高苯丙氨酸血症大鼠基因疗法的实验研究
作者：贾兴元 刘敬忠 向华 胡维 周艳 张鹏
单位：首都医科大学附属北京红十字朝阳医院 100020
关键词：苯丙氨酸；苯丙酮尿症；乳酸乳球菌；基因疗法
中华医学杂志000626 【摘要】 目的 构建能表达活性苯丙氨酸脱氨酶(PAL)的重组质粒，使其在乳酸乳球菌(L.L)中表达,将苯丙氨酸(phe)脱氨，从而减少外周血中phe的水平,达到治疗苯丙酮尿症(PKU)或大鼠高苯丙氨酸血症的目的。方法 将欧芹PAL cDNA重组到质粒pMG36e中，转化乳酸乳球菌，用聚合酶链反应(PCR)及高效液相色谱法(HPLC)等技术筛选阳性表达株，将工程菌pMG36ePAL/L.L.制成不同剂型，“治疗”高苯丙氨酸血症模型大鼠。结果 获得了能表达PAL的乳酸乳球菌基因工程菌株。灌喂pMG36ePAL/L.L.制成的肠溶微囊及抗酸缓冲液体制剂，观察到高苯丙氨酸血症大鼠外周血phe水平明显降低(2组治疗后5 d为1.25 mg%，第12 d为1.75 mg%)，与对照组相比(治疗后5 d为3.75 mg%，第12 d为2.9 mg%)有显著性差异。不同剂型显示出的效果有差别。结论 能表达活性PAL的基因工程菌(乳酸乳球菌)的适当口服剂型，能够显著降低高苯丙氨酸血症大鼠外周血phe水平，为基因疗法治疗PKU开辟了一条可能的新途径。
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A new strategeutics of gene therapy for hyperphenylalaninemia rats
JIA Xingyuan LIU Jingzhong XIANG Hua et al
(Beijing Red-Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences Beijing, 100020 China)
【Abstract】 Objective To construct a recombinant vector which expresses active phenylalanine-amonia-lyase(PAL) in Lactococcus lactis (L.L.), and to convert phe into cinnamic acid in small intestine by the engineering L.L. to decrease the phe level in the peripheral blood, and to cure hyperphenylalaninemia rats. Methods PAL cDNA from Petroselinum crispum was subcloned into expression vector pMG36e and transformed L.L.. The pMG36ePAL/L.L. was screened and characterized by using PCR and HPLC,and prepared as enteric-coated microcapsules and oral liquid type preparation that were given orally to hyperphenylalaninemia-rats. Results Engineering L.L. expressing PAL activity was obtained. The phe levels plasma of in the rats receiving preparations made from the engineering L.L. were significantly reduced compared with non-treated hyperphenylalaninemia rats. And the effects of different preparations were different from each other. Conclusion The engineering L.L. expressing PAL activity can reduce the blood phe level of the hyperphenylalaninemia rats. This may be a potential way for PKU gene therapeutics.
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【Key words】 Phenylalanine； Phenylketonuria； Lactococcus lactis； Genetherapeutics
经典型苯丙酮尿症(以下简称PKU)系常染色体隐性遗传病。发病原因是患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因发生突变，造成苯丙氨酸(phe)及其有害代谢产物的大量积累，损伤患儿脑细胞正常发育而导致智力低下、呆傻。现行治疗方法是低苯丙氨酸饮食治疗，不但价格昂贵，要求严格限制天然蛋白的摄取,而且服用时间长(从新生儿一查出至患儿智力发育基本成熟)，患儿难以接受和持久[1]。国际上PKU专家们建议研究低phe饮食疗法的替代方法[2]。有用苯丙氨酸脱氨酶(Phenylalanine ammonia lyase, PAL EC4.3.1.5)治疗PKU的尝试[3]，但均由于酶用量大，成本高,用药途径等原因，尚未见临床试用的报道。用外源性正常人的PAH基因进行的PKU基因治疗研究也尚未见到成功的报道[4]。
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本研究利用基因重组技术，将欧芹PAL cDNA在大肠杆菌中克隆并表达，进而在人类肠道有益菌群乳酸乳球菌中表达，将后者制成适当剂型，口服，使之在小肠之中表达PAL活性，将食物消化液中的phe脱氨，转化成对人体无害的肉桂酸，从而减少进入外周血的phe达到预防及治疗PKU的目的，探索一条PKU基因疗法的新途径。
材料与方法
一、材料
含欧芹(Petroselinum crispum) PAL cDNA的质粒pBS PAL由本研究室构建[5]。乳酸乳球菌L.L.MG1363由荷兰Groningen大学J.Kok博士惠赠，其内源性质粒已去除，蛋白酶活性被缺失，适合于表达外源性基因产物。表达质粒载体pMG36e由G.Venema教授惠赠。自行设计下列两个引物用于快速鉴定含有PAL cDNA，并且插入方向正确的pMG36ePAL阳性克隆：Pvec.5′TCACAAAATGCTATA-CTAGGTAGG 3′, PPAL:5′TTAACAGATTGG-AAGAGGAGC 3′。上述引物在中科院微生物所合成。
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二、方法
1.组成型表达质粒pMG36ePAL的构建：重组质粒pBSPAL DNA经SnaB Ⅰ和Xba Ⅰ双酶解,纯化出2.2 Kb PAL cDNA片段,pMG36e经EcolCR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶解，目的cDNA片段与载体片段按3∶1混合，常规连接[6]。
2.电穿孔法转化乳酸乳球菌：感受态L.L.的制备按文献[7]进行。电穿孔用Bio-Rad Gene Pulser进行(2.5 KV/2 mm，25 uF，200 Ω)，恢复培养基用SGM17MC (+phe+Em)，铺平板固体培养基用SGM17+agar(+phe+Em)，30℃厌氧培养2～3 d。
3.乳酸乳球菌工程菌的鉴定及其表达PAL的分析：(1)菌株阳性克隆的筛选用聚合酶链反应(PCR)，按文献[8]进行。
(2)SDS-PAGE法：按常规方法进行[6]，以含空载体的L.L.为对照。
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(3)表达的PAL活性检测：单菌落接种于GM17(+phe+Em)培养基，37℃培养1 d。相同培养基稀释后继续培养，每6h取菌液,进行处理后,HPLC法测phe被PAL脱氨产物肉桂酸的含量，方法详见[9]。用HPLC法测phe浓度以反映PAL活性。方法详见文献[10]：流速为1 ml/min；检测波长为211 nm。
4.工程菌的冻干及肠溶微囊的制备：离心收集pMG36ePAL/L.L MG1363及pMG36e/L.L MG1363菌泥, 加入冻干保护剂溶液，冷冻干燥至样品含水量少于4%。将冻干菌粉分装后密封，储存在4℃及30℃。在不同时间取样，在GM17(+phe+Em)培养基上划板，30℃厌氧培养72h，检测其活菌数。
采用混合脂包埋法，将pMG36ePAL/L.L MG1363及pMG36e/L.L MG1363冻干菌粉分别制成活菌肠溶微囊，置于人工胃液及人工肠液中不同时间后，于GM17(+phe+Em)培养基上划板。30℃厌氧培养72 h，对菌落进行计数，并计算保护效果。
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5.工程菌活菌灌胃液体剂型的制备：(1)抗酸缓冲型：pMG36ePAL/L.L.工程菌在MRS培养基(加有PBS缓冲剂：pH 8.0, 0.1mol/L)中厌氧培养至109/ml。(2)含NaHCO3型：将工程菌菌泥用含phe 25 mg/ml的NaHCO3等渗水溶液(pH 8.0)悬浮，该制剂含活菌1010 CFU/ml。
6.高苯丙氨酸血症大鼠模型的基因疗法实验：第一批动物实验选健康雄性大鼠，体重100～120 g。从第1～3 d连续3d，每天一次腹腔注射p-CP 300 mg/kg体重，及100 mg phe/kg[11]。第4～12 d，每天灌喂一次50 mg/2 ml的phe溶液。从第1 d到第12 d，治疗Ⅰ组(11只)，每天喂含活菌数达109的PAL L.L.工程菌肠溶微囊；治疗Ⅱ组(10只)，每天一次灌喂抗酸缓冲型基因工程菌液2 ml；对照组(10只)，每天一次灌喂含活空载体菌约109的肠溶微囊。
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第二批动物实验中，除治疗组(15只)灌喂的基因工程菌剂型由抗酸缓冲型改为含NaHCO3型，对照Ⅰ组(15只)由空载体菌肠溶微囊型，改为空载体菌含NaHCO3液体型，对照Ⅱ组(11只)则灌喂不含任何菌的含NaHCO3等渗溶液，其它条件与第一批动物实验相同。于治疗试验第1、5、12 d，取大鼠尾尖血，HPLC法测定phe含量。于第1、10 d，取大鼠粪便，测定细菌总数、乳酸乳球菌数及其百分含量(见方法7)。
7.实验大鼠粪便中细菌总数/乳酸乳球菌含量的测定：取1 g粪便，悬浮在9 ml生理盐水中，进行进一步稀释，分别在BL、EG、TS和GM17(+phe+Em)培养基上划板。TS培养基在37℃有氧培养24 h，其余三种37℃厌氧培养72 h。进行革兰氏染色分析，统计各皿细菌总数和乳酸乳球菌(GM17皿)数及其在总细菌数中所占百分比。
8.统计学处理方法，采用t检验，在SPSS软件上进行。
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结果
1.组成型表达重组质粒pMG36ePAL的亚克隆构建及电穿孔法转化乳酸乳球菌。pMG36ePAL的构建按图1流程进行。连接产物电穿孔法转化感受态L.L.的转化效率约1.0～1.3×103转化子/μg质粒DNA。
2.能表达活性PAL的乳酸乳球菌工程菌的筛选与鉴定：PCR技术快速筛选阳性克隆的电泳结果见图2。有2.2 Kb扩增带的即为有PAL cDNA插入且方向正确的克隆。
随培养时间的延长，阳性克隆工程菌培养基中肉桂酸浓度逐渐增加(图3)，24 h已达1.778 mg/ml。说明工程菌所表达的PAL具有较好的使phe脱氨生成肉桂酸的活性和特异性。同时测定了phe量的变化，结果显示随培养时间的延长，phe含量逐渐降低。
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图1 pMG36ePAL构建流程图
M：λDNA/Hind Ⅲ酶解物，1～5为不同菌株，特异扩增带为2.2 kb
图2 PCR技术快速筛选有PALcDNA正确插入的阳性克隆
图3 用HPLC测定pMG36ePAL/L.L.工程菌培养液中
肉桂酸生成量动态图
3.工程菌冻干保护剂的选择及肠溶微囊的制备：在所试用的5种冻干保护剂中，以脱脂牛奶+10%蔗糖为最佳，3个月时冻干活菌指数为10.45，存活89.2%；其次为脱脂牛奶+10%乳糖。
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利用这种冻干保护剂制得冻干菌粉，进而制成肠溶微囊，在体外人工胃液、人工肠液试验表明，其对活菌的保护率达70%。
4.能表达活性PAL的乳酸乳球菌工程菌口服制剂，治疗高苯丙氨酸血症大鼠的疗效观察：第一批动物实验结果见图4。治疗Ⅰ组、Ⅱ组、对照组分别灌喂肠溶微囊、缓冲型液体剂型及空载体菌。可见治疗Ⅰ组和Ⅱ组均显示出明显的降低高苯丙氨酸血症大鼠外周血中phe水平的作用，差异有显著意义；并且缓冲型液体剂型比肠溶微囊效果要好。
*与对照组比较差异有显著意义
图4 治疗不同时间各实验组大鼠血中phe的浓度变化
经测定实验大鼠第1 d和第10 d粪便中细菌数，发现总菌数无大变化；治疗第10 d的乳酸乳球菌数，治疗Ⅱ组明显比治疗Ⅰ组高，差异有显著意义(P<0.01)。
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第二批动物实验，在治疗的第4 d，第7 d，测定大鼠血中phe水平，虽治疗组较二个对照组为低，但差异无显著意义。在第15 d，治疗组比二个对照组均低，且与对照I组的差异有显著意义(P<0.05)。
另外，大鼠体重在实验过程中绝大多数都有增加，各组间无明显差异。实验过程中共死亡6只大鼠，其中5只属于对照组，1只属给药治疗组。
讨论
我们在系统深入地分析了PKU的低phe饮食治疗、PAL酶法治疗及体细胞基因治疗等疗法的利弊的基础上，制定了本研究方案，本研究由于重组质粒并没有进入体细胞，只是穿肠而过，或在小肠粘膜有一定程度的定植，故无病毒载体整合入基因组，可能激活癌基因等的顾虑；由于工程菌表达的PAL在小肠内使消化液中phe破坏，故患者的饮食可望不必受到象接受低phe饮食疗法那样的严格限制，生活质量大大提高；由于省去了常规的对基因表达产物进行分离纯化的步骤，从而降低了成本。
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本研究将能表达活性PAL的L.L.制成不同的口服剂型治疗高苯丙氨酸血症大鼠。将活菌冻干菌粉制成肠溶微囊首先考虑到的是便于储存，且用药较方便。结果饲喂肠溶微囊的治疗I组较之对照组显示出显著的降低模型大鼠尾血phe水平的作用(第12 d时，P=0.048<0.05)；但效果不如抗酸缓冲型活菌液态饮剂(治疗Ⅱ组)，而且治疗Ⅰ组大鼠粪便中乳酸菌总数及占全部检出菌的百分比均不如治疗Ⅱ组高。可能的原因是肠溶微囊虽可保护工程菌不被胃酸杀死而达到小肠后崩解出来；但被释放出的工程菌开始仍处于一种休眠状态，等它们在肠液及体温条件下逐渐复性并表达PAL活性时，可能大部分已随同肠液移动到回肠甚至大肠去了，从而错过了使phe转化的关键性时刻和位置。而抗酸缓冲型，工程菌一直保持活的状态，未被胃酸杀死者，一进入空肠，即可在消化液中生活，表达PAL发挥使phe脱氨的作用。同时这种剂型较含NaHCO3的液态剂型效果也好。后者对活菌的保护作用可能不如前者。另外，在动物实验过程中共死亡6只大鼠，其中5只属于对照组，可能是由于高苯丙氨酸血症但没得到“治疗”，造成食欲不佳，健康状况下降而死亡。另一只属于实验组，为意外死亡。这也说明本基因工程菌的治疗除降低实验大鼠外周血phe水平外，对动物的整体健康状况也有改善作用。是一条很有前途的PKU基因疗法的新途径。
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基金项目：本课题为北京市自然科学基金资助项目(7952012)
参考文献
1，Scriver CR. The Hyperphenylalanine in “The metabolic basis of inherited disease” edited by Scriver CR. et al. 6th Edition. Mc Craw-Hill Co. New York, 1989,1:495-546.
2，Medical Research Council Working party on phenylketonurea. British Medical J, 1993, 396: 115.
3，Ambrus CM, Anthone S, Horvath C, et al. Extracorporeal Enzyme Reactors for depletion of phenylalanine in phenylketonurea. Ann Internal Medicine, 1987,106:531-537.
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4，Eisensmith RC,Wool SL. Gene therapy for phenyketonuria. Eur J Pediatr, 1996,155Suppl1: S16-19.
5，刘敬忠，向华，胡维，等.苯丙氨酸脱氨酶cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达.生物工程学报，1998,14:384-388.
6，Sambrook J, Fritsch FF, Maniatis T. Molecular cloning-A laboratory manual, 2nd Ed. New York, Cold Spring Harbor laboratory Press,1989.
7，Wells JM, Willson PW, Le page RWF. Improved cloning vectors and transformation procedure for lactococcus lactis. J Appl Bacter, 1993,74:629-636.
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8，Lee AB, Cooper TA. Improved direct PCR screen for bacterial colonies: wooden toothpicks inhibit PCR amplification. Biotechniques, 1995,18: 225-226.
9，Scott DA, Hammond PM, Brearley GM, et al. Identification by high performance liquid chromatography of tyrosine ammonia-lyase activty in purified fractions of Phaseolus vulgaris phenylalanine ammonia-lyase. J Chromatogr , 1992, 573: 309-312.
10，Zhang LF, Yu YL, Yang RY. Direct Determination of phe in gerum extracts of phenylketonurea patients by reversed-phase high performance liquid chromatography. J Chromatogr, 1983, 282: 333-339.
11，Greengard ODG, Delvalle J. In: Medels for the study of inborn errors metobolism. hommes FA(ed), Elseviery North/Holland Biomedical press. Amsterdam,1979,125-130.
(收稿日期：1999-07-07), 百拇医药
单位：首都医科大学附属北京红十字朝阳医院 100020
关键词：苯丙氨酸；苯丙酮尿症；乳酸乳球菌；基因疗法
中华医学杂志000626 【摘要】 目的 构建能表达活性苯丙氨酸脱氨酶(PAL)的重组质粒，使其在乳酸乳球菌(L.L)中表达,将苯丙氨酸(phe)脱氨，从而减少外周血中phe的水平,达到治疗苯丙酮尿症(PKU)或大鼠高苯丙氨酸血症的目的。方法 将欧芹PAL cDNA重组到质粒pMG36e中，转化乳酸乳球菌，用聚合酶链反应(PCR)及高效液相色谱法(HPLC)等技术筛选阳性表达株，将工程菌pMG36ePAL/L.L.制成不同剂型，“治疗”高苯丙氨酸血症模型大鼠。结果 获得了能表达PAL的乳酸乳球菌基因工程菌株。灌喂pMG36ePAL/L.L.制成的肠溶微囊及抗酸缓冲液体制剂，观察到高苯丙氨酸血症大鼠外周血phe水平明显降低(2组治疗后5 d为1.25 mg%，第12 d为1.75 mg%)，与对照组相比(治疗后5 d为3.75 mg%，第12 d为2.9 mg%)有显著性差异。不同剂型显示出的效果有差别。结论 能表达活性PAL的基因工程菌(乳酸乳球菌)的适当口服剂型，能够显著降低高苯丙氨酸血症大鼠外周血phe水平，为基因疗法治疗PKU开辟了一条可能的新途径。
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A new strategeutics of gene therapy for hyperphenylalaninemia rats
JIA Xingyuan LIU Jingzhong XIANG Hua et al
(Beijing Red-Cross Chaoyang Hospital, Capital University of Medical Sciences Beijing, 100020 China)
【Abstract】 Objective To construct a recombinant vector which expresses active phenylalanine-amonia-lyase(PAL) in Lactococcus lactis (L.L.), and to convert phe into cinnamic acid in small intestine by the engineering L.L. to decrease the phe level in the peripheral blood, and to cure hyperphenylalaninemia rats. Methods PAL cDNA from Petroselinum crispum was subcloned into expression vector pMG36e and transformed L.L.. The pMG36ePAL/L.L. was screened and characterized by using PCR and HPLC,and prepared as enteric-coated microcapsules and oral liquid type preparation that were given orally to hyperphenylalaninemia-rats. Results Engineering L.L. expressing PAL activity was obtained. The phe levels plasma of in the rats receiving preparations made from the engineering L.L. were significantly reduced compared with non-treated hyperphenylalaninemia rats. And the effects of different preparations were different from each other. Conclusion The engineering L.L. expressing PAL activity can reduce the blood phe level of the hyperphenylalaninemia rats. This may be a potential way for PKU gene therapeutics.
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【Key words】 Phenylalanine； Phenylketonuria； Lactococcus lactis； Genetherapeutics
经典型苯丙酮尿症(以下简称PKU)系常染色体隐性遗传病。发病原因是患者苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因发生突变，造成苯丙氨酸(phe)及其有害代谢产物的大量积累，损伤患儿脑细胞正常发育而导致智力低下、呆傻。现行治疗方法是低苯丙氨酸饮食治疗，不但价格昂贵，要求严格限制天然蛋白的摄取,而且服用时间长(从新生儿一查出至患儿智力发育基本成熟)，患儿难以接受和持久[1]。国际上PKU专家们建议研究低phe饮食疗法的替代方法[2]。有用苯丙氨酸脱氨酶(Phenylalanine ammonia lyase, PAL EC4.3.1.5)治疗PKU的尝试[3]，但均由于酶用量大，成本高,用药途径等原因，尚未见临床试用的报道。用外源性正常人的PAH基因进行的PKU基因治疗研究也尚未见到成功的报道[4]。
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本研究利用基因重组技术，将欧芹PAL cDNA在大肠杆菌中克隆并表达，进而在人类肠道有益菌群乳酸乳球菌中表达，将后者制成适当剂型，口服，使之在小肠之中表达PAL活性，将食物消化液中的phe脱氨，转化成对人体无害的肉桂酸，从而减少进入外周血的phe达到预防及治疗PKU的目的，探索一条PKU基因疗法的新途径。
材料与方法
一、材料
含欧芹(Petroselinum crispum) PAL cDNA的质粒pBS PAL由本研究室构建[5]。乳酸乳球菌L.L.MG1363由荷兰Groningen大学J.Kok博士惠赠，其内源性质粒已去除，蛋白酶活性被缺失，适合于表达外源性基因产物。表达质粒载体pMG36e由G.Venema教授惠赠。自行设计下列两个引物用于快速鉴定含有PAL cDNA，并且插入方向正确的pMG36ePAL阳性克隆：Pvec.5′TCACAAAATGCTATA-CTAGGTAGG 3′, PPAL:5′TTAACAGATTGG-AAGAGGAGC 3′。上述引物在中科院微生物所合成。
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二、方法
1.组成型表达质粒pMG36ePAL的构建：重组质粒pBSPAL DNA经SnaB Ⅰ和Xba Ⅰ双酶解,纯化出2.2 Kb PAL cDNA片段,pMG36e经EcolCR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶解，目的cDNA片段与载体片段按3∶1混合，常规连接[6]。
2.电穿孔法转化乳酸乳球菌：感受态L.L.的制备按文献[7]进行。电穿孔用Bio-Rad Gene Pulser进行(2.5 KV/2 mm，25 uF，200 Ω)，恢复培养基用SGM17MC (+phe+Em)，铺平板固体培养基用SGM17+agar(+phe+Em)，30℃厌氧培养2～3 d。
3.乳酸乳球菌工程菌的鉴定及其表达PAL的分析：(1)菌株阳性克隆的筛选用聚合酶链反应(PCR)，按文献[8]进行。
(2)SDS-PAGE法：按常规方法进行[6]，以含空载体的L.L.为对照。
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(3)表达的PAL活性检测：单菌落接种于GM17(+phe+Em)培养基，37℃培养1 d。相同培养基稀释后继续培养，每6h取菌液,进行处理后,HPLC法测phe被PAL脱氨产物肉桂酸的含量，方法详见[9]。用HPLC法测phe浓度以反映PAL活性。方法详见文献[10]：流速为1 ml/min；检测波长为211 nm。
4.工程菌的冻干及肠溶微囊的制备：离心收集pMG36ePAL/L.L MG1363及pMG36e/L.L MG1363菌泥, 加入冻干保护剂溶液，冷冻干燥至样品含水量少于4%。将冻干菌粉分装后密封，储存在4℃及30℃。在不同时间取样，在GM17(+phe+Em)培养基上划板，30℃厌氧培养72h，检测其活菌数。
采用混合脂包埋法，将pMG36ePAL/L.L MG1363及pMG36e/L.L MG1363冻干菌粉分别制成活菌肠溶微囊，置于人工胃液及人工肠液中不同时间后，于GM17(+phe+Em)培养基上划板。30℃厌氧培养72 h，对菌落进行计数，并计算保护效果。
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5.工程菌活菌灌胃液体剂型的制备：(1)抗酸缓冲型：pMG36ePAL/L.L.工程菌在MRS培养基(加有PBS缓冲剂：pH 8.0, 0.1mol/L)中厌氧培养至109/ml。(2)含NaHCO3型：将工程菌菌泥用含phe 25 mg/ml的NaHCO3等渗水溶液(pH 8.0)悬浮，该制剂含活菌1010 CFU/ml。
6.高苯丙氨酸血症大鼠模型的基因疗法实验：第一批动物实验选健康雄性大鼠，体重100～120 g。从第1～3 d连续3d，每天一次腹腔注射p-CP 300 mg/kg体重，及100 mg phe/kg[11]。第4～12 d，每天灌喂一次50 mg/2 ml的phe溶液。从第1 d到第12 d，治疗Ⅰ组(11只)，每天喂含活菌数达109的PAL L.L.工程菌肠溶微囊；治疗Ⅱ组(10只)，每天一次灌喂抗酸缓冲型基因工程菌液2 ml；对照组(10只)，每天一次灌喂含活空载体菌约109的肠溶微囊。
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第二批动物实验中，除治疗组(15只)灌喂的基因工程菌剂型由抗酸缓冲型改为含NaHCO3型，对照Ⅰ组(15只)由空载体菌肠溶微囊型，改为空载体菌含NaHCO3液体型，对照Ⅱ组(11只)则灌喂不含任何菌的含NaHCO3等渗溶液，其它条件与第一批动物实验相同。于治疗试验第1、5、12 d，取大鼠尾尖血，HPLC法测定phe含量。于第1、10 d，取大鼠粪便，测定细菌总数、乳酸乳球菌数及其百分含量(见方法7)。
7.实验大鼠粪便中细菌总数/乳酸乳球菌含量的测定：取1 g粪便，悬浮在9 ml生理盐水中，进行进一步稀释，分别在BL、EG、TS和GM17(+phe+Em)培养基上划板。TS培养基在37℃有氧培养24 h，其余三种37℃厌氧培养72 h。进行革兰氏染色分析，统计各皿细菌总数和乳酸乳球菌(GM17皿)数及其在总细菌数中所占百分比。
8.统计学处理方法，采用t检验，在SPSS软件上进行。
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结果
1.组成型表达重组质粒pMG36ePAL的亚克隆构建及电穿孔法转化乳酸乳球菌。pMG36ePAL的构建按图1流程进行。连接产物电穿孔法转化感受态L.L.的转化效率约1.0～1.3×103转化子/μg质粒DNA。
2.能表达活性PAL的乳酸乳球菌工程菌的筛选与鉴定：PCR技术快速筛选阳性克隆的电泳结果见图2。有2.2 Kb扩增带的即为有PAL cDNA插入且方向正确的克隆。
随培养时间的延长，阳性克隆工程菌培养基中肉桂酸浓度逐渐增加(图3)，24 h已达1.778 mg/ml。说明工程菌所表达的PAL具有较好的使phe脱氨生成肉桂酸的活性和特异性。同时测定了phe量的变化，结果显示随培养时间的延长，phe含量逐渐降低。
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图1 pMG36ePAL构建流程图
M：λDNA/Hind Ⅲ酶解物，1～5为不同菌株，特异扩增带为2.2 kb
图2 PCR技术快速筛选有PALcDNA正确插入的阳性克隆
图3 用HPLC测定pMG36ePAL/L.L.工程菌培养液中
肉桂酸生成量动态图
3.工程菌冻干保护剂的选择及肠溶微囊的制备：在所试用的5种冻干保护剂中，以脱脂牛奶+10%蔗糖为最佳，3个月时冻干活菌指数为10.45，存活89.2%；其次为脱脂牛奶+10%乳糖。
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利用这种冻干保护剂制得冻干菌粉，进而制成肠溶微囊，在体外人工胃液、人工肠液试验表明，其对活菌的保护率达70%。
4.能表达活性PAL的乳酸乳球菌工程菌口服制剂，治疗高苯丙氨酸血症大鼠的疗效观察：第一批动物实验结果见图4。治疗Ⅰ组、Ⅱ组、对照组分别灌喂肠溶微囊、缓冲型液体剂型及空载体菌。可见治疗Ⅰ组和Ⅱ组均显示出明显的降低高苯丙氨酸血症大鼠外周血中phe水平的作用，差异有显著意义；并且缓冲型液体剂型比肠溶微囊效果要好。
*与对照组比较差异有显著意义
图4 治疗不同时间各实验组大鼠血中phe的浓度变化
经测定实验大鼠第1 d和第10 d粪便中细菌数，发现总菌数无大变化；治疗第10 d的乳酸乳球菌数，治疗Ⅱ组明显比治疗Ⅰ组高，差异有显著意义(P<0.01)。
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第二批动物实验，在治疗的第4 d，第7 d，测定大鼠血中phe水平，虽治疗组较二个对照组为低，但差异无显著意义。在第15 d，治疗组比二个对照组均低，且与对照I组的差异有显著意义(P<0.05)。
另外，大鼠体重在实验过程中绝大多数都有增加，各组间无明显差异。实验过程中共死亡6只大鼠，其中5只属于对照组，1只属给药治疗组。
讨论
我们在系统深入地分析了PKU的低phe饮食治疗、PAL酶法治疗及体细胞基因治疗等疗法的利弊的基础上，制定了本研究方案，本研究由于重组质粒并没有进入体细胞，只是穿肠而过，或在小肠粘膜有一定程度的定植，故无病毒载体整合入基因组，可能激活癌基因等的顾虑；由于工程菌表达的PAL在小肠内使消化液中phe破坏，故患者的饮食可望不必受到象接受低phe饮食疗法那样的严格限制，生活质量大大提高；由于省去了常规的对基因表达产物进行分离纯化的步骤，从而降低了成本。
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本研究将能表达活性PAL的L.L.制成不同的口服剂型治疗高苯丙氨酸血症大鼠。将活菌冻干菌粉制成肠溶微囊首先考虑到的是便于储存，且用药较方便。结果饲喂肠溶微囊的治疗I组较之对照组显示出显著的降低模型大鼠尾血phe水平的作用(第12 d时，P=0.048<0.05)；但效果不如抗酸缓冲型活菌液态饮剂(治疗Ⅱ组)，而且治疗Ⅰ组大鼠粪便中乳酸菌总数及占全部检出菌的百分比均不如治疗Ⅱ组高。可能的原因是肠溶微囊虽可保护工程菌不被胃酸杀死而达到小肠后崩解出来；但被释放出的工程菌开始仍处于一种休眠状态，等它们在肠液及体温条件下逐渐复性并表达PAL活性时，可能大部分已随同肠液移动到回肠甚至大肠去了，从而错过了使phe转化的关键性时刻和位置。而抗酸缓冲型，工程菌一直保持活的状态，未被胃酸杀死者，一进入空肠，即可在消化液中生活，表达PAL发挥使phe脱氨的作用。同时这种剂型较含NaHCO3的液态剂型效果也好。后者对活菌的保护作用可能不如前者。另外，在动物实验过程中共死亡6只大鼠，其中5只属于对照组，可能是由于高苯丙氨酸血症但没得到“治疗”，造成食欲不佳，健康状况下降而死亡。另一只属于实验组，为意外死亡。这也说明本基因工程菌的治疗除降低实验大鼠外周血phe水平外，对动物的整体健康状况也有改善作用。是一条很有前途的PKU基因疗法的新途径。
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基金项目：本课题为北京市自然科学基金资助项目(7952012)
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(收稿日期：1999-07-07), 百拇医药