维生素D受体等位基因多态性与骨密度相关性分析
作者：黄啸原 褚为靖 刘玉涛 安晓霞 陈训华
单位：黄啸原 褚为靖 刘玉涛 安晓霞(100035北京积水潭医院北京市创伤骨科研究所)；陈训华(中医研究院骨伤科研究所)
关键词：受体；骨化三醇；基因型；骨密度
中华骨科杂志000614
【摘要】目的调查维生素D受体(vitamin Dreceptor,VDR)基因多态性在我国人群中的分布，分析VDR基因型与骨密度的关系。方法采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和限制性酶切技术，检测北京地区100例围绝经期与48例绝经期妇女维生素D受体基因多态性，同时用双能X线骨密度仪检测腰椎骨密度。结果发现VDR基因型分布频率为BB，2.7%；Bb，8.1%；bb，89.2%。围绝经期妇女中腰椎骨密度值:BB基因型为(1.123±0.105)g/cm2，Bb基因型为(1.290±0.141)g/cm2，bb基因型为(1.185±0.130)g/cm2。绝经期妇女腰椎骨密度(0.822±0.118)g/cm2,明显低于围绝经期妇女(1.193±0.134)g/cm2，(P<0.01)。绝经期妇女中骨质疏松发生率为34%。结论中国北京地区这部分绝经期和围绝经期妇女VDR基因型分布频率与某些西方国家人群分布不同，她们VDR基因型与骨密度无明显相关性。
, 百拇医药
An analysis of the correlation between vitamin D receptor gene polymorphisms and bone mineral density
HUANG Xiaoyuan，CHU Weijing，LIU Yutao，et al.
(Beijing Ji Shui Tan Hospital, Beijing Institute of Traumatology ＆ Orthopaedics, Beijing 100035，China)
【Abstract】 Objective To investigate the frequency distribution of vitamin D receptor(VDR) genotype in Chinese population and evaluate the correlation between VDR gene polymorphisms and bone mineral density(BMD). Methods Polymerase chain reaction (PCR) and restriction analysis were used to determine VDR genotypes in 148 Chinese women. Their L2-4 lumbar spine BMD was measured by dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA).Results The frequency distribution of the VDR genotype was: BB, 2.7% ; Bb, 8.1% ; bb, 89.2% . The BMD in perimenopasal women of different genotypes were (1.123± 0.105) g/cm2 (BB),(1.290± 0.141) g/cm2 (Bb) and (1.185± 0.130) g/cm2 (bb) respectively. The BMD was significantly lower in postmenopausal women than perimenopausal women (P< 0.01). The incidence of osteoporosis in postmenopausal women was 34%. Conclusion The frequency distribution of the VDR genotype in Chinese peri- and postmenopausal women were apparently different from that in Western countries. The correlation between the VDR genotype and BMD was not found.
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【Key words】 Receptors, calcitrial; Genotype; Bone density
骨质疏松是一种以骨量和骨强度减少、骨折危险性增加为特征的骨代谢疾病。经对孪生子女和家族性调查表明，人群中75%～85%的骨密度变异受遗传因素控制[1]。1994年Morrison等[2]首先报告了白种人群维生素D受体等位基因多态性与骨密度密切相关。本文采用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)和限制性酶切技术，检测148例北京城区汉族妇女维生素D受体等位基因型，并分析其基因型与骨密度的关系。
资料与方法
一、实验材料
(一)试剂:全血DNA提取试剂盒，为基因公司(QIAGENInc.)产品；TaqDNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液均为BoehringerMannheim产品；限制性内切酶BsmⅠ由NewEnglandBiolabs提供，DNA标准片段由LifeTechnologiesInc.提供。
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(二)引物序列的设计与合成:引物序列同Morrison等[2]设计的方法。
P1:5'-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3'
P2:5'-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG-3'
由北京赛百盛(美国)生物工程公司合成。
二、研究对象
北京地区148名汉族城市妇女，其中围绝经妇女100名(45～50岁)，绝经期妇女48名(55～65岁)，经体检排除肝、肾功能异常及其他影响骨代谢的疾患。静脉取全血，ACD(acidcitratedextrose)抗凝。
三、实验方法
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(一)维生素D受体等位基因型检测
1.提取DNA:采用基因公司全血DNA提取试剂盒，操作步骤详见试剂盒说明书。
2.PCR扩增:反应体系为100μl。将反应管置热循环仪(PE480型)中，94℃预变性3min，85℃5min，67℃1min，72℃2min。然后按94℃变性1min，67℃退火1min，72℃延伸3min，程序循环29次，最后72℃延伸10min。
3.扩增产物限制性酶切位点检测:取PCR扩增产物5μl，加BsmⅠ1μl后，置65℃水浴保温3h。取反应产物10μl，经2%琼脂糖电泳，EB染色，紫外光下判定结果。根据电泳条带的数目和位置判定基因类型，方法如下:无酶切位点的纯合子BB基因型只有一条带(825bp)，有酶切位点bb基因型有两条带(650bp，175bp)，杂合子Bb基因型有三条带(825bp，650bp，175bp)(图1)。
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(二)骨密度检测
受试者经双能X线骨密度仪(DEXA，美国Norland公司)检测第L2～4腰椎正位骨密度,结果以(
±s)g/cm2表示。
结果
148例妇女维生素D受体分布频率为BB2.7%；Bb8.1%；bb89.2%。
围绝经期妇女和绝经期妇女腰椎骨密度分别为(1.193±0.134)g/cm2和(0.822±0.118)g/cm2，绝经期妇女骨密度明显低于围绝经期妇女(t检验，P<0.01)。在围绝经期妇女中，Bb基因型骨密度为最高(1.290±0.141)g/cm2，bb基因型次之为(1.185±0.130)g/cm2，BB基因型为最低(1.123±0.105)g/cm2，其差异无显著性意义(F检验，P>0.05)。
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48例绝经期妇女中共检测腰椎骨密度41例结果见表1。
表1 绝经期后妇女腰椎骨密度与骨质疏松关系
基因型
n
骨密度(g/cm2,±s)
骨质疏松*
bb
39
0.819±0.121
13例
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Bb
2
0.866±0.051
1例
注*骨密度值低于年轻健康人骨密度值的2.5SD为骨质疏松
绝经期妇女中基因型BB和Bb两组之间骨密度差异无显著性意义(F检验，P>0.05)。其骨质疏松发生率为34%。
讨论
本研究得出中国北京地区妇女VDR基因型BB、Bb、bb分布频率分别为2.7%、8.1%、89.2%。本结果与来自东亚地区[3-6]，包括中国[7]在内的报道接近，以bb型为最高，约占总基因型的80%～90%，其余为Bb和BB基因型，实际上BB基因型只有1%～2%。而以白种人为主的西方国家报道显示:VDR基因型分布以Bb型为最高，约占总基因数量的50%；bb型占30%～40%；BB型占10%～20%。由此可以推测我国人群中VDR等位基因型的分布与西方白种人明显不同。
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一些研究结果[8-10]支持Morrison的观点，认为VDR受体与骨密度关系密切，BB型骨密度较bb型低，Bb型骨密度介于二者之间，且具有明显差异，提示通过VDR基因型预测骨密度的可能性。但英国Houston等[11]得出相反的结果:bb型人群中的髋部骨密度明显低于BB型。
我们的研究结果未发现VDR基因型与腰椎骨密度有明显相关性。法国Carnero等[12]分析189名健康绝经前妇女，未发现VDR基因型与骨密度的联系。韩国Lim等[3]在25例严重骨质疏松患者中也未见一例是BB基因型，这可能与东亚地区人群中BB基因型数目过少有关。
从我们的研究结果中发现，绝经期妇女骨密度明显低于围绝经期妇女，差异有非常显著性意义；围绝经期妇女无一例发生骨质疏松，而绝经期妇女中骨质疏松发生率为34%。这说明妇女绝经后，雌激素水平下降是使骨密度降低，进而引起骨质疏松的关键因素。
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图1 VDR等位基因型电泳图谱
总之，自1994Morrison首次提出VDR等位基因预测骨密度的概念之后，国外相关报道不少，但其研究结果各异。推测其原因有以下几点:(1)种族差异使VDR基因型分布不同;(2)地域或环境因素使VDR等位基因的表达不一致；(3)研究方法差异，如骨密度检测部位，样本数量，对年龄、性别、绝经状况和钙摄入等因素的控制。此外，其他遗传因素对骨密度的作用也不能忽视，如雌激素受体[13]、胶原Ⅰ型Sp1位点[14]等基因多态性对骨密度的影响。因此，对骨质疏松从基因水平上的研究需进一步深入探讨。
参考文献
1，Gueguen R, Jouanny P, Guillemin F, et al. Segregation analysis and variance components analysis of bone mineral density in healthy families. J Bone Miner Res,1995, 10:2017-2022.
, http://www.100md.com
2，Morrison NA, Qi JC, Tokita A, et al. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles. Nature, 1994, 367:284-287.
3，Lim SK, Park YS, Park JM, et al. Lack of association between vitamin D receptor genotypes and osteoporosis in Koreans. J Clin Endocrinol Metab, 1995, 80:3677-3681.
4，Tokita A, Matsumoto H, Morrison NA, et al. Vitamin D receptor alleles, bone mineral density and turnover in premenopausal Japanese women. J Bone Miner Res, 1996, 11:1003-1009.
, http://www.100md.com
5，Tsai KS, Hsu SH, Cheng WC, et al. Bone mineral density and bone markers in relation to vitamin D receptor gene polymorphisms in Chinese men and women.Bone, 1996, 19:513-18.
6，Kung AWC, Yeung SSC, Lau KS. Vitamin D receptor gene polymorphisms and peak bone mass in southern Chinese women. Bone, 1998, 22:389-393.
7，赵金秀, 周学瀛, 孟迅吾, 等. 中国妇女维生素D受体基因型与骨密度及骨钙素关系的研究. 中国医学科学院学报, 1997, 19:252-256.
8，Krall EA, Parry P, Lichter JB, et al. Vitamin D receptor alleles and rates of bone loss: influences of years since menopause and calcium intake. J Bone Miner Res, 1995, 10:978-984.
, 百拇医药
9，Uitterlinden AG, Pols HA, Burger H, et al. A large-scale population-based study of the association of vitamin D receptor gene polymorphisms with bone mineral density. J Bone Miner Res,1996, 11:1241-1248.
10，Vandevyver C, Wylin T, Cassiman JJ, et al. Influence of the vitamin D receptor gene alleles on bone mineral density in postmenopausal and osteoporotic women. J Bone Miner Res, 1997, 12 :241-247. Houston LA, Grant SF, Reid DM, et al. Vitamin D receptor polymorphism, bone mineral density, and osteoporotic vertebral fracture: studies in a UK population. Bone,1996, 18:249-252.
, 百拇医药
11，Garnero P,Borel O, Sornay-Rendu E,et al. Vitamin D receptor gene polymorphisms do not predict bone turnover and bone mass in healthy premenopausal women.J Bone Miner Res, 1995, 10:1283-1288.
12，Kobayashi S, Inoue S, Hosoi T, et al. Association of bone mineral density with polymorphism of the estrogen receptor gene. J Bone Miner Res, 1996, 11:306-311.
13，Grant SF, Reid DM, Blake G, et al. Reduced bone density and osteoporosis associated with a polymorphic Sp1 binding site in the collagen typeⅠ α 1 gene. Nat Genet, 1996, 14:203-205.
(收稿日期：1999-05-24), 百拇医药
单位：黄啸原 褚为靖 刘玉涛 安晓霞(100035北京积水潭医院北京市创伤骨科研究所)；陈训华(中医研究院骨伤科研究所)
关键词：受体；骨化三醇；基因型；骨密度
中华骨科杂志000614
【摘要】目的调查维生素D受体(vitamin Dreceptor,VDR)基因多态性在我国人群中的分布，分析VDR基因型与骨密度的关系。方法采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和限制性酶切技术，检测北京地区100例围绝经期与48例绝经期妇女维生素D受体基因多态性，同时用双能X线骨密度仪检测腰椎骨密度。结果发现VDR基因型分布频率为BB，2.7%；Bb，8.1%；bb，89.2%。围绝经期妇女中腰椎骨密度值:BB基因型为(1.123±0.105)g/cm2，Bb基因型为(1.290±0.141)g/cm2，bb基因型为(1.185±0.130)g/cm2。绝经期妇女腰椎骨密度(0.822±0.118)g/cm2,明显低于围绝经期妇女(1.193±0.134)g/cm2，(P<0.01)。绝经期妇女中骨质疏松发生率为34%。结论中国北京地区这部分绝经期和围绝经期妇女VDR基因型分布频率与某些西方国家人群分布不同，她们VDR基因型与骨密度无明显相关性。
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An analysis of the correlation between vitamin D receptor gene polymorphisms and bone mineral density
HUANG Xiaoyuan，CHU Weijing，LIU Yutao，et al.
(Beijing Ji Shui Tan Hospital, Beijing Institute of Traumatology ＆ Orthopaedics, Beijing 100035，China)
【Abstract】 Objective To investigate the frequency distribution of vitamin D receptor(VDR) genotype in Chinese population and evaluate the correlation between VDR gene polymorphisms and bone mineral density(BMD). Methods Polymerase chain reaction (PCR) and restriction analysis were used to determine VDR genotypes in 148 Chinese women. Their L2-4 lumbar spine BMD was measured by dual-energy X-ray absorptiometry (DEXA).Results The frequency distribution of the VDR genotype was: BB, 2.7% ; Bb, 8.1% ; bb, 89.2% . The BMD in perimenopasal women of different genotypes were (1.123± 0.105) g/cm2 (BB),(1.290± 0.141) g/cm2 (Bb) and (1.185± 0.130) g/cm2 (bb) respectively. The BMD was significantly lower in postmenopausal women than perimenopausal women (P< 0.01). The incidence of osteoporosis in postmenopausal women was 34%. Conclusion The frequency distribution of the VDR genotype in Chinese peri- and postmenopausal women were apparently different from that in Western countries. The correlation between the VDR genotype and BMD was not found.
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【Key words】 Receptors, calcitrial; Genotype; Bone density
骨质疏松是一种以骨量和骨强度减少、骨折危险性增加为特征的骨代谢疾病。经对孪生子女和家族性调查表明，人群中75%～85%的骨密度变异受遗传因素控制[1]。1994年Morrison等[2]首先报告了白种人群维生素D受体等位基因多态性与骨密度密切相关。本文采用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)和限制性酶切技术，检测148例北京城区汉族妇女维生素D受体等位基因型，并分析其基因型与骨密度的关系。
资料与方法
一、实验材料
(一)试剂:全血DNA提取试剂盒，为基因公司(QIAGENInc.)产品；TaqDNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液均为BoehringerMannheim产品；限制性内切酶BsmⅠ由NewEnglandBiolabs提供，DNA标准片段由LifeTechnologiesInc.提供。
, 百拇医药
(二)引物序列的设计与合成:引物序列同Morrison等[2]设计的方法。
P1:5'-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3'
P2:5'-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG-3'
由北京赛百盛(美国)生物工程公司合成。
二、研究对象
北京地区148名汉族城市妇女，其中围绝经妇女100名(45～50岁)，绝经期妇女48名(55～65岁)，经体检排除肝、肾功能异常及其他影响骨代谢的疾患。静脉取全血，ACD(acidcitratedextrose)抗凝。
三、实验方法
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(一)维生素D受体等位基因型检测
1.提取DNA:采用基因公司全血DNA提取试剂盒，操作步骤详见试剂盒说明书。
2.PCR扩增:反应体系为100μl。将反应管置热循环仪(PE480型)中，94℃预变性3min，85℃5min，67℃1min，72℃2min。然后按94℃变性1min，67℃退火1min，72℃延伸3min，程序循环29次，最后72℃延伸10min。
3.扩增产物限制性酶切位点检测:取PCR扩增产物5μl，加BsmⅠ1μl后，置65℃水浴保温3h。取反应产物10μl，经2%琼脂糖电泳，EB染色，紫外光下判定结果。根据电泳条带的数目和位置判定基因类型，方法如下:无酶切位点的纯合子BB基因型只有一条带(825bp)，有酶切位点bb基因型有两条带(650bp，175bp)，杂合子Bb基因型有三条带(825bp，650bp，175bp)(图1)。
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(二)骨密度检测
受试者经双能X线骨密度仪(DEXA，美国Norland公司)检测第L2～4腰椎正位骨密度,结果以(
±s)g/cm2表示。结果
148例妇女维生素D受体分布频率为BB2.7%；Bb8.1%；bb89.2%。
围绝经期妇女和绝经期妇女腰椎骨密度分别为(1.193±0.134)g/cm2和(0.822±0.118)g/cm2，绝经期妇女骨密度明显低于围绝经期妇女(t检验，P<0.01)。在围绝经期妇女中，Bb基因型骨密度为最高(1.290±0.141)g/cm2，bb基因型次之为(1.185±0.130)g/cm2，BB基因型为最低(1.123±0.105)g/cm2，其差异无显著性意义(F检验，P>0.05)。
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48例绝经期妇女中共检测腰椎骨密度41例结果见表1。
表1 绝经期后妇女腰椎骨密度与骨质疏松关系
基因型
n
骨密度(g/cm2,
±s)骨质疏松*
bb
39
0.819±0.121
13例
, 百拇医药
Bb
2
0.866±0.051
1例
注*骨密度值低于年轻健康人骨密度值的2.5SD为骨质疏松
绝经期妇女中基因型BB和Bb两组之间骨密度差异无显著性意义(F检验，P>0.05)。其骨质疏松发生率为34%。
讨论
本研究得出中国北京地区妇女VDR基因型BB、Bb、bb分布频率分别为2.7%、8.1%、89.2%。本结果与来自东亚地区[3-6]，包括中国[7]在内的报道接近，以bb型为最高，约占总基因型的80%～90%，其余为Bb和BB基因型，实际上BB基因型只有1%～2%。而以白种人为主的西方国家报道显示:VDR基因型分布以Bb型为最高，约占总基因数量的50%；bb型占30%～40%；BB型占10%～20%。由此可以推测我国人群中VDR等位基因型的分布与西方白种人明显不同。
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一些研究结果[8-10]支持Morrison的观点，认为VDR受体与骨密度关系密切，BB型骨密度较bb型低，Bb型骨密度介于二者之间，且具有明显差异，提示通过VDR基因型预测骨密度的可能性。但英国Houston等[11]得出相反的结果:bb型人群中的髋部骨密度明显低于BB型。
我们的研究结果未发现VDR基因型与腰椎骨密度有明显相关性。法国Carnero等[12]分析189名健康绝经前妇女，未发现VDR基因型与骨密度的联系。韩国Lim等[3]在25例严重骨质疏松患者中也未见一例是BB基因型，这可能与东亚地区人群中BB基因型数目过少有关。
从我们的研究结果中发现，绝经期妇女骨密度明显低于围绝经期妇女，差异有非常显著性意义；围绝经期妇女无一例发生骨质疏松，而绝经期妇女中骨质疏松发生率为34%。这说明妇女绝经后，雌激素水平下降是使骨密度降低，进而引起骨质疏松的关键因素。
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图1 VDR等位基因型电泳图谱
总之，自1994Morrison首次提出VDR等位基因预测骨密度的概念之后，国外相关报道不少，但其研究结果各异。推测其原因有以下几点:(1)种族差异使VDR基因型分布不同;(2)地域或环境因素使VDR等位基因的表达不一致；(3)研究方法差异，如骨密度检测部位，样本数量，对年龄、性别、绝经状况和钙摄入等因素的控制。此外，其他遗传因素对骨密度的作用也不能忽视，如雌激素受体[13]、胶原Ⅰ型Sp1位点[14]等基因多态性对骨密度的影响。因此，对骨质疏松从基因水平上的研究需进一步深入探讨。
参考文献
1，Gueguen R, Jouanny P, Guillemin F, et al. Segregation analysis and variance components analysis of bone mineral density in healthy families. J Bone Miner Res,1995, 10:2017-2022.
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2，Morrison NA, Qi JC, Tokita A, et al. Prediction of bone density from vitamin D receptor alleles. Nature, 1994, 367:284-287.
3，Lim SK, Park YS, Park JM, et al. Lack of association between vitamin D receptor genotypes and osteoporosis in Koreans. J Clin Endocrinol Metab, 1995, 80:3677-3681.
4，Tokita A, Matsumoto H, Morrison NA, et al. Vitamin D receptor alleles, bone mineral density and turnover in premenopausal Japanese women. J Bone Miner Res, 1996, 11:1003-1009.
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6，Kung AWC, Yeung SSC, Lau KS. Vitamin D receptor gene polymorphisms and peak bone mass in southern Chinese women. Bone, 1998, 22:389-393.
7，赵金秀, 周学瀛, 孟迅吾, 等. 中国妇女维生素D受体基因型与骨密度及骨钙素关系的研究. 中国医学科学院学报, 1997, 19:252-256.
8，Krall EA, Parry P, Lichter JB, et al. Vitamin D receptor alleles and rates of bone loss: influences of years since menopause and calcium intake. J Bone Miner Res, 1995, 10:978-984.
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13，Grant SF, Reid DM, Blake G, et al. Reduced bone density and osteoporosis associated with a polymorphic Sp1 binding site in the collagen typeⅠ α 1 gene. Nat Genet, 1996, 14:203-205.
(收稿日期：1999-05-24), 百拇医药