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编号:10227471
人白细胞抗原-DRB1等位基因与中国西部泡状棘球蚴病易感性的研究
http://www.100md.com 《中国医学杂志》 2000年第6期
     作者:李富荣 石佑恩 史大中 DA Vuitton PS Craig

    单位:石佑恩(武汉,同济医科大学寄生虫学教研室 430030);李富荣(现在深圳市人民医院,518020);史大中(兰州医学院寄生虫学教研室);DA Vuitton(Université de Franche-comté, France);PS Craig(Division of Biological, the University of Salford, UK)

    关键词:HLA-DR抗原;棘球蚴病;聚合酶链反应

    中华医学杂志000604 【摘要】 目的 了解人白细胞抗原(HLA)-DRB1等位基因与泡球蚴病相关性,阐明泡球蚴病的免疫学发病机制,探寻泡球蚴病的易感基因或抗病基因提供线索。方法 应用PCR/SSP技术,对中国西部甘肃省漳县、岷县泡球蚴病高流行区4个乡的35例患者和104例正常人群进行了HLA-DRB1基因型分析。结果 患者组HLA-DRB1.040x基因频率为26%(18/70),正常对照组为10%(20/208)(RR=4.45,χ2=13.67,P<0.01,EF=0.20)。HLA-DRB1.0701基因频率,患者组为3%(2/70),正常组为14%(29/208),(RR=0.16,χ2=6.26,P<0.05,PF=0.30)。其他等位基因频率在患者组与正常组间差异无显著意义(χ2=0.03~1.87,P>0.05)。结论 HLA-DRB1.040x基因与泡状棘球蚴病具有相关性,所调查地区泡球蚴病的高流行与遗传因素有关。HLA-DRB1.0701基因则对泡球蚴病感染有抵抗作用。
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    Association of HLA-DRB1 allele and the susceptibility to alveolar echinococcosis in the west of China

    LI Furong SHI Youen SHI Dazhong et al

    (Department of Parasistology, Tongji Medical University, Wuhan 430030, China)

    【Abstract】 Objective To investigat the association of HLA-DRB1 alleles and the susceptibility to alveolar echinococcosis (AE). Methods Thirty-five patients with AE in the high prevalence areas in the west of China were investigated for HLA-DRB1 gene by PCR/SSP technique. The results were compared with 104 normal healthy peoples. Results Frequency of HLA-DRB1.040x was 26% in patient group, which was significantly higher than in control group (9.62%), with a relative risk (RR) of 4.45 (χ2=13.67, P<0.01), and with an etiological fraction of 0.20. Frequency of HLA-DRB1.0701 allele was decreased in patient group (patient 2.86%, control 13.94%; χ2=6.67, P<0.05), with preventable fraction of 0.30. While the frequencies of other DRB1 alleles were not significantly different. Conclusion Susceptibility to AE is strongly associated with the HLA-DRB1.040x allele. The high prevalence of human AE in this region was associated with genetic factor. HLA-DRB1.0701 geners resistant to Echinococcus multilocularis metacestode infection.
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    【Key words】 HLA-DR Antigens; Echinococcosis; Polymerase chain reaction

    泡状棘球蚴病(AE)是由多房棘球绦虫虫卵感染人体引起的一种酷似恶性肿瘤样生长,损害非常严重的寄生虫病。尽管多房棘球绦虫在终宿主呈高度流行,但AE在人是相对罕见的。在阿拉斯加、法国、瑞士,70%~90%血清抗体阳性的人群,病灶呈钙化状态,只有10%~30%被感染人群病情迅速发展而死亡或病情处于稳定状态,表明AE在人体内的病程转归是不同[1-3]。在动物模型中证实对泡球蚴急性感染的易感性和抵抗性是受遗传所控制[4,5]。因此不同的疾病过程与虫卵无关,而决定个体免疫反映状况,由于组织相容性复合体(MHC)是控制机体免疫应答的主要基因,为此我们研究了人白细胞抗原(HLA)-DRB1基因与AE的相关性。

    对象与方法
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    一、对象

    35例AE患者为中国甘肃省漳县泡球蚴主要流行区草滩乡、韩川乡、草地合乡,及与之接壤的岷县蒲麻乡的患者。年龄12~67岁,平均41岁,其中男18例,女17例,均为汉族。AE的诊断标准:以B型超声进行筛选,对肝脏有损害的可疑病例静脉抽血,经提纯的泡球蚴抗原(EM2)及棘球蚴囊液抗原(CFCF)进行ELISA检测来确诊。对照组104例,均为当地甘肃籍体检健康者。两组对象均为甘肃籍抽样个体。

    二、方法

    1.模板制备:现场抽血10 ml,依地酸抗凝,常规分离淋巴细胞,液氮保存,按改进法从外周淋巴细胞提取基本组DNA[6],用紫外分光光度计(shimadei,Ur-120-02),测定DNA含量及纯度,其A值260 nm/280 nm应在1.6~1.8。

    2.HLA-DRB1 等位基因特异性引物(SSP):HLA-DRB1序列特异性引物(德国ESSEN大学,Grosse-wilde教授惠赠),针对DRB1第一外显子多态性设计SSP,其所扩增的产物具有等位基因特异性,分型结果和血清学方法测得的HLA-DR表型具有对应关系[7]
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    3.PCR/SSP方法:SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合,从而通过PCR反应特异性地扩增该基因片段。每一PCR反应管中含有待测基因组DNA 30~60 ng,Taq酶0.5 U,dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,美国Pharmacia公司),各200 μmol,SSP 2 pmol,PCR(Perkin-Elmer TC1)反应条件为:预变性94℃,5 min,变性94℃,30 s;退65℃,1 min;延伸72℃,1 min,共30个循环。为了监控PCR的效果,防止假阳性,同时对纯合子结果的判别更有说明力,另选人生长激素(HGH)的保护序列作内对照引物,同时扩增。引物序列为:5′引物:5′GCCTTCCCAACCATTCCCTTA3′;3′引物:5′TCACGGATTTCTGTT-GTGTTT3′。

    4.特异性扩增产物的检测:PCR扩增产物加样至含溴乙锭的体积分数为2%的琼脂糖凝胶中,在电压10~15 V/cm凝脂条件下电泳20 min,经紫外透射下泳道中见明显DNA条带为阳性(见图1,2)。
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    三、统计学处理

    用直接计算法计算基因频率,数据统计使用χ2检验或Fisher精确法。相对危险性(RR)计算按woolf公式,差异显著性检测水平为0.05,当RR具有统计学意义时,计算病因分数(EF)(RR>1时)和预防分数(PE)(RR<1时)。

    阳性带位置4,11,22,23;DNA型:DRB1.1601/.0901;1~20为DRB1等位基因特异性或组特异性;21~23各为HLA-DRB3,-DRB4,-DRB5基因特异性;HGH(429 bp)为内对照

    图1 PCR/SSP技术分析HLA-DRB1型别
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    阳性带位置8,10,22;DNA型别:DRB1.040x/.080x;1~20为DRB1等位基因特异性或组特异性;21~23各为HLA-DRB3,-DRB4,-DRB5基因特异性;HGH(429 bp)为内对照

    图2 PCR/SSP技术分析HLA-DRB1型别

    结果

    35例AE患者与104例对照组HLA-DRB1等位基因频率见表1。可见AE患者组HLA-DRB1.040x基因频率为26%(18/70),对照组为10%(20/208),两者比较差异具有显著意义(RR=4.45,χ2=13.67,P<0.01,EF=0.20)。提示,中国西部汉族人群对AE的易感性与HLA-DRB1.040x具有关联性;AE组中HLA-DRB1.0701基因频率为3%(2/70),较正常人群基因频率14%(29/208)明显减少,RR=0.16,χ2=6.26,P<0.05,PF=0.30,表明HLA-DRB1.0701基因对AE感染具有抵抗作用。其他HLA-DRB1等位基因频率在两组之间差异无显著意义,χ2=0.03~1.87,P>0.05。
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    讨论

    近年来已观察到,MHC分子和疟疾、盘尾丝虫病的保护性免疫相关,如HLA-B53 和HLA-DRB1.1302,HLA-DRB1.0501对最初疟疾感染不能提供保护,但可减轻严重程度[8,9]。在阿米巴感染中与感染症状,程度有着关联性。患肝阿米巴脓肿的成年人HLA-DR3基因频率明显增加,患阿米巴肝脓肿的儿童HLA-DR5显著增加,而HLA-DR6则缺乏[10]。由此看出HLA-Ⅱ类基因与寄生虫抗原的免疫反应水平有相关性,因为抗原处理的最终结果是以HLA-肽复合物的形式表达在细胞表面被T细胞受体识别。因此也控制着寄生虫病的病程。

    多房棘球绦虫在中国西部甘肃漳县终宿主家犬的感染率为10.2%,人群易感性较其他地区明显增高,感染率达5%[11]。我们对该地区AE患者和正常人HLA-DRB1基因多态性进行群体调查,结果表明,该地区AE患者HLA-DRB1.040x基因频率明显高于正常人群,证实HLA-DRB1.040x与AE易感性之间存在关联,从而揭示该地区人群中AE的高流行与易感染性增加有关。本研究中还发现AE患者HLA-DRB1.0701基因频率较正常人明显减少,表明HLA-DRB1.0701基因对多房棘球绦虫虫卵感染具有抵抗性。这项研究揭示了以前流行病学调查中,为什么一定比例的人群感染多房棘球绦虫虫卵后不会发展成为AE患者。
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    表1 两组对象HLA-DRB1等位基因频率(%) 组别

    例数

    HLA-DRB1

    010x

    030x

    040x.

    0701

    080x

    0901

    1001

    110x

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    130x

    140xa

    140xb

    150x

    160x

    AE组

    35

    1.43

    5.71

    25.71

    2.86

    8.57
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    5.71

    5.71

    7.14

    7.14

    4.28

    4.28

    0.00

    8.57

    5.71

    对照组

    104

    2.88

    9.6
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    9.62

    13.94

    6.73

    12.5

    4.81

    3.85

    8.17

    6.73

    4.43

    0.49

    10.58

    3.37

    注:两组比较.RR 4.45,χ2=13.67,P<0.01;RR 0.16,χ2=6.26,P<0.05;其他因素两组比较χ2=0.03~1.87,P均>0.05 Gottstein等[12]最初观察到HLA-DR13抗原和进展期AE具有关联性。近年来,Eiermann等[13]分析了151例来自法国、瑞士、德国的AE患者,发现HLA-DRB1.11在AE感染中具有保护性,只在法国的Jura地区AE患者HLA-DRB1.03 与进展期AE易感性具有关联。AE患者的易感基因和保护性基因的差异主要与不同种族的遗传背景有关。
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    参考文献

    1,Rausch RL, Wilson JF, Schantz PM, et al. Spontaneous death of Echinococcus multilocularis:cases diagnosed serological by EM2-ELISA and clinical significance. Am J Trop Med Hyg ,1987,36: 576-585.

    2,Bresson-Hadni S, Laplante JJ, Lenys D, et al. Seroepidemiologic screening of Echinococcus multilocularis infection in a European area endemic for alveolar chinococcosis. Am J Trop Med Hyg, 1994,51:837-846.
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    3,Gottstein B, Lengeler C, Bachmann P, et al. Seroepidemiological survey for alveolar echinococcosis(by Em2-ELISA) of blood donors in an endemic area of Switzerland. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1987,81:960-964.

    4,Playford MC, Kamiya M. Immune response to Echinococcus multilocularis infection in the mouse model: a revew. Jpn J Vet Res ,1992,40:113-130.

    5,Gottstein B, Wunderlin E, Tanner I. Echinococcus multilocularis: parasitespecific humoral and cellular immune response subsets in mouse strains susceptible(AKR,C57B1/6J) or ‘resistant’(C57B1/10) to secondary alveolar echinococcosis. Clin Exp Immunol, 1994,96:245-252.
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    6,Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual,2nd.Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.463-489.

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    8,Hill AVS, Allsopp CEM, Kwiatkowski D, et al. Common West African antigens are associated with prptection from severe malaria. Nature ,1991,352:595-600.
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    9,Meyer CG,Gallin M, Erttmann KD, et al. HLA-D alleles associated with generalized isease, localized disease, and putative immunity in Onchocerca volvulus infection. Proc Natl Acad Sci USA,1994,91:7515-7519.

    10,Arellano J, perez-rodriguez M, Lopez-Osuna M, et al. Increased frequency of HLA-DR3 and complotype Sco1 in Mexican mestizo children with amoebic abscess of the liver.Parasite Immunol ,1996,18:491-498.

    11,Craig P, Liu DS, Macpherson CNL, et al. A large focus of alveolar echinococcosis in central China. Lancet, 1992,340:826-831.

    12,Gottstein B, Bettens F. Association between HLA-DR13 and susceptibility to Alveolar Echinococcosis. J Infect Dis, 1994,169:1416-1417.

    13,Eiermann TH, Bettens F, Tiberghien, et al. HLA and alveolar echinococcosis. Tissue Antigens, 1998,52:124-129.

    (收稿日期:1999-08-31), http://www.100md.com