抑制消减杂交(SSH)在肿瘤相关基因克隆中的应用
作者：陈杰 钱桂生
单位：陈杰 钱桂生(第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所,重庆400037)
关键词：抑制消减杂交；肿瘤；基因
癌症000635
中图分类号：Q785 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)06-0614-03
90年代以来，在人类基因组计划的推动下，基因克隆技术发展迅速，数种基于消减杂交策略的基因克隆技术相继问世。这些方法不依赖于已知基因的位置和功能，直接在基因组中从DNA和RNA水平获得有意义的目的基因片段。其中有人们比较熟悉的差异筛选、消减杂交和mRNA差异显示法，以及近几年新提出的代表性差异分析法(representational differenceanalysis,RDA)、抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)和交互消减RNA差别显示法(reciprocalsubtractiondifferentialdisplay，RSDD)等。以上的方法都是以消减杂交为基础，经过不断的完善发展起来的，本文就新近提出的抑制消减杂交(SSH)的产生、原理、特点和其在基因克隆中的应用做简要综述。
, 百拇医药
1 SSH产生的背景
高等真核生物约含有10万个不同基因，但在生物体的发育过程中只有15%的基因得以表达。而这大约15000个基因的表达是按时间和空间顺序有序地进行着，这种表达方式即为基因的差别表达(differentialexpression)。而分子生物学的首要任务之一便是要比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，这不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提。为此人们建立起了一系列差异消减杂交方法：如差异筛选、消减杂交、RDA、SSH和RSDD法等。
差异筛选(differentialscreening)和消减杂交(subtractivehybridization)技术是早期建立的、经典的、使用广泛的两项技术。两者的共同特点是：均特别适用于分离经特殊处理而被诱发表达的基因，并且不需任何有关目的基因的核苷酸序列信息。此外，两项技术的采用首先都要拥有两种不同的细胞群体，即表达诱导目的基因的细胞群和不表达诱导目的基因的细胞群，并分别分离出各自的总mRNA。差异筛选虽然应用广泛，但有一些缺陷，一是：灵敏度低，该方法对于高丰度的mRNA而言是一种有效方法，而对低丰度的mRNA的cDNA克隆则很难用此法检测出；二是：该技术需大量杂交滤膜，鉴定大量噬菌斑或克隆片段,费事费钱，且两套平行转移滤膜间必然存在cDNA量的误差，故重复性差。
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消减杂交则是针对差异筛选的局限性，为进一步提高筛选效率而发展的。它是通过构建富含目的基因序列的cDNA文库方法进行基因分离的。其本质就是除去那些普遍共同存在的或非诱发产生的cDNA序列，从而使目的基因序列得到有效富集，提高了分离敏感性。但消减杂交仍存在重复性差、敏感度低的缺点，这些均限制了这一技术更广泛的使用。
1992年LiangP[1]等建立了mRNA差异显示法(mRNAdifferentialdisplay)或DDRT-PCR法，此项技术的特点是原理简单，所用技术成熟，灵敏度高，可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。但是mRNA差异显示法的缺点和它的优点一样明显，高达70%的假阳性率成了它的致命伤。为此许多研究者从设计对照、提取胞质RNA、更换放射性标记物以及改变PCR反应条件等方面提出了相应解决方案，以求这一技术得到进一步完善。进一步的发展导致了代表性差异分析法的产生。
1993年，Lisitsyn等[2]发展了代表性差异分析法，其目的在于减少假阳性，增加重复性。该技术充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过消减和富集，使得目的基因片段得到特异性扩增。1994年Hubank[3]将RDA改良，即用识别四碱基的限制性内切酶代替识别六碱基的限制性内切酶消化cDNA，用于比较具有相近遗传背景，但表型不同的两组cDNA之间的差异序列。但如果两组cDNA之间存在较大差异，以及某些基因在检测子(Tester)中存在上调表达(up-regulatedexpression)时，此方法显得力不从心，达不到预期目的。为有效克服基因上调表达所造成不利的影响，以及RDA或cDNARDA不能分离两组基因表达差异相差较小的基因的不足，1996年DiatchenkoL[4，5]等在RDA的基础上发展了抑制消减杂交。
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2 SSH的主要原理和基本过程
SSH技术是以抑制PCR(suppre-ssionPCR)为基础，将标准化检测子cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异的cDNA的概率，简化了消减文库的分析。因此SSH是RDA的进一步发展。所谓抑制PCR是利用链内退火优先于链间退火，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(longinvertedrepeats)在退火时产生“锅柄样”(panhandle-like)结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制非目标序列的扩增，同时根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度差别的cDNA相对含量基本一致(其原理如图1所示)。
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图1 SSH实验流程图
2.1 SSH的基本过程
抽提两种不同细胞(tester和driver)的mRNA，反转录成cDNA，用限制性内切酶酶切，以产生大小适当的平头末端cDNA片段。
将testercDNA分成均等的两份，各自接上两种接头，接头(adaptor)由一长链(40nt)和一短链(10nt)组成的一端是平端的双链DNA片段，长链3′端与cDNA5′端相连。长链外侧序列(约20nt)与第一次PCR引物序列相同，而内侧序列则与第二次引物序列同。此外，接头上含有T7启动子序列及内切酶识别位点，为以后连接克隆载体和测序提供方便。
与过量的drivercDNA变性后退火杂交，第一次杂交后有4种产物：a是单链testercDNA，b是自身退火的testercDNA同源双链，c是tester和drivercDNA的异源双链，d是单链drivercDNA。第一次杂交的目的是实现tester单链cDNA均等化(normalization)，即使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致，由于testercDNA中与drivercDNA序列相似的片段大都和driver形成异源双链分子(c)，使testercDNA中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集。第一次杂交后达到了两个目的，第一：差异表达的cDNA序列得到大量扩增；第二：单链的testercDNA(a)得到标准化。
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第一次杂交后，合并两份杂交产物，再加上新的变性driver单链cDNA，再次退火杂交，此时，只有第一次杂交后经丰度均等化和消减的单链testercDNA和drivercDNA一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，并产生了一种新的双链分子(e)，它的两个5’端分别连上了来自两个样本的不同的接头，在加入与之相匹配的引物作PCR扩增时，只有(e)才能呈指数扩增，而两端连上相同接头的同一片段(b)由于末端保留了长反转重复序列，在变性退火的过程中形成“锅柄样”结构而不能呈指数扩增。因此，最终的结果是drivercDNA与testercDNA中的相同部分得到抑制，而在drivercDNA中缺乏却存在于testercDNA的序列，即差异表达cDNA序列得到显著的扩增。
3 SSH的特点
3.1 SSH的优点
3.1.1假阳性率低：这是它的最大优点，由于SSH方法采用两次消减杂交和两次PCR，保证了该方法具有较高特异性。据有关报道证明SSH方法假阳性率可降至6%。
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3.1.2高敏感性：在差异显示法(differentialdisplay,DD)和RDA中，低丰度的mRNA一般不易被检出，SSH方法所做的均等化和目标片段的富集，保证了低丰度mRNA也可能被检出。
3.1.3速度快，效率高：一次SSH反应可以同时分离几十或成百个差异表达基因。
3.2 SSH的不足
第一：SSH技术对起始材料要求较多，需要几微克量的mRNA，若mRNA量不够，那么低丰度的差异表达基因的cDNA很可能会检测不到，这是SSH技术不能被广泛应用的主要障碍。
第二：SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不再是全长cDNA，这个缺陷可通过cDNA末端扩增RACE或electronicRACE等获取全长cDNA的方法加以解决。
, http://www.100md.com 第三：所研究材料的差异不能太大，要有良好的遗传背景，最好是细微差异。
表1 SSH克隆的新基因 基因
时间
Tester
Driver
作者
Kiss-1
1996
人转移黑色素瘤细胞系
人非转移黑色素瘤细胞系
LeeJH[6]
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腺癌转移相关基因
1997
腺癌转移细胸BSP73-ASML
腺癌非转移细胞BSP73-IAS
Von Stein[7]
睾丸和卵巢特异表达基因
1997
组织特cDNA序列
9种人组织cDNA
Jin H[8]
WT1靶基因
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1998
人胚胎肾细胞(HEK)CMY-293
WTI-6细胞
Guan LS[9]
hAG-2
1998
非洲爪蟾属腺体
乳腺癌细胞系
Thompson DA[10]
乳腺癌雌激素受体阳性相关基因(DEME-6)
1998
, 百拇医药
雌激素受体阳性细腻胞MCF7
雌激素受体阴性细胞MDA-MB-231
Kuang WW[11]
乳腺癌雌激素受体阳性相关基因
1998
雌激素受体阴性细胞MDA-MB-231
雌激素受体阳性细胞MCF7
Carmeci C[12]
脑缺血耐受相关基因(编码TIMP-1)
1998
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缺血脑组织
无缺血脑组织
Wang X[13]
结缔组织生和因子相关基因
1999
高浓度葡萄糖诱导的人肾小球细胞
低浓度葡萄糖诱导的人肾小球细胞
Murphy M[14]
肾细胞癌相关基因
1999
肾细胞癌组织
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未转化肾组织
Pizer C[15]
视网膜色素上皮特异表达基因
1999
视网膜色素上皮细胞
视网膜上皮细胞
Den Hollander AI[16]
4 SSH的应用进展
SSH自1996年报道以来，该技术已被50余名研究者所采用，发表论文46篇，并与其他分子生物学技术相结合，如DNA芯片技术，克隆了多种新基因(表1)。其中以SSH的建立者DiatchonkoL所在的CLONTECH实验室和斯坦福大学RonaldJWeigel研究小组的工作最为出色，前者主要克隆分析了睾丸和卵巢特异表达基因，后者则克隆分析了乳腺癌雌激素受体阳性相关基因(DEME-6)和乳腺癌雌激素受体阴性相关基因。
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1999年YangGP[17]等将SSH和cDNA微排列技术结合，高效分析差异表达cDAN克隆。首先将SSH分离的cDNA差异表达克隆经PCR扩增后，用机械臂在玻片上点样，形成cDNA微排列，然后将cDNA微排列与荧光标记的RNA探针进行杂交，RNA探针分别来自乳腺癌雌激素受体阳性细胞(MCF7，T47D)和乳腺癌雌激素受体阴性细胞(MDA-MB-231，HBL-100)，有10个克隆在雌激素受体阴性细胞中过度表达，Northern分析验证了这10个cDNA序列。序列分析说明其中4个克隆与细胞发育蛋白(cytokeratin)、GATA-3、CD24蛋白和谷胱甘肽S转移酶mu-3同源。其余6个cDNA克隆中4个与来自2个不同基因的EST序列相匹配，2个为新序列。流式细胞分析和免疫荧光证明CD24蛋白在雌激素受体阳性细胞中过度表达。作者认为SSH和微排列技术结合可成功克隆差异表达基因，而不需要预先获得克隆的cDNA。1999年德国的PitzerC[18]用SSH获得肾细胞癌组织与非转化肾组织差异表达基因。获得9个在肾细胞癌中差异表达的cDNA，序列分析表明7个与已知基因同源，剩余2个在GenBank/EMBL数据库中未发现相同序列，表明这2个序列可能为新基因。克隆的7个已知基因中的5个与肿瘤的恶性表型有关，说明SSH无论对细胞株和肿瘤组织都是一种高灵敏度的有效的鉴别差异表达序列的方法。
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综上所述，SSH是一种灵敏度高，假阳性率低的差异基因筛选技术，随着SSH的不断完善，将对发现新基因起重要作用。
[参考文献]
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7，Von Stein OD, Thies WG, Hormann M. A high throughput screening for rarely transcribed differentially expressed genes [J]. Nucleic Acids Res, 1997, 25(13)： 2598～ 2602.
8，Jin H, Cheng X, Diatchenko L. Differential screening of a subtracted cDNA library： a method to search for genes preferentially expressed in multiple tissues [J]. Biotechniques, 1997,23(6)： 1084～ 1086.
9，Guan LS, Rauchman M, Wang ZY, et al. Induction of Rb-associated protein (RbAp46) by Wilms' tumor suppressor WT1 mediates growth inhibition [J]. J Biol Chem,1998,273(42)： 27047～ 27050.
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11，Kuang WW, Thompson DA, Hoch RV, et al. Differential screening and suppression subtractive hybridization identified genes differentially expressed in an estrogen receptor-positive breast carcinoma cell line [J]. Nucleic Acids Res, 1998,26(4)： 1116～ 1123.
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12，Carmeci C, Rhompson DA, Kuang WW， et al. Moesin expression is associated with the estrogen receptor-negative breast cancer phenotype [J]. Surgery, 1998, 124(2)： 211～ 217.
13，Wang X, Yaish-Ohad S, Li X, et al. Use of suppression subtractive hybri-dization strategy for discovery of increased tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 gene expression in brain ischemic tolerance [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1998, 18(11)： 1173～ 1177.
, 百拇医药
14，Murphy M, Godson C, Cannon S, et al. Suppression subtractive hybri-dization identifies high glucose levels as a stimulus for expression of connective tissue growth factor and other genes in human mesangial cells [J]. J Biol Chem, 1999,274(9)： 5830～ 5834.
15，Pitzer C,Stassar M,Zoller. MIdentifi-cation of renal-cell-carcinoma-related cDNA clones by suppression subtractive hybridization [J]. J Cancer Res Clin Oncol, 1999, 125(8-9)： 487～ 492.
, 百拇医药
16，Den Hollander AI, van Driel MA, de Kok YJ, et al.Isolation and mapping of novel candidate genes for retinal disorders using suppression subtractive hybridization [J]. Genomics, 1999,58(3)： 240～ 249.
17，Yang GP, Ross DT, Kuang WW, et al. Combining SSH and cDNA microarrays for rapid identification of differentially expressed genes [J]. Nucleic Acids Res, 1999, 27(6)： 1517～ 1523.
18，Pitzer C, Stassar M, Zoller M. Identification of renal-cell-carcinoma-related cDNA clones by suppression subtractive hybridization [J]. J Cancer Res Clin Oncol, 1999,125(8-9)： 487～ 492.
收稿日期：1999-10-07;修回日期：1999-11-22, 百拇医药
单位：陈杰 钱桂生(第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所,重庆400037)
关键词：抑制消减杂交；肿瘤；基因
癌症000635
中图分类号：Q785 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)06-0614-03
90年代以来，在人类基因组计划的推动下，基因克隆技术发展迅速，数种基于消减杂交策略的基因克隆技术相继问世。这些方法不依赖于已知基因的位置和功能，直接在基因组中从DNA和RNA水平获得有意义的目的基因片段。其中有人们比较熟悉的差异筛选、消减杂交和mRNA差异显示法，以及近几年新提出的代表性差异分析法(representational differenceanalysis,RDA)、抑制消减杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)和交互消减RNA差别显示法(reciprocalsubtractiondifferentialdisplay，RSDD)等。以上的方法都是以消减杂交为基础，经过不断的完善发展起来的，本文就新近提出的抑制消减杂交(SSH)的产生、原理、特点和其在基因克隆中的应用做简要综述。
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1 SSH产生的背景
高等真核生物约含有10万个不同基因，但在生物体的发育过程中只有15%的基因得以表达。而这大约15000个基因的表达是按时间和空间顺序有序地进行着，这种表达方式即为基因的差别表达(differentialexpression)。而分子生物学的首要任务之一便是要比较不同细胞或不同基因型在基因表达上的差异，这不仅是研究生命过程分子机制的基础，亦是分离克隆目的基因的前提。为此人们建立起了一系列差异消减杂交方法：如差异筛选、消减杂交、RDA、SSH和RSDD法等。
差异筛选(differentialscreening)和消减杂交(subtractivehybridization)技术是早期建立的、经典的、使用广泛的两项技术。两者的共同特点是：均特别适用于分离经特殊处理而被诱发表达的基因，并且不需任何有关目的基因的核苷酸序列信息。此外，两项技术的采用首先都要拥有两种不同的细胞群体，即表达诱导目的基因的细胞群和不表达诱导目的基因的细胞群，并分别分离出各自的总mRNA。差异筛选虽然应用广泛，但有一些缺陷，一是：灵敏度低，该方法对于高丰度的mRNA而言是一种有效方法，而对低丰度的mRNA的cDNA克隆则很难用此法检测出；二是：该技术需大量杂交滤膜，鉴定大量噬菌斑或克隆片段,费事费钱，且两套平行转移滤膜间必然存在cDNA量的误差，故重复性差。
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消减杂交则是针对差异筛选的局限性，为进一步提高筛选效率而发展的。它是通过构建富含目的基因序列的cDNA文库方法进行基因分离的。其本质就是除去那些普遍共同存在的或非诱发产生的cDNA序列，从而使目的基因序列得到有效富集，提高了分离敏感性。但消减杂交仍存在重复性差、敏感度低的缺点，这些均限制了这一技术更广泛的使用。
1992年LiangP[1]等建立了mRNA差异显示法(mRNAdifferentialdisplay)或DDRT-PCR法，此项技术的特点是原理简单，所用技术成熟，灵敏度高，可同时比较两种以上不同来源的mRNA样品间基因表达的差异。但是mRNA差异显示法的缺点和它的优点一样明显，高达70%的假阳性率成了它的致命伤。为此许多研究者从设计对照、提取胞质RNA、更换放射性标记物以及改变PCR反应条件等方面提出了相应解决方案，以求这一技术得到进一步完善。进一步的发展导致了代表性差异分析法的产生。
1993年，Lisitsyn等[2]发展了代表性差异分析法，其目的在于减少假阳性，增加重复性。该技术充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过消减和富集，使得目的基因片段得到特异性扩增。1994年Hubank[3]将RDA改良，即用识别四碱基的限制性内切酶代替识别六碱基的限制性内切酶消化cDNA，用于比较具有相近遗传背景，但表型不同的两组cDNA之间的差异序列。但如果两组cDNA之间存在较大差异，以及某些基因在检测子(Tester)中存在上调表达(up-regulatedexpression)时，此方法显得力不从心，达不到预期目的。为有效克服基因上调表达所造成不利的影响，以及RDA或cDNARDA不能分离两组基因表达差异相差较小的基因的不足，1996年DiatchenkoL[4，5]等在RDA的基础上发展了抑制消减杂交。
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2 SSH的主要原理和基本过程
SSH技术是以抑制PCR(suppre-ssionPCR)为基础，将标准化检测子cDNA单链步骤和消减杂交步骤合为一体的技术。标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异的cDNA的概率，简化了消减文库的分析。因此SSH是RDA的进一步发展。所谓抑制PCR是利用链内退火优先于链间退火，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(longinvertedrepeats)在退火时产生“锅柄样”(panhandle-like)结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制非目标序列的扩增，同时根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度差别的cDNA相对含量基本一致(其原理如图1所示)。
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图1 SSH实验流程图
2.1 SSH的基本过程
抽提两种不同细胞(tester和driver)的mRNA，反转录成cDNA，用限制性内切酶酶切，以产生大小适当的平头末端cDNA片段。
将testercDNA分成均等的两份，各自接上两种接头，接头(adaptor)由一长链(40nt)和一短链(10nt)组成的一端是平端的双链DNA片段，长链3′端与cDNA5′端相连。长链外侧序列(约20nt)与第一次PCR引物序列相同，而内侧序列则与第二次引物序列同。此外，接头上含有T7启动子序列及内切酶识别位点，为以后连接克隆载体和测序提供方便。
与过量的drivercDNA变性后退火杂交，第一次杂交后有4种产物：a是单链testercDNA，b是自身退火的testercDNA同源双链，c是tester和drivercDNA的异源双链，d是单链drivercDNA。第一次杂交的目的是实现tester单链cDNA均等化(normalization)，即使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致，由于testercDNA中与drivercDNA序列相似的片段大都和driver形成异源双链分子(c)，使testercDNA中的差异表达基因的目标cDNA得到大量富集。第一次杂交后达到了两个目的，第一：差异表达的cDNA序列得到大量扩增；第二：单链的testercDNA(a)得到标准化。
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第一次杂交后，合并两份杂交产物，再加上新的变性driver单链cDNA，再次退火杂交，此时，只有第一次杂交后经丰度均等化和消减的单链testercDNA和drivercDNA一起形成各种双链分子，这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA，并产生了一种新的双链分子(e)，它的两个5’端分别连上了来自两个样本的不同的接头，在加入与之相匹配的引物作PCR扩增时，只有(e)才能呈指数扩增，而两端连上相同接头的同一片段(b)由于末端保留了长反转重复序列，在变性退火的过程中形成“锅柄样”结构而不能呈指数扩增。因此，最终的结果是drivercDNA与testercDNA中的相同部分得到抑制，而在drivercDNA中缺乏却存在于testercDNA的序列，即差异表达cDNA序列得到显著的扩增。
3 SSH的特点
3.1 SSH的优点
3.1.1假阳性率低：这是它的最大优点，由于SSH方法采用两次消减杂交和两次PCR，保证了该方法具有较高特异性。据有关报道证明SSH方法假阳性率可降至6%。
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3.1.2高敏感性：在差异显示法(differentialdisplay,DD)和RDA中，低丰度的mRNA一般不易被检出，SSH方法所做的均等化和目标片段的富集，保证了低丰度mRNA也可能被检出。
3.1.3速度快，效率高：一次SSH反应可以同时分离几十或成百个差异表达基因。
3.2 SSH的不足
第一：SSH技术对起始材料要求较多，需要几微克量的mRNA，若mRNA量不够，那么低丰度的差异表达基因的cDNA很可能会检测不到，这是SSH技术不能被广泛应用的主要障碍。
第二：SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不再是全长cDNA，这个缺陷可通过cDNA末端扩增RACE或electronicRACE等获取全长cDNA的方法加以解决。
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表1 SSH克隆的新基因 基因
时间
Tester
Driver
作者
Kiss-1
1996
人转移黑色素瘤细胞系
人非转移黑色素瘤细胞系
LeeJH[6]
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腺癌转移相关基因
1997
腺癌转移细胸BSP73-ASML
腺癌非转移细胞BSP73-IAS
Von Stein[7]
睾丸和卵巢特异表达基因
1997
组织特cDNA序列
9种人组织cDNA
Jin H[8]
WT1靶基因
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1998
人胚胎肾细胞(HEK)CMY-293
WTI-6细胞
Guan LS[9]
hAG-2
1998
非洲爪蟾属腺体
乳腺癌细胞系
Thompson DA[10]
乳腺癌雌激素受体阳性相关基因(DEME-6)
1998
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雌激素受体阳性细腻胞MCF7
雌激素受体阴性细胞MDA-MB-231
Kuang WW[11]
乳腺癌雌激素受体阳性相关基因
1998
雌激素受体阴性细胞MDA-MB-231
雌激素受体阳性细胞MCF7
Carmeci C[12]
脑缺血耐受相关基因(编码TIMP-1)
1998
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缺血脑组织
无缺血脑组织
Wang X[13]
结缔组织生和因子相关基因
1999
高浓度葡萄糖诱导的人肾小球细胞
低浓度葡萄糖诱导的人肾小球细胞
Murphy M[14]
肾细胞癌相关基因
1999
肾细胞癌组织
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未转化肾组织
Pizer C[15]
视网膜色素上皮特异表达基因
1999
视网膜色素上皮细胞
视网膜上皮细胞
Den Hollander AI[16]
4 SSH的应用进展
SSH自1996年报道以来，该技术已被50余名研究者所采用，发表论文46篇，并与其他分子生物学技术相结合，如DNA芯片技术，克隆了多种新基因(表1)。其中以SSH的建立者DiatchonkoL所在的CLONTECH实验室和斯坦福大学RonaldJWeigel研究小组的工作最为出色，前者主要克隆分析了睾丸和卵巢特异表达基因，后者则克隆分析了乳腺癌雌激素受体阳性相关基因(DEME-6)和乳腺癌雌激素受体阴性相关基因。
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1999年YangGP[17]等将SSH和cDNA微排列技术结合，高效分析差异表达cDAN克隆。首先将SSH分离的cDNA差异表达克隆经PCR扩增后，用机械臂在玻片上点样，形成cDNA微排列，然后将cDNA微排列与荧光标记的RNA探针进行杂交，RNA探针分别来自乳腺癌雌激素受体阳性细胞(MCF7，T47D)和乳腺癌雌激素受体阴性细胞(MDA-MB-231，HBL-100)，有10个克隆在雌激素受体阴性细胞中过度表达，Northern分析验证了这10个cDNA序列。序列分析说明其中4个克隆与细胞发育蛋白(cytokeratin)、GATA-3、CD24蛋白和谷胱甘肽S转移酶mu-3同源。其余6个cDNA克隆中4个与来自2个不同基因的EST序列相匹配，2个为新序列。流式细胞分析和免疫荧光证明CD24蛋白在雌激素受体阳性细胞中过度表达。作者认为SSH和微排列技术结合可成功克隆差异表达基因，而不需要预先获得克隆的cDNA。1999年德国的PitzerC[18]用SSH获得肾细胞癌组织与非转化肾组织差异表达基因。获得9个在肾细胞癌中差异表达的cDNA，序列分析表明7个与已知基因同源，剩余2个在GenBank/EMBL数据库中未发现相同序列，表明这2个序列可能为新基因。克隆的7个已知基因中的5个与肿瘤的恶性表型有关，说明SSH无论对细胞株和肿瘤组织都是一种高灵敏度的有效的鉴别差异表达序列的方法。
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综上所述，SSH是一种灵敏度高，假阳性率低的差异基因筛选技术，随着SSH的不断完善，将对发现新基因起重要作用。
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收稿日期：1999-10-07;修回日期：1999-11-22, 百拇医药