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400037, China)
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Abstract： Objective To construct an antisense expression vector of Na+/H+ exchanger-1 (NHE-1) of human lung cancer cell in order to found a basis for tumor gene therapy by inhibiting the expression of NHE-1 gene in vivo. Methods Partial sequence of the exon of NHE-1 gene was cloned with the length of 454bp from genomic DNA of A549 cells with PCR method. BamHI and EcoRI cleaving sites were added to 5' ends of the upstream and downstream primers respectively. The cloned fragment was reversely inserted into the multiclone site of plasmid reverse transcription virus vector pLXSN. Finally, the constructed recombinant was identified with agarose gel electrophresis and DNA sequencing. Results The cloned fragment was in the length of 461bp and successfully bound to pLXSN. It also proved to be the objective one by DNA sequencing. Conclusion The objective fragment was cloned and reversely inserted into pLXSN in our study. The antisense vector of NHE-1, namely, pNHE-1 was constructed successfully.
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Key words: NHE-1 gene; pulmonary neoplasm; antisense technology; recombinant vector
Na+/H+交换泵(Na+/H+ exchanger, NHE)基因家族有5个亚型，分别命名为NHE-1，2，3，4及β-NHE。其中NHE-1是一种管家基因，能通过Na+/H+交换将胞内H+排出，从而维持细胞内pH(pHi)的稳定。肿瘤细胞由于其糖酵解的反巴士德效应，导致酸性产物异常增加，但肿瘤细胞可依靠其表达增强的NHE-1膜蛋白，将细胞内H+泵出细胞外，阻止癌细胞酸化[1,2]。而目前已经证实细胞内的H+蓄积和pHi降低将会诱发细胞凋亡[3]。我们的前期工作亦已证明人肺癌组织NHE-1基因的表达比正常肺组织高12倍左右[5]。因此，抑制人肺癌细胞NHE-1基因上调表达将可能诱发细胞酸化和凋亡，达到肿瘤治疗的目的。本研究试图从人肺癌细胞株A549细胞中克隆NHE-1基因的部分序列，并构建其反义表达重组载体。为将来能在体内应用NHE-1基因抑制的肿瘤治疗研究奠定基础。
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1 材料与方法
1.1 A549细胞NHE-1基因片段的克隆
1.1.1A549细胞的培养 采用RPMI1640培养基按常规方法培养肿瘤细胞。
1.1.2 基因组DNA的提取 按常规方法提取A549细胞基因组DNA。
1.1.3 PCR引物的设计与合成 根据Sardet等[4]克隆的人NHE-1基因序列，设计以下一对引物(由上海生工生物工程公司合成)：
P1(正义引物)：5'-tcg gat cca gtc act ttc ctc agc-3'
BamHⅠ
P2(反义引物)：5'-cga att caa cca cca cga gta agg-3'
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EcoRⅠ
该对引物可扩增NHE-1基因第1外显子序列，相当于其cDNA的-384 bp至+70 bp处的序列，长为454 bp。引物5'端带上BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点便于反向连接于病毒载体的5'-LTR启动子下游(含酶切位点PCR产物长为467 bp)。
1.1.4 PCR条件 95℃预变性5 min后加入Taq酶(sangon产品)，然后94℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸45 s。作35个循环，末次循环72℃延伸5 min。
1.1.5 PCR产物纯化及酶切 取PCR产物走1%琼脂糖电泳，待引物二聚体与扩增片段分离后，切下扩增片段，再用“V”型DNA电泳洗脱回收槽回收该凝胶中的目的片段，用酚/氯仿抽提、纯化；纯化片段用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，反应完毕后加等体积酚/氯仿抽提1次，无水乙醇沉淀、离心，用20 μl去离子水溶解后，置-20℃保存备用。
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1.2 NHE-1基因反义表达载体的构建
1.2.1构建策略，见图1
图1 构建策略图
Fig 1 Construction strategy
1.2.2 pLXSN质粒(5 843 bp, Dr. Miller惠赠) 用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后，等体积酚/氯仿抽提1次，离心沉淀，用去离子水溶解，并置-20℃保存备用。
1.2.3 DNA重组连接 连接反应体系由10×Buffer 10 μl，酶切后的PCR扩增片段3 μl(3.9 μg)，上述酶切后的pLXSN载体1.3 μl(1.3 μg)，T4连接酶8 μl，水77.7 μl组成，合计100 μl；在16℃条件下连接16 h。
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1.2.4 重组载体(pNHE-1)的细菌转导 采用电穿孔法。取45 μl XL1-Blue感受态细菌，加入2 μl重组载体(连接反应液)，混匀后加入电穿孔杯中，采用电穿孔仪(美国Bio-Rad产品)在电压为1.25 kV，电容25 μF，电阻200Ω的条件下电击细菌4～5 ms。立即用1 ml SOC轻轻冲洗细菌并转移至培养管中，于37℃，225 r/min振摇1 h。取100 μl转化细菌涂布于半固体培养基(含100 μg/ml Amp)筛选平板上，37℃孵育箱中过夜。
1.3 pNHE-1的鉴定
1.3.1酶切鉴定 从筛选平板上挑取菌落，接种于3ml LB培养基中(含100 μg/ml Amp)，37℃振摇过夜。收集细菌采用碱裂解法小量提取质粒。采用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切提取的质粒DNA，进行电泳鉴定。
1.3.2 测序鉴定 经初步鉴定pNHE-1为设计的反义重组子后，对重组质粒DNA进行序列测定。测序引物为我们设计的上游引物，采用 ABI377全自动DNA测序仪(基康公司)， 应用四色荧光、双脱氧终止法进行测序。
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2 结果
2.1 目的片段的克隆，见图2
结果显示PCR产物与预期的长度相吻合，提示扩增的DNA片段为目的片段。
图2 目的片段及pNHE-1的酶切电泳鉴定结果
泳道1：小分子量marker；泳道2：PCR产物；泳道3：pNHE-1双酶切后释放的目的片段；泳道4：双酶切的 pLXSN ；泳道5：Marker(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)
Fig 2 Electrophoresis of objective DNA fragment
and enzyme cleaving pNHE-1
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Lane 1:low molecular marker; Lane 2:PCR product; Lane 3:pNHE-1 double enzyme cleaving; Lane 4:pLXSN double enzyme cleaving; Lane 5:DNA marker (λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)
2.2 pNHE-1的酶切鉴定，见图2
重组载体在双酶切后释放出一约462 bp的短片段，提示扩增的片段已成功地插入载体DNA中。
2.3 pNHE-1中目的片段的测序结果
测序结果表明我们所克隆的目的片段与Sardet等人于1989年报道的几乎完全一致，只是在-360和-364分别有C和G插入。
3 讨论
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实验结果表明，我们已经成功地克隆了目的片段，并将该片段反向插入到逆转录病毒载体pLXSN上，成功构建了NHE-1的反义表达载体pNHE-1。测序结果显示所克隆的目的片段与他人报道的NHE-1相应序列有细微差异，这种差异可能与肿瘤组织细胞NHE-1基因突变有关；亦不排除为PCR扩增时所产生的错配所致，但我们扩增的序列不足500 bp，2个碱基的差异以前者的可能性更大。因此直接从肿瘤细胞克隆NHE-1基因片段并构建其反义表达载体，对肿瘤细胞基因表达的抑制可能具有一定的选择性。
以往采用PCR克隆基因及构建其反义表达载体均从mRNA入手，而RNA提取条件严格，还需逆转录步骤，耗时耗力。由于在反义技术中，一般针对基因cDNA的任何序列均可产生抑制效应，因此，在本实验中我们设计引物直接从基因组DNA扩增对应于NHE-1 cDNA的序列，而该序列含5'端非翻译区和翻译起始密码子，并从基因组直接转录而来，不经剪接加工。这样既可获得反义抑制的最有效靶序列，又省时省力。我们在引物设计时还加入了酶切位点，使NHE-1基因片段按反向插入要求连接到pLXSN上，从而也使重组载体构建工作高效简便。目前，以缺陷病毒为载体在有机整体中表达外源基因，仍然是肿瘤基因治疗的活跃领域。近年我们的研究发现，人肺癌组织细胞的NHE-1基因mRNA表达较正常肺组织增高约12倍[5]；在细胞培养的实验中亦证明，针对NHE-1的反义寡聚脱氧核苷酸对人肺癌细胞具有抑制NHE-1活性，酸化肿瘤细胞的作用，并能诱导肺癌细胞的凋亡[6]。因此，NHE-1基因反义表达载体的构建，为将来实施NHE-1基因抑制的肿瘤治疗研究奠定了基础。我们相信这一工作将具有重要价值。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39900067)
作者简介：黄桂君(1964-)，男，广西省南宁市人，博士，主治医师，讲师，主要从事肺癌、疾病基因组方面的研究，发表论文12篇。电话：(023)68755644
参考文献：
[1] Garcia-Canero R, Trilla C, Perez de Diego J, et al. Na+/H+ exchange inhibition induces intracellular acidosis and differentially impairs cell growth and viability of human and rat hepatocarcinoma cells[J]. Toxicol Lett, 1999,106(2-3):215-228.
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[2] Strazzabosw M, Poci C, Zsembery A, et al. Intracellular pH re-gulation in Hep G2 cells: effects of epidermal growth factor, transforming growth factor-α and insulinlike growth factor-Ⅱ in Na+/H+ exchange activity[J]. Hepatology,1995,22(2):588-597.
[3] 黄桂君，钱桂生.pH对细胞凋亡的调控及pH调节的肿瘤治疗研究[J].科学，1997,228(8):51-52.
[4] Sardet C, Franchi A, Pouyssegur J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiport[J]. Cell,1989,56:271-280.
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[5] 黄桂君，厉为良，钱桂生，等.人肺癌组织细胞NHE-1mRNA表达及其意义的研究[J]. 中华结核和呼吸杂志,1998,21(10):636.
[6] Wu Guoming, Huang Guijun, Qian Guisheng, et al. Acidification and apoptosis of human lung cancer cells induced with antisense nucleotides against NHE-1[J]. J Med Coll PLA, 1998,13(4):291-293.
收稿日期：2000-02-17；修回日期：2000-04-28, 百拇医药