人外周血细胞线粒体DNA中存在特大片段缺失突变
作者：张燕 王学敏 杨雨善 蒋蕾 郑惠民 谢惠君
单位：张燕(第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)；王学敏(第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)；杨雨善(第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)；蒋蕾(第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)
关键词：DNA，线粒体；染色体缺失
第二军医大学学报000626 【摘要】 目的：了解线粒体DNA大片段缺失突变及其意义。方法：采用6种方法提取人外周血细胞DNA, 其中1种方法先分离线粒体，再抽提线粒体DNA。以得到的人外周血细胞DNA为模板进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶回收后与pGEM-T载体连接、转化、测序。结果：6种方法抽提DNA进行PCR扩增后，产物电泳行为相同，发现人血细胞线粒体DNA存在13 162 bp特大片段缺失突变。结论：此缺失是首次发现的，经测序证明为人线粒体DNA最大片段的缺失。
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【中图分类号】 Q 754 【文献标识码】 A
【文章编号】 0258-879X(2000)06-0586-04
A very large scale deletion mutation in human peripheral blood cells mitochondrial DNA
ZHANG Yan，WANG Xue-Min，YANG Yu-Shan，JIANG Lei
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
, 百拇医药
ZHENG Hui-Min，XIE Hui-Jun
(Department of Neurology, Changhai Hospital)
【ABSTRACT】 Objective:To understand large scale deletion mutation in mitochondrial DNA(mtDNA) and its significance. Methods: Six methods were used to extract human peripheral blood cells DNA of which one method was that mitochondria were isolated before mtDNA extraction. PCR was carried out using obtained human peripheral blood cells DNA as template. After extracted from agarose gels，PCR products was ligated with pGEM-T vector, transformed and sequenced. Results: PCR products using template DNA extracted from above methods showed the same band in agarose electrophoresis, and a 13 162 bp mtDNA deletion mutation in human peripheral blood cells was found. Conclusion: This deletion is not reported previously and is the longest deletion in human mtDNA by sequencing.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 DNA，mitochondrial; chromosome deletion
线粒体是细胞内重要的细胞器之一，是真核细胞许多生物化学反应的场所，其中尤为重要的是通过氧化磷酸化作用生成ATP，供生命活动需要。人线粒体DNA编码呼吸链氧化磷酸化复合物13个蛋白质亚基，22种tRNA和2种rRNA。它呈裸露的环状双螺旋结构，缺乏蛋白保护和修复系统，容易受到线粒体本身氧化磷酸化过程中产生氧自由基的损伤，其突变率是核突变率的10～20倍。我们在研究人线粒体大片段缺失与疾病关系的过程中发现人外周血细胞存在一13.162 kb片段的缺失，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器 Taq酶, dNTP, ITPG, X-gal，基因组DNA抽提试剂盒均来自Takara Biotech公司；PCR引物由Takara Biotech公司合成； 胶回收试剂盒由Watson Biotech公司提供； pGEM-T载体由Promega公司提供；PCR仪型号为PTC-100 Programmable Thermal Control， MJ Research.Inc.USA产品。线粒体DNA/胞质病毒DNA纯化试剂盒由意大利泛特津(Vitagene)公司提供。
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1.2 DNA的制备 从8名汉族健康体检者(男性5例，女性3例，年龄22～55岁，平均43.3岁)中采集外周静脉血2 ml，3.8%枸橼酸钠抗凝。取1例用6种不同方法提取DNA，其他用方法(1)提取。方法(1) (常规标准方法) ：用红细胞裂解液(0.32 mol/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L MgCl2,1% Triton -100)裂解红细胞，余下按标准方法抽提[1]；方法(2)先用红细胞裂解液裂解红细胞，再以差速离心法分离线粒体，加蛋白酶K，用酚氯仿抽提，TE溶解；方法(3)： 用抽提线粒体DNA的试剂盒直接抽提mtDNA，按说明书操作；方法(4)：煮沸法，参照Davis等[3]的方法；方法(5)： 裂解红细胞后，加蛋白酶K，56℃ 1 h后，不用酚氯仿抽提，94℃ 10 min灭活加蛋白酶K;方法(6)：用抽提基因组DNA试剂盒抽提全部DNA, 按说明书操作。
1.3 PCR反应 PCR反应管内含有0.01 mol/L Tris-HCl, 0.05 mol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.375 mmol/L dNTP, 10% DMSO, 2.5 U Taq酶, 引物各20 pmol, 模板1～10 ng，总体积50 μl。根据文献[1]设计引物。引物1: 5′TCCGACATCTGGTTCCTAC 3′(np16 492～np16 511)； 引物2: 5′TGCGAACAGAGTGGTGATAGCG3′(np13 179～np13 200)。 扩增条件：95℃，5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s 29个循环；72℃ 10 min。
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1.4 PCR产物鉴定 2%琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm, 40 min, EB染色后，紫外灯下观察并照相。
1.5 凝胶中DNA的回收 按说明书操作。
1.6 连接 按以下条件进行：2×T4 DNA快速连接酶buffer 5 μl，pGEM-T 质粒(50 μg) 1 μl，回收PCR产物2 μl，T4连接酶(3 U) 1 μl, ddH2O 1 μl, 4℃过夜。
1.7 转化 制备感受态细菌，按文献[2]进行。转化：将感受态大肠杆菌DH5α 200 μl 置于1.5 ml eppendorf 管中，加10 μl已连接好的质粒DNA，轻摇混匀，置冰浴30 min，42℃ 90 s，冰浴2 min， 加800 μl LB，37℃，45 min，温和摇动(100～150 r/min)，离心，3 000 r/min，4 min，留下约200 μl上清，加IPTG(200 mg /ml)4 μl，X-Gal(50 mg/ml)16 μl，轻轻混合，涂布于LB抗性平板上，37℃培养10～12 h。
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1.8 筛选与鉴定 利用氨苄抗性与α-互补筛选阳性克隆(白斑)，取上述挑选的阳性克隆,摇菌培养, 抽取质粒,用上述引物作PCR, 并用原PCR产物作对照,观察扩增的DNA片段是否相同。
1.9 测序 由Takara 公司从菌体中提取质粒完成测序。反应试剂为：BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit。(PERKIN ELMER) 测序仪型号为 ABI PRISMTM 377 DNA Sequence。测序引物为：T7 Promotor Prime TAATACGACTCACTATAGGG。
2 结 果
2.1 DNA制备结果 6种方法提取DNA进行PCR扩增结果见图1，可见其PCR产物电泳行为一致。
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2.2 PCR PCR 产物在琼脂糖凝胶电泳中与标准DNA分子量比较可见, 扩增产物的分子量在100～200 bp 之间，以重组pGEM-T载体为模板与以血细胞DNA为模板的扩增产物相对分子质量相一致(见图2)。
图 1 6种方法提取DNA PCR 产物(2%)琼脂糖凝胶电泳
Fig 1 Agarose gel electrophoresis (2%) of PCR products
using DNA extracted by 6 kinds of methods
Lane 1：100 bp DNA ladder marker；
Lane 2～7：PCR product using template DNA
, 百拇医药
extracted by method 1～6 respectively
图 2 PCR产物(2%)琼脂糖凝胶电泳
Fig 2 Agarose gel electrophoresis (2%) of PCR products
Lane 1～8：PCR products using blood cell DNA as template；
Lane 9：PCR products using recombiant pGEM-T vector
as template；Lane 10：100 bp DNA ladder marker
, 百拇医药
2.3 测序 pGEM-T 载体中插入的PCR产物测序结果为：
TCCGACATCTGGTTCCTACTTCAGGGCCATAAAGC
CTAAATAGCCCACACGTTCCCCTTAAATAAGACAT
CACGATGGATCACAGGTCTATCACGCTATCACCAC
TCTGTTCGCA，双向测序结果相一致。
3 讨 论
自1988年Holt等[4]发现线粒体脑肌病患者中存在线粒体DNA缺失突变以来，至今已发现许多缺失突变，这些缺失多数在不再继续分裂的稳定组织如肌肉、脑等含量较高，而在快速分裂组织如血细胞中含量较低，其mtDNA突变的检测困难得多[5]。这可能因为血细胞分裂快，突变不易累积的缘故。因此，血细胞中发现缺失的报道远较其他组织少。如Lee等[6]在肌肉、肝脏、睾丸等组织中均发现4 977 bp的“共有缺失”，而在其检测的117例血标本中则无1例存在此缺失。
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目前抽提DNA作为PCR模板扩增线粒体DNA的方法有多种。常用方法多数是抽提总DNA，既包括核DNA，也包括线粒体DNA。为证实我们所采用的较简便的方法(方法1)得到的PCR 产物来自线粒体基因组，我们对常用的6种方法进行比较。其中方法(2) 先分离线粒体，后提取线粒体DNA，方法(3)直接抽提线粒体DNA，与其他方法比较，PCR 产物电泳行为一致，说明方法(1)是可靠的，而且我们所得序列来自线粒体基因组而非核基因组。
根据本实验测序结果，两引物间仅有74 bp，将此序列与人线粒体标准序列进行比较计算缺失约为13 162 bp。检索人线粒体基因组数据库和Medline,发现此缺失未见报道，且比数据库中报道的人线粒体DNA最长片段缺失10.9 kb[7]还要长约3 kb (图2)。此缺失范围覆盖了12S rRNA，16S rRNA，ND1，ND2，OrL，COⅠ，COⅡ，ATPase8，ATPase6，COⅢ，ND3，ND4L，部分ND5及19种tRNA，也就是说缺失了大片段的mtDNA变成长度约为3 kb的小环(minicircle)，见图3。
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图 3 人线粒体基因组图谱
Fig 3 Human mitochondrial genomic DNA map
如此大片段的缺失是如何产生的呢？目前有两种假说。Ahne等 [8] 基于对酵母的研究提出的滑脱错配即分子内同源重组机制。由于mtDNA存在大量的重复序列，当内含子剪接出现错误时会造成滑脱配对从而产生大片段缺失。本实验所发现缺失经序列分析未见重复序列的存在。另一假说为Mita[9]、Shoffner[10] 等提出的复制过程中的错配机制：mtDNA在重链起始点开始复制后，新合成的重链沿轻链模板向前推进，取代副本重链。如果在复制叉前打开了重复序列，而此时复制又被某种损伤所停止(如氧自由基造成的损伤)，重链的互补重复序列将同下游暴露在复制叉前的重复序列配对，造成D环断裂、尾部降解，产生新的3′-OH引物，又重新启动复制，这样就跳过了损伤部位继续复制。当复制结束时就产生一个突变的和一个全长的mtDNA分子。但这些假说均不令人满意：首先，尚无mtDNA有修复系统的报告，似乎不存在分子内重组机制；其次，动物mtDNA从两个起始点开始复制，任何时期不会暴露伸展的互补单链DNA。
, http://www.100md.com
已报道的缺失突变大多与疾病及衰老有关。如CPEO，KSS，母系遗传糖尿病耳聋，帕金森综合征和老年性痴呆疾病等。而本实验的供血对象未发现有器质性病变，这可能是因为缺失的mtDNA占总mtDNA的比例较低，还未表现出相应的症状，因为文献报道认为只有当突变的mtDNA占总mtDNA的比例大于50%～55% 时，线粒体膜电位、ATP合成率、细胞内ATP/ADP比例均会下降，细胞的功能才会受到影响[11]。此缺失究竟与衰老有关还是与尚未出现症状的疾病有关，本室正在研究之中。
【作者简介】张燕(1970～)，女(汉族)，硕士
【作者单位】郑惠民(长海医院神经内科)
谢惠君(长海医院神经内科)
【参考文献】
[1] Ernst BP, Wilichowski E, Wagner M et al. Deletion screening of mitochondrial DNA via multiprimer DNA amplification[J]. Mol Cell Probes, 1994,8(1):45-49.
, http://www.100md.com
[2] 萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T,著.金冬雁，黎孟枫 等译.分子克隆实验指南[M].第2版，北京：科学出版社，1992. 55-56.
[3] Davis RE, Miller S, Herrnstadt C, et al, Mutations in mitochondrial cytochrome c oxidase genes segregate with late-onset Alzheimer disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1997, 94(9):4526-4531.
[4] Holt IJ, Harding AE, Morgon-Hughes JA. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies[J]. Nature, 1988,331(6158): 717-719.
, 百拇医药
[5] Odawara M, Yamashita K. Mitochondrial DNA abnormalities in hypertrophic cardiomyopathy[J]. Lancet, 1999,353(9147):150.
[6] Lee HC, Pang CY, Hsu HS，et al. Differential accumulations of 4 977 bp deletion in mitochondrial DNA of various tissues in human aging[J]. Biochim Biophys Acta,1994,1226(1):37-43.
[7] Miyabayashi S, Hanamizu H，Endo H, et al. A new type of mitochondrial DNA deletion in patients with encephalomyopathy[J]. J Inherit Metab Dis,1991,14(5): 805-812.
, 百拇医药
[8] Ahne A, Muller-Derlich J, Merlos-Lange AM, et al. Two distinct mechanisms for deletion in mitochondrial DNA of Schizosaccharomyces pombe mutator strains. Slipped mispairing mediated by direct repeats and erroneous intro splicing[J]. J Mol Biol, 1988, 202(4): 725-734.
[9] Mita S, Rizzuto R, Moraes CT, et al. Recombination via flanking direct repeats is a major cause of large-scale deletions of human mitochondrial DNA[J]. Nucleic Acids Res, 1990, 18(3): 561-567.
, 百拇医药
[10] Shoffner JM, Lott MT, Voljavec AS, et al. Spontaneous Kearns-Sayre / chronic external ophthalmoplegia plus syndrome associated with a mitochondrial DNA deletion: a slip-replication model and metabolic therapy[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86(20):7952-7956.
[11] Porteous WK, James AM, Sheard PW, et al. Bioenergetic consequences of accumulating the common 4 977 bp mitochondrial DNA deletion[J]. Eur J Biochem, 1998,257(1):192-201.
【收稿日期】2000-02-25
【修回日期】2000-05-20, http://www.100md.com
单位：张燕(第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)；王学敏(第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)；杨雨善(第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)；蒋蕾(第二军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，上海 200433)
关键词：DNA，线粒体；染色体缺失
第二军医大学学报000626 【摘要】 目的：了解线粒体DNA大片段缺失突变及其意义。方法：采用6种方法提取人外周血细胞DNA, 其中1种方法先分离线粒体，再抽提线粒体DNA。以得到的人外周血细胞DNA为模板进行PCR扩增，其产物经琼脂糖凝胶回收后与pGEM-T载体连接、转化、测序。结果：6种方法抽提DNA进行PCR扩增后，产物电泳行为相同，发现人血细胞线粒体DNA存在13 162 bp特大片段缺失突变。结论：此缺失是首次发现的，经测序证明为人线粒体DNA最大片段的缺失。
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【中图分类号】 Q 754 【文献标识码】 A
【文章编号】 0258-879X(2000)06-0586-04
A very large scale deletion mutation in human peripheral blood cells mitochondrial DNA
ZHANG Yan，WANG Xue-Min，YANG Yu-Shan，JIANG Lei
(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)
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ZHENG Hui-Min，XIE Hui-Jun
(Department of Neurology, Changhai Hospital)
【ABSTRACT】 Objective:To understand large scale deletion mutation in mitochondrial DNA(mtDNA) and its significance. Methods: Six methods were used to extract human peripheral blood cells DNA of which one method was that mitochondria were isolated before mtDNA extraction. PCR was carried out using obtained human peripheral blood cells DNA as template. After extracted from agarose gels，PCR products was ligated with pGEM-T vector, transformed and sequenced. Results: PCR products using template DNA extracted from above methods showed the same band in agarose electrophoresis, and a 13 162 bp mtDNA deletion mutation in human peripheral blood cells was found. Conclusion: This deletion is not reported previously and is the longest deletion in human mtDNA by sequencing.
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【KEY WORDS】 DNA，mitochondrial; chromosome deletion
线粒体是细胞内重要的细胞器之一，是真核细胞许多生物化学反应的场所，其中尤为重要的是通过氧化磷酸化作用生成ATP，供生命活动需要。人线粒体DNA编码呼吸链氧化磷酸化复合物13个蛋白质亚基，22种tRNA和2种rRNA。它呈裸露的环状双螺旋结构，缺乏蛋白保护和修复系统，容易受到线粒体本身氧化磷酸化过程中产生氧自由基的损伤，其突变率是核突变率的10～20倍。我们在研究人线粒体大片段缺失与疾病关系的过程中发现人外周血细胞存在一13.162 kb片段的缺失，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器 Taq酶, dNTP, ITPG, X-gal，基因组DNA抽提试剂盒均来自Takara Biotech公司；PCR引物由Takara Biotech公司合成； 胶回收试剂盒由Watson Biotech公司提供； pGEM-T载体由Promega公司提供；PCR仪型号为PTC-100 Programmable Thermal Control， MJ Research.Inc.USA产品。线粒体DNA/胞质病毒DNA纯化试剂盒由意大利泛特津(Vitagene)公司提供。
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1.2 DNA的制备 从8名汉族健康体检者(男性5例，女性3例，年龄22～55岁，平均43.3岁)中采集外周静脉血2 ml，3.8%枸橼酸钠抗凝。取1例用6种不同方法提取DNA，其他用方法(1)提取。方法(1) (常规标准方法) ：用红细胞裂解液(0.32 mol/L蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl,5 mmol/L MgCl2,1% Triton -100)裂解红细胞，余下按标准方法抽提[1]；方法(2)先用红细胞裂解液裂解红细胞，再以差速离心法分离线粒体，加蛋白酶K，用酚氯仿抽提，TE溶解；方法(3)： 用抽提线粒体DNA的试剂盒直接抽提mtDNA，按说明书操作；方法(4)：煮沸法，参照Davis等[3]的方法；方法(5)： 裂解红细胞后，加蛋白酶K，56℃ 1 h后，不用酚氯仿抽提，94℃ 10 min灭活加蛋白酶K;方法(6)：用抽提基因组DNA试剂盒抽提全部DNA, 按说明书操作。
1.3 PCR反应 PCR反应管内含有0.01 mol/L Tris-HCl, 0.05 mol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.375 mmol/L dNTP, 10% DMSO, 2.5 U Taq酶, 引物各20 pmol, 模板1～10 ng，总体积50 μl。根据文献[1]设计引物。引物1: 5′TCCGACATCTGGTTCCTAC 3′(np16 492～np16 511)； 引物2: 5′TGCGAACAGAGTGGTGATAGCG3′(np13 179～np13 200)。 扩增条件：95℃，5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s 29个循环；72℃ 10 min。
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1.4 PCR产物鉴定 2%琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm, 40 min, EB染色后，紫外灯下观察并照相。
1.5 凝胶中DNA的回收 按说明书操作。
1.6 连接 按以下条件进行：2×T4 DNA快速连接酶buffer 5 μl，pGEM-T 质粒(50 μg) 1 μl，回收PCR产物2 μl，T4连接酶(3 U) 1 μl, ddH2O 1 μl, 4℃过夜。
1.7 转化 制备感受态细菌，按文献[2]进行。转化：将感受态大肠杆菌DH5α 200 μl 置于1.5 ml eppendorf 管中，加10 μl已连接好的质粒DNA，轻摇混匀，置冰浴30 min，42℃ 90 s，冰浴2 min， 加800 μl LB，37℃，45 min，温和摇动(100～150 r/min)，离心，3 000 r/min，4 min，留下约200 μl上清，加IPTG(200 mg /ml)4 μl，X-Gal(50 mg/ml)16 μl，轻轻混合，涂布于LB抗性平板上，37℃培养10～12 h。
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1.8 筛选与鉴定 利用氨苄抗性与α-互补筛选阳性克隆(白斑)，取上述挑选的阳性克隆,摇菌培养, 抽取质粒,用上述引物作PCR, 并用原PCR产物作对照,观察扩增的DNA片段是否相同。
1.9 测序 由Takara 公司从菌体中提取质粒完成测序。反应试剂为：BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit。(PERKIN ELMER) 测序仪型号为 ABI PRISMTM 377 DNA Sequence。测序引物为：T7 Promotor Prime TAATACGACTCACTATAGGG。
2 结 果
2.1 DNA制备结果 6种方法提取DNA进行PCR扩增结果见图1，可见其PCR产物电泳行为一致。
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2.2 PCR PCR 产物在琼脂糖凝胶电泳中与标准DNA分子量比较可见, 扩增产物的分子量在100～200 bp 之间，以重组pGEM-T载体为模板与以血细胞DNA为模板的扩增产物相对分子质量相一致(见图2)。
图 1 6种方法提取DNA PCR 产物(2%)琼脂糖凝胶电泳
Fig 1 Agarose gel electrophoresis (2%) of PCR products
using DNA extracted by 6 kinds of methods
Lane 1：100 bp DNA ladder marker；
Lane 2～7：PCR product using template DNA
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extracted by method 1～6 respectively
图 2 PCR产物(2%)琼脂糖凝胶电泳
Fig 2 Agarose gel electrophoresis (2%) of PCR products
Lane 1～8：PCR products using blood cell DNA as template；
Lane 9：PCR products using recombiant pGEM-T vector
as template；Lane 10：100 bp DNA ladder marker
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2.3 测序 pGEM-T 载体中插入的PCR产物测序结果为：
TCCGACATCTGGTTCCTACTTCAGGGCCATAAAGC
CTAAATAGCCCACACGTTCCCCTTAAATAAGACAT
CACGATGGATCACAGGTCTATCACGCTATCACCAC
TCTGTTCGCA，双向测序结果相一致。
3 讨 论
自1988年Holt等[4]发现线粒体脑肌病患者中存在线粒体DNA缺失突变以来，至今已发现许多缺失突变，这些缺失多数在不再继续分裂的稳定组织如肌肉、脑等含量较高，而在快速分裂组织如血细胞中含量较低，其mtDNA突变的检测困难得多[5]。这可能因为血细胞分裂快，突变不易累积的缘故。因此，血细胞中发现缺失的报道远较其他组织少。如Lee等[6]在肌肉、肝脏、睾丸等组织中均发现4 977 bp的“共有缺失”，而在其检测的117例血标本中则无1例存在此缺失。
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目前抽提DNA作为PCR模板扩增线粒体DNA的方法有多种。常用方法多数是抽提总DNA，既包括核DNA，也包括线粒体DNA。为证实我们所采用的较简便的方法(方法1)得到的PCR 产物来自线粒体基因组，我们对常用的6种方法进行比较。其中方法(2) 先分离线粒体，后提取线粒体DNA，方法(3)直接抽提线粒体DNA，与其他方法比较，PCR 产物电泳行为一致，说明方法(1)是可靠的，而且我们所得序列来自线粒体基因组而非核基因组。
根据本实验测序结果，两引物间仅有74 bp，将此序列与人线粒体标准序列进行比较计算缺失约为13 162 bp。检索人线粒体基因组数据库和Medline,发现此缺失未见报道，且比数据库中报道的人线粒体DNA最长片段缺失10.9 kb[7]还要长约3 kb (图2)。此缺失范围覆盖了12S rRNA，16S rRNA，ND1，ND2，OrL，COⅠ，COⅡ，ATPase8，ATPase6，COⅢ，ND3，ND4L，部分ND5及19种tRNA，也就是说缺失了大片段的mtDNA变成长度约为3 kb的小环(minicircle)，见图3。
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图 3 人线粒体基因组图谱
Fig 3 Human mitochondrial genomic DNA map
如此大片段的缺失是如何产生的呢？目前有两种假说。Ahne等 [8] 基于对酵母的研究提出的滑脱错配即分子内同源重组机制。由于mtDNA存在大量的重复序列，当内含子剪接出现错误时会造成滑脱配对从而产生大片段缺失。本实验所发现缺失经序列分析未见重复序列的存在。另一假说为Mita[9]、Shoffner[10] 等提出的复制过程中的错配机制：mtDNA在重链起始点开始复制后，新合成的重链沿轻链模板向前推进，取代副本重链。如果在复制叉前打开了重复序列，而此时复制又被某种损伤所停止(如氧自由基造成的损伤)，重链的互补重复序列将同下游暴露在复制叉前的重复序列配对，造成D环断裂、尾部降解，产生新的3′-OH引物，又重新启动复制，这样就跳过了损伤部位继续复制。当复制结束时就产生一个突变的和一个全长的mtDNA分子。但这些假说均不令人满意：首先，尚无mtDNA有修复系统的报告，似乎不存在分子内重组机制；其次，动物mtDNA从两个起始点开始复制，任何时期不会暴露伸展的互补单链DNA。
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已报道的缺失突变大多与疾病及衰老有关。如CPEO，KSS，母系遗传糖尿病耳聋，帕金森综合征和老年性痴呆疾病等。而本实验的供血对象未发现有器质性病变，这可能是因为缺失的mtDNA占总mtDNA的比例较低，还未表现出相应的症状，因为文献报道认为只有当突变的mtDNA占总mtDNA的比例大于50%～55% 时，线粒体膜电位、ATP合成率、细胞内ATP/ADP比例均会下降，细胞的功能才会受到影响[11]。此缺失究竟与衰老有关还是与尚未出现症状的疾病有关，本室正在研究之中。
【作者简介】张燕(1970～)，女(汉族)，硕士
【作者单位】郑惠民(长海医院神经内科)
谢惠君(长海医院神经内科)
【参考文献】
[1] Ernst BP, Wilichowski E, Wagner M et al. Deletion screening of mitochondrial DNA via multiprimer DNA amplification[J]. Mol Cell Probes, 1994,8(1):45-49.
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[2] 萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T,著.金冬雁，黎孟枫 等译.分子克隆实验指南[M].第2版，北京：科学出版社，1992. 55-56.
[3] Davis RE, Miller S, Herrnstadt C, et al, Mutations in mitochondrial cytochrome c oxidase genes segregate with late-onset Alzheimer disease[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1997, 94(9):4526-4531.
[4] Holt IJ, Harding AE, Morgon-Hughes JA. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies[J]. Nature, 1988,331(6158): 717-719.
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[5] Odawara M, Yamashita K. Mitochondrial DNA abnormalities in hypertrophic cardiomyopathy[J]. Lancet, 1999,353(9147):150.
[6] Lee HC, Pang CY, Hsu HS，et al. Differential accumulations of 4 977 bp deletion in mitochondrial DNA of various tissues in human aging[J]. Biochim Biophys Acta,1994,1226(1):37-43.
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【收稿日期】2000-02-25
【修回日期】2000-05-20, http://www.100md.com