应用原位杂交和细胞遗传学方法检测淋巴瘤患者的染色体畸变
作者：周俊 翁立红 张颜明 顾文祥
单位：周俊 翁立红 张颜明 顾文祥(浙江大学湖滨校区组胚教研室,浙江杭州310006)
关键词：染色体；淋巴瘤；原位杂交
癌症000609
【摘要】目的：检测淋巴瘤患者的染色体畸变。方法：运用细胞遗传学方法检测15例淋巴瘤初发病人的外周血淋巴细胞。运用原位杂交技术检测21例淋巴瘤患者的病变淋巴结7号三体(+7)和12号三体(+12)的发生率，其中12例与外周血染色体标本为同一患者。结果：外周血染色体分析表明：自然状态下和丝裂霉素C诱导下，淋巴瘤组的染色体断裂率和细胞畸变率均比正常对照组高。原位杂交检测发现21例中5例有+7(23.8%)，3例有+12(14.3%)。结论：淋巴瘤患者外周血淋巴细胞染色体具有不稳定和易断裂的特点。+7和+12是淋巴瘤常见的染色体畸变。
, 百拇医药
中图分类号：R733.1 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)06-0538-03
Detection of chromosome aberration of patients with lymphoma
by in situ hybridization and cytogenetic technology
ZHOU Jun, WENG Li-hong, ZHANG Yan-ming, et al.
Department of Histology and Embryology,Hubing district of Zhejiang University，Hangzhou 310006,P.R.China
, 百拇医药
【 Abstract】 Objective:To detect chromosome aberration of patients with lymphoma. Methods:Peripheral lymphocytes of 15 patients who were pathologically diagnosed as primary lymphoma were detected by cytogenetic technology. Lymphoid nodes of 21 lymphomas cases were detected by in situ hybridization to get the incident rate of +7 and +12. Among 21 cases,12 cases were the same patients of peripheral samples. Results:Both in nature and MMC(mitomycin C)condition, chromosome breakages rate and percentages of aberrant cell in patients of lymphomas were higher than that in control group.Using in situ hybridization,+7 was detected in 5 cases of 21(23.8% ), +12 was detected in 3 cases (14.3% ). Conclusions: There are chromosome instability and easiness of break in peripheral blood lymphocytes of lymphoma patients. Trisomy 7 and trisomy 12 are common chromosome aberrations in lymphoma.
, 百拇医药
Key words： Chromosome; Lymphoma; In situ hybridization
许多研究表明肿瘤患者外周血染色体结构畸变能反映个体的遗传不稳定性，但是对肿瘤的进一步研究需要涉及到肿瘤组织，而肿瘤组织往往难以培养并取得足够的中期分裂相供细胞遗传学研究。原位杂交(insituhybridization,ISH)是一种利用荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质标记的核酸探针，检测细胞及染色体上特定DNA序列数目和结构等改变的方法，该技术既能检测分裂相，又能检测间期细胞，所以又称间期细胞遗传学(interphasecytogenetics)技术[1]。
根据以往的细胞遗传学和最近的国外报道[2,3]，淋巴瘤常见的染色体异常有7三体、12三体、X三体、6q-等，但由于受到细胞遗传学技术的限制，对这些染色体异常没有系统、一致的报道。本实验运用原位杂交技术检测淋巴瘤7号、12号染色体，并和传统的细胞遗传学相结合，研究淋巴瘤患者遗传物质的改变和肿瘤组织的染色体畸变，对探讨淋巴瘤的发生、发展、诊断和预后具有一定的意义。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1病例和取材
选取10例手术取下的无病变淋巴结作为正常对照组。21例经临床、病理确诊为淋巴瘤的病变淋巴结作为病变组，其中12例淋巴瘤初发病人同时取外周静脉血经常规培养后检测其染色体畸变率(未接受任何化疗和放疗)。淋巴结淋巴细胞经直接法制成。
1.2原位杂交
1.2.1淋巴结细胞悬液制备：淋巴结淋巴细胞采用直接法制成：手术取下的淋巴结标本置于0.9%生理盐水中，去除附属物后用眼科剪将其充分剪碎，取悬浮液，低渗、离心后用新鲜配制的甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液固定，10%胰酶37℃消化10min，PB液充分冲洗后再用固定液固定，制成合适浓度的细胞悬液，冰湿片滴片，置37℃培养箱中放置2h，使充分干燥。
1.2.2探针：生物素标记的4号、7号、12号染色体着丝粒特异性探针(美国Oncor公司生产)。其中4号探针作为内对照，排除多倍体。杂交液的组成为1μl探针原液加9μl稀释液，稀释液成分为60%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖及1×SSC。
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1.2.3杂交及检测：原位杂交采用ABC法。取1μl杂交液滴于细胞富含区，盖圆形盖玻片后用胶封闭，在75～80℃中变性8min后，置于37℃杂交过夜，约杂交16h。第二天停止杂交后玻片在60℃预温的1×SSC液(pH8.0)中冲洗3次，每次2min。用3%的H2O2液37℃作用10min，PB液冲洗。滴SABC液(链霉素-生物素-过氧化酶复合物)1滴，20～37℃作用15min，PB液冲洗，滴DAB染色液1滴，避光作用10min。镜下观察反应结果。每例至少分析200个细胞，在排除多倍体的前提下，根据患者3个杂交信号的细胞百分比是否大于对照组
±2s，确定有无+7、+12。
2 结果
原位杂交结果：10例正常对照组97%以上的细胞有杂交点，其中94.3%细胞显示二个杂交点(图1)，即一对正常的染色体，4%～5%的细胞仅有一个杂交点，可能是一对着丝粒重叠的缘故，0.5%～4.3%的细胞有三个杂交点，可能由非特异性杂交所形成。根据正常对照组实验结果和参考文献，设限定值(Cut-Off-Limit)为5%，即标本中有5%以上的细胞有三个杂交信号，即认为该标本有三体存在。21例标本中除例5中4号、7号、12号三种探针三个信号的比例均大于5%(表1)，不能排除多倍体之外，其余20例标本4号探针的三个信号百分比均小于5%，可排除多倍体。其中5例显示7号三体阳性(图2)，检出率23.8%，3例显示12号三体阳性，检出率14.3%。
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表1 21例淋巴瘤4、7、12号染色体三体检测结果三个杂交信号百分比(%) 例号
性别
年龄
(岁)
诊断
三个杂交信号百分比
4号
7号
12号
5
男
37
, http://www.100md.com HL
15.46
11.94
17.56
7
男
31
HL
1.00
24.29
3.50
11
男
, 百拇医药 48
NHL
2.50
6.40
2.89
15
女
46
NHL
2.06
12.00
18.41
16
, 百拇医药 男
32
NHL
1.00
34.20
27.83
20
男
58
NHL
320
9.31
9.05
, http://www.100md.com NHL：非霍奇金氏淋巴瘤;HL：霍奇金病
表2 淋巴瘤患者在自然状态下外周血染色体畸变与淋巴结7、12号染色体三体检出率比较 例号
外周血染色体畸变率(%)
淋巴结三个信号百分比(%)
7
12
1
16.7
1.02
0.47
2
13.3
, http://www.100md.com
1.44
2.14
3
6.7
1.47
1.63
4
13.3
1.92
1.00
*5
16.7
11.94
, 百拇医药
17.56
6
20.0
1.98
4.43
*7
20.0
24.29
3.50
8
13.3
0.97
3.48
, 百拇医药
9
20.0
3.45
0.84
10
10.0
3.39
0.97
*11
16.7
6.40
2.89
12
, 百拇医药
10.0
2.49
2.36
图1 箭头所示细胞有2个棕色的杂交信号，代表一对正常的4号染色体,×1000 DAB染色，Giemsa复染
图2 箭头所示细胞有3个棕色的杂交信号,代表例7的7号染色体三体,×1000 DAB染色，Giemsa复染
21例病例中有12例病例同时取其外周静脉血检测了染色体畸变率，结果发现有7号三体或12号三体的病例其外周血染色体的畸变率相应也较高，且染色体发生重排、出现双微体等结构畸变的机会也增多。外周血染色体畸变结果与淋巴结三体检出率比较结果见表2。
, 百拇医药
3 讨论
常规的染色体分析包括细胞培养、染色体制片以及分带等，只有在获得足够数量、染色体带型清晰的分裂相时，才能做出详细而全面的染色体核型分析。由于肿瘤细胞的生物学特征，往往得不到足够的分裂相供细胞遗传学分析。原位杂交(ISH)技术因其具有准确、敏感，既能检测分裂相，又能检测间期细胞等优点，近几年在肿瘤遗传学领域得到广泛应用[4]。
本实验采用ABC法，整个方法快速、简单，从收集标本到得出结果只要1～2天时间，只需普通实验设备就能操作，结果分析简单、直观，初学者很快就能掌握整个实验过程，并适合临床快速检查。ISH既能在少量的分裂相上，也能在所有间期核中进行染色体及基因分析，不仅省略了复杂而费时的细胞培养，而且大大扩大了染色体畸变的检查范围，有利于检查数量极少的恶性细胞，因此比传统的细胞遗传学方法敏感，检查结果更能真实地反映组织内的细胞组成情况。
在淋巴瘤和白血病中，+7、+12是常见的染色体继发性畸变[5]。而且有+7或+12的患者存活期短，预后较差[6]。据文献报道[2,3]淋巴瘤中4号染色体的结构和数目畸变较为少见，本实验选用4号染色体作为内对照，以排除多倍体，来检测肿瘤细胞中7号三体(+7)和12号三体(+12)的发生频率。染色体三体的限定值(阈值)设定为5%，此限定值高于10例对照组中三种探针三个信号检出率的+2s，可避免高估染色体三体的发生率，并和有关文献报道相一致[6]。本实验21例病例中5例有+7，检出率23.8%，3例有+12，检出率14.3%。
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从表2可见，淋巴结有7号三体和12号三体的病例其外周血染色体畸变率也较高，故有必要进一步收集标本，探索淋巴瘤发生过程中其外周血淋巴细胞染色体变化和瘤组织染色体变化的关系，对探讨淋巴瘤的发生、发展和预后具有较大的参考价值。
引起染色体三体的原因可能因人体本身免疫缺陷或EB病毒感染引起细胞有丝分裂时出现染色体不分离[7]。淋巴瘤中除+7、+12外，也常见+3、+18、+X等数目改变[3]。这些染色体改变可能均与淋巴瘤的发生、发展有密切关系，尤其是位于这些染色体上的某些基因可能因染色体三体出现基因剂量效应而激发幼稚的淋巴细胞过度生长[7]。
原位杂交技术比细胞遗传学方法敏感、准确，但其并不能检测肿瘤细胞内的所有克隆以及一个克隆内的所有染色体畸变，如本实验使用4号、7号、12号特异性染色体着丝粒探针，就无法检测其它的染色体畸变，所以该技术与传统的细胞遗传学方法相结合将发挥更大的作用。
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基金项目：本课题受浙江省教委基金(No：961063)资助
[参考文献]
1，Cremer T,Landegent J,Bruckner A, et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non- radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84 [J]. Hum genet, 1986， 74(3): 346～ 352.
2，卢洁，谷仁凯，周容,等.42例恶性淋巴瘤的细胞遗传学研究[J].白血病,1997;6(3)：156～159.
, 百拇医药
3，Ott G,Kalla J,Steinhoff A,et al. Trisomy 3 is not a common feature in malignant lymphomas of mucosa- associated lymphoid tissue type [J]. Am J Pathol, 1998, 153(3):689～ 694.
4，张颜明.荧光原位杂交技术及其在肿瘤遗传学研究中的应用[J].浙江医科大学学报,1995,24(5)：232～235.
5，Motokura T, Arnold A. Cyclins and oncogenesis [J]. Biochim Biophys Acta,1993, 1155(25):63～ 78.
6，Cuneo A, Wlodarska I,Sayed Aly M,et al. Non- radioactive in situ hybridization for the detection and monitoring of trisomy 12 in B- cell chronic lymphocytic leukemia [J]. Br J Haematol, 1992,81:192～ 196.
7，张颜明，SchlegelbergerB.慢性B淋巴细胞白血病的荧光原位杂交研究[J].中华血液学杂志,1995,16(8)：414～416.
收稿日期：1999-11-16；修回日期：1999-12-13, 百拇医药
单位：周俊 翁立红 张颜明 顾文祥(浙江大学湖滨校区组胚教研室,浙江杭州310006)
关键词：染色体；淋巴瘤；原位杂交
癌症000609
【摘要】目的：检测淋巴瘤患者的染色体畸变。方法：运用细胞遗传学方法检测15例淋巴瘤初发病人的外周血淋巴细胞。运用原位杂交技术检测21例淋巴瘤患者的病变淋巴结7号三体(+7)和12号三体(+12)的发生率，其中12例与外周血染色体标本为同一患者。结果：外周血染色体分析表明：自然状态下和丝裂霉素C诱导下，淋巴瘤组的染色体断裂率和细胞畸变率均比正常对照组高。原位杂交检测发现21例中5例有+7(23.8%)，3例有+12(14.3%)。结论：淋巴瘤患者外周血淋巴细胞染色体具有不稳定和易断裂的特点。+7和+12是淋巴瘤常见的染色体畸变。
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中图分类号：R733.1 文献标识码：A
文章编号：1000-467X(2000)06-0538-03
Detection of chromosome aberration of patients with lymphoma
by in situ hybridization and cytogenetic technology
ZHOU Jun, WENG Li-hong, ZHANG Yan-ming, et al.
Department of Histology and Embryology,Hubing district of Zhejiang University，Hangzhou 310006,P.R.China
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【 Abstract】 Objective:To detect chromosome aberration of patients with lymphoma. Methods:Peripheral lymphocytes of 15 patients who were pathologically diagnosed as primary lymphoma were detected by cytogenetic technology. Lymphoid nodes of 21 lymphomas cases were detected by in situ hybridization to get the incident rate of +7 and +12. Among 21 cases,12 cases were the same patients of peripheral samples. Results:Both in nature and MMC(mitomycin C)condition, chromosome breakages rate and percentages of aberrant cell in patients of lymphomas were higher than that in control group.Using in situ hybridization,+7 was detected in 5 cases of 21(23.8% ), +12 was detected in 3 cases (14.3% ). Conclusions: There are chromosome instability and easiness of break in peripheral blood lymphocytes of lymphoma patients. Trisomy 7 and trisomy 12 are common chromosome aberrations in lymphoma.
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Key words： Chromosome; Lymphoma; In situ hybridization
许多研究表明肿瘤患者外周血染色体结构畸变能反映个体的遗传不稳定性，但是对肿瘤的进一步研究需要涉及到肿瘤组织，而肿瘤组织往往难以培养并取得足够的中期分裂相供细胞遗传学研究。原位杂交(insituhybridization,ISH)是一种利用荧光素、生物素、地高辛等非放射性物质标记的核酸探针，检测细胞及染色体上特定DNA序列数目和结构等改变的方法，该技术既能检测分裂相，又能检测间期细胞，所以又称间期细胞遗传学(interphasecytogenetics)技术[1]。
根据以往的细胞遗传学和最近的国外报道[2,3]，淋巴瘤常见的染色体异常有7三体、12三体、X三体、6q-等，但由于受到细胞遗传学技术的限制，对这些染色体异常没有系统、一致的报道。本实验运用原位杂交技术检测淋巴瘤7号、12号染色体，并和传统的细胞遗传学相结合，研究淋巴瘤患者遗传物质的改变和肿瘤组织的染色体畸变，对探讨淋巴瘤的发生、发展、诊断和预后具有一定的意义。
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1 材料和方法
1.1病例和取材
选取10例手术取下的无病变淋巴结作为正常对照组。21例经临床、病理确诊为淋巴瘤的病变淋巴结作为病变组，其中12例淋巴瘤初发病人同时取外周静脉血经常规培养后检测其染色体畸变率(未接受任何化疗和放疗)。淋巴结淋巴细胞经直接法制成。
1.2原位杂交
1.2.1淋巴结细胞悬液制备：淋巴结淋巴细胞采用直接法制成：手术取下的淋巴结标本置于0.9%生理盐水中，去除附属物后用眼科剪将其充分剪碎，取悬浮液，低渗、离心后用新鲜配制的甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液固定，10%胰酶37℃消化10min，PB液充分冲洗后再用固定液固定，制成合适浓度的细胞悬液，冰湿片滴片，置37℃培养箱中放置2h，使充分干燥。
1.2.2探针：生物素标记的4号、7号、12号染色体着丝粒特异性探针(美国Oncor公司生产)。其中4号探针作为内对照，排除多倍体。杂交液的组成为1μl探针原液加9μl稀释液，稀释液成分为60%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖及1×SSC。
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1.2.3杂交及检测：原位杂交采用ABC法。取1μl杂交液滴于细胞富含区，盖圆形盖玻片后用胶封闭，在75～80℃中变性8min后，置于37℃杂交过夜，约杂交16h。第二天停止杂交后玻片在60℃预温的1×SSC液(pH8.0)中冲洗3次，每次2min。用3%的H2O2液37℃作用10min，PB液冲洗。滴SABC液(链霉素-生物素-过氧化酶复合物)1滴，20～37℃作用15min，PB液冲洗，滴DAB染色液1滴，避光作用10min。镜下观察反应结果。每例至少分析200个细胞，在排除多倍体的前提下，根据患者3个杂交信号的细胞百分比是否大于对照组
±2s，确定有无+7、+12。2 结果
原位杂交结果：10例正常对照组97%以上的细胞有杂交点，其中94.3%细胞显示二个杂交点(图1)，即一对正常的染色体，4%～5%的细胞仅有一个杂交点，可能是一对着丝粒重叠的缘故，0.5%～4.3%的细胞有三个杂交点，可能由非特异性杂交所形成。根据正常对照组实验结果和参考文献，设限定值(Cut-Off-Limit)为5%，即标本中有5%以上的细胞有三个杂交信号，即认为该标本有三体存在。21例标本中除例5中4号、7号、12号三种探针三个信号的比例均大于5%(表1)，不能排除多倍体之外，其余20例标本4号探针的三个信号百分比均小于5%，可排除多倍体。其中5例显示7号三体阳性(图2)，检出率23.8%，3例显示12号三体阳性，检出率14.3%。
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表1 21例淋巴瘤4、7、12号染色体三体检测结果三个杂交信号百分比(%) 例号
性别
年龄
(岁)
诊断
三个杂交信号百分比
4号
7号
12号
5
男
37
, http://www.100md.com HL
15.46
11.94
17.56
7
男
31
HL
1.00
24.29
3.50
11
男
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NHL
2.50
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15
女
46
NHL
2.06
12.00
18.41
16
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32
NHL
1.00
34.20
27.83
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男
58
NHL
320
9.31
9.05
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表2 淋巴瘤患者在自然状态下外周血染色体畸变与淋巴结7、12号染色体三体检出率比较 例号
外周血染色体畸变率(%)
淋巴结三个信号百分比(%)
7
12
1
16.7
1.02
0.47
2
13.3
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1.44
2.14
3
6.7
1.47
1.63
4
13.3
1.92
1.00
*5
16.7
11.94
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17.56
6
20.0
1.98
4.43
*7
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24.29
3.50
8
13.3
0.97
3.48
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20.0
3.45
0.84
10
10.0
3.39
0.97
*11
16.7
6.40
2.89
12
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10.0
2.49
2.36
图1 箭头所示细胞有2个棕色的杂交信号，代表一对正常的4号染色体,×1000 DAB染色，Giemsa复染
图2 箭头所示细胞有3个棕色的杂交信号,代表例7的7号染色体三体,×1000 DAB染色，Giemsa复染
21例病例中有12例病例同时取其外周静脉血检测了染色体畸变率，结果发现有7号三体或12号三体的病例其外周血染色体的畸变率相应也较高，且染色体发生重排、出现双微体等结构畸变的机会也增多。外周血染色体畸变结果与淋巴结三体检出率比较结果见表2。
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3 讨论
常规的染色体分析包括细胞培养、染色体制片以及分带等，只有在获得足够数量、染色体带型清晰的分裂相时，才能做出详细而全面的染色体核型分析。由于肿瘤细胞的生物学特征，往往得不到足够的分裂相供细胞遗传学分析。原位杂交(ISH)技术因其具有准确、敏感，既能检测分裂相，又能检测间期细胞等优点，近几年在肿瘤遗传学领域得到广泛应用[4]。
本实验采用ABC法，整个方法快速、简单，从收集标本到得出结果只要1～2天时间，只需普通实验设备就能操作，结果分析简单、直观，初学者很快就能掌握整个实验过程，并适合临床快速检查。ISH既能在少量的分裂相上，也能在所有间期核中进行染色体及基因分析，不仅省略了复杂而费时的细胞培养，而且大大扩大了染色体畸变的检查范围，有利于检查数量极少的恶性细胞，因此比传统的细胞遗传学方法敏感，检查结果更能真实地反映组织内的细胞组成情况。
在淋巴瘤和白血病中，+7、+12是常见的染色体继发性畸变[5]。而且有+7或+12的患者存活期短，预后较差[6]。据文献报道[2,3]淋巴瘤中4号染色体的结构和数目畸变较为少见，本实验选用4号染色体作为内对照，以排除多倍体，来检测肿瘤细胞中7号三体(+7)和12号三体(+12)的发生频率。染色体三体的限定值(阈值)设定为5%，此限定值高于10例对照组中三种探针三个信号检出率的
+2s，可避免高估染色体三体的发生率，并和有关文献报道相一致[6]。本实验21例病例中5例有+7，检出率23.8%，3例有+12，检出率14.3%。, http://www.100md.com
从表2可见，淋巴结有7号三体和12号三体的病例其外周血染色体畸变率也较高，故有必要进一步收集标本，探索淋巴瘤发生过程中其外周血淋巴细胞染色体变化和瘤组织染色体变化的关系，对探讨淋巴瘤的发生、发展和预后具有较大的参考价值。
引起染色体三体的原因可能因人体本身免疫缺陷或EB病毒感染引起细胞有丝分裂时出现染色体不分离[7]。淋巴瘤中除+7、+12外，也常见+3、+18、+X等数目改变[3]。这些染色体改变可能均与淋巴瘤的发生、发展有密切关系，尤其是位于这些染色体上的某些基因可能因染色体三体出现基因剂量效应而激发幼稚的淋巴细胞过度生长[7]。
原位杂交技术比细胞遗传学方法敏感、准确，但其并不能检测肿瘤细胞内的所有克隆以及一个克隆内的所有染色体畸变，如本实验使用4号、7号、12号特异性染色体着丝粒探针，就无法检测其它的染色体畸变，所以该技术与传统的细胞遗传学方法相结合将发挥更大的作用。
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基金项目：本课题受浙江省教委基金(No：961063)资助
[参考文献]
1，Cremer T,Landegent J,Bruckner A, et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non- radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84 [J]. Hum genet, 1986， 74(3): 346～ 352.
2，卢洁，谷仁凯，周容,等.42例恶性淋巴瘤的细胞遗传学研究[J].白血病,1997;6(3)：156～159.
, 百拇医药
3，Ott G,Kalla J,Steinhoff A,et al. Trisomy 3 is not a common feature in malignant lymphomas of mucosa- associated lymphoid tissue type [J]. Am J Pathol, 1998, 153(3):689～ 694.
4，张颜明.荧光原位杂交技术及其在肿瘤遗传学研究中的应用[J].浙江医科大学学报,1995,24(5)：232～235.
5，Motokura T, Arnold A. Cyclins and oncogenesis [J]. Biochim Biophys Acta,1993, 1155(25):63～ 78.
6，Cuneo A, Wlodarska I,Sayed Aly M,et al. Non- radioactive in situ hybridization for the detection and monitoring of trisomy 12 in B- cell chronic lymphocytic leukemia [J]. Br J Haematol, 1992,81:192～ 196.
7，张颜明，SchlegelbergerB.慢性B淋巴细胞白血病的荧光原位杂交研究[J].中华血液学杂志,1995,16(8)：414～416.
收稿日期：1999-11-16；修回日期：1999-12-13, 百拇医药