姜黄素对羟自由基及红细胞氧化性溶血的影响
作者：王建舜 容维祺 康九红
单位：康九红(兰州大学生物系 兰州 730000)；王建舜 容维祺(甘肃省武威地区人民医院 武威 733000)
关键词：姜黄素；羟自由基；红细胞溶血
中国现代应用药学000617 摘要 目的：探讨姜黄素(Curcumin,Cur)清除羟自由基及防御脂质过氧化的能力。方法：利用Fenton反应生成羟自由基(OH)，由AAPH诱发红细胞氧化性溶血。结果：姜黄素对羟自由基有较强的清除作用(SC50为58.8μmol/L),其作用超过OH的特异性清除剂甘露醇(SC50为21.3μmol/L);姜黄素(120μmol/L)能有效地抑制由AAPH诱发的红细胞氧化性溶血(抑制2h以上)，显示了较强的防御脂质过氧化的能力。结论：姜黄素对癌症及炎症等的治疗作用可能与其清除自由基及防御脂质过氧化的能力有关。
, 百拇医药
Effects of curcumin on hydroxyl free radical and the oxidative hemolysis in erythrocytes
Wang Jianshun(Wang JS),Rong Weiqi(Rong WQ),Kang Jiuhong(Kang JH)
(People′s Hospital of Wuwei Prefecture of Gansu Province,733000)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the effect of curcumin(Cur) on hydroxyl free radical(OH) and oxidative hemolysis in mouse erythrocytes.METHODS:To produce the OH by fenton reaction and induce the oxidative hemolysis in mouse erythrocytes by AAPH.RESULTS:Cur was found to significantly scavenge the OH(SC50=58.8μmol/L),and the scavenging effect of Cur was obviously stronger than that of mannitol,a specific OH scavenger(SC50=21.3μmol/L).Cur(120μmol/L) was also shown to have strong inhibitory effect on erythrocytes oxidative hemolysis(the hemolysis was inhibited for more than 2h).CONCLUSION:It suggested that the anticancer and antiinflammation activity of Cur,may be related to its scavenging effects on oxygen free radicals and the inhibitory effect on lipid peroxidation.
, 百拇医药
KEY WORDS curcumin,hydroxyl free radical,erythrocytes hemolysis
姜黄素(curcumin,Cur)是从姜科植物姜黄中提取的一种酚类物质，具有抗癌变、抗炎症等广泛的药理作用[1]。超氧阴离子(superoxide anion,O-2)是人体内正常代谢和病理条件下由氧衍生出来的第一个氧自由基，羟自由基(hydroxyl free radicals,OH)是人体内反应性最强的氧自由基，它们以及由它们介导的脂质过氧化与体内许多重要生理和病理过程密切相关。研究表明，在癌变、炎症发生等病理过程中氧自由基及由它引起的脂质过氧化发挥极其重要的作用，并发现有些氧自由基清除剂对上述过程有明显改善作用[2～4]。我们发现Cur对O-2具有良好的清除效能[5],本文研究Cur对Fenton反应产生的OH的清除效能，以及对由2-偶氮(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)诱发的红细胞氧化性溶血的抑制作用，为进一步阐明该药抗癌变、抗炎症等的作用机制提供理论依据。
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1 材料与方法
1.1 材料 姜黄素(curcumin,Cur)、2-脱氧-D-核糖、黄嘌呤氧化酶、硫代巴比妥酸(TBA)为美国Sigma公司产品，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 OH的产生及清除率测定[6] 利用Fenton反应产生OH。OH可使2-脱氧-D-核糖降解，其降解产物可与TBA反应，反应产物在532nm处有最大吸收，该吸收值(A)可以代表OH生成的相对量。2ml反应体系中含:170μl 2-脱氧-D-核糖(30mmol/L),40μl乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)(5mmol/L),40μl FeSO4(2mmol/L),200μl次黄嘌呤(2mmol/L),1.5ml不同浓度的被测药物及磷酸缓冲液(PBS,0.15mol/L,pH 7.4),空白组不加药物。反应开始加入40μl黄嘌呤氧化酶(0.4U/ml),该体系混匀后,35℃反应15min。取上述培养液1ml,加入TBA(1% w/v,溶于0.05mol/L NaOH)1ml,沸水浴30min,迅速冷却，在532nm处测A。OH清除率可按下式计算：
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A空、A药分别为空白组、药物组在532nm处A值。
1.3 对红细胞氧化性溶血的抑制[6] 小鼠眼球取血盛于有抗凝剂的离心管中，1000r/min×10min离心，所得红细胞用150mmol/L NaCl洗3次后，用PBS(10mmol/L,pH 7.4,含125mmol/L NaCl)将红细胞制成10%细胞悬液，同时加入药物。37℃恒温，加入等体积的2-偶氮(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH,100mmol/L)溶液，振摇，计时。每30min从相应体系中吸取两份一定量反应液，一份用20倍体积NaCl溶液稀释(A)，另一份用20倍体积蒸馏水稀释(B)。离心，在540nm处测光吸收值。溶血率以A/B×100%表示。
2 结果
2.1 表1中结果提示，甘露醇和Cur对OH均有明显的清除效应，利用线性回归法求得它们的半清除浓度SC50分别为21.3mmol/L和58.8μmol/L(表1)。Cur对OH的清除作用远强于甘露醇，其SC50约为甘露醇的360倍。
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2.2 对由AAPH诱发的小鼠红细胞氧化性溶血抑制作用的研究表明，随着浓度的增加,Cur对氧化性溶血的抑制作用也加强，当浓度为120μmol/L时,Cur的抑制力达到稳定的高水平，此后趋于平稳(图1)。在浓度为120μmol/L时,Cur能够使红细胞氧化性溶血被抑制2h(图2)。以上结果从量效和时效两个方面说明Cur具有强的抗脂质过氧化能力。
表1 姜黄素对羟自由基(OH)的清除作用/x±s,n=3 药物
浓度
吸光度/A532
清除率/%
对照组
0.649±0.012
甘露醇/mmol.L-1
, 百拇医药
5
0.513±0.031*1
21.03
10
0.485±0.037*1
25.30
20
0.345±0.026*2
46.90
40
0.150±0.009*2
, 百拇医药
76.96
姜黄素/μmol.L-1
20
0.381±0.016*2
41.29
40
0.361±0.013*2
44.38
60
0.342±0.015*2
47.30
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80
0.311±0.018*2
52.08
100
0.216±0.012*2
66.72
图1 姜黄素(150min)抑制小鼠红细胞氧化性溶血的量效关系/n=3，x±s
, 百拇医药
图2 姜黄素(120μmol/L)抑制小鼠红细胞氧化性溶血的时效关系/n=3，x±s
1-AAPH组；2-AAPH+姜黄素(120μmol/L)组；3-对照组(无AAPH，无姜黄素)
3 讨 论
机体在代谢过程中可以产生O-2，OH，过氧化氢(H2O2),单线态氧(1O2),它们统称为活性氧自由基。在正常生理状态下，这些活性氧的产生和清除处于生理性低水平的平衡状态，对人体是必需的、有利的[2];但在某些病理情况下，无论何种原因使这些活性氧代谢失衡，活性氧含量就升高，脂类过氧化水平也升高。这种不平衡就会对机体造成损伤，引发多种疾病，包括癌症和炎症等[2～4]。因此，人们常常想到利用外源性能清除活性氧自由基或防御脂质过氧化的药物来治疗这些与活性氧及脂质过氧化密切有关的疾病[4,7,8]。
, 百拇医药
Cur具有抗癌变、抗炎症等广泛的药理作用[1]。O-2是人体内由氧衍生出来的第一个氧自由基，OH是人体内反应性最强的氧自由基，它们以及由它们介导的脂类过氧化与体内许多重要生理和病理过程密切相关，如癌变、炎症发生等，有研究表明某些氧自由基清除剂对上述过程有明显改善作用[2～4,8]。因此研究药物对O-2、OH及由它们介导的脂质过氧化的抑制作用就十分有意义。我们已经发现并报道了Cur对O-2具有良好的清除效能[5],本文又报道Cur对Fenton反应产生的OH亦具有良好的清除效能，同时对由AAPH诱发的红细胞氧化性溶血具有强的抑制作用。这为进一步阐明该药抗癌变、抗炎症等的作用机制提供重要理论依据。
王建舜，男，1964年生，西安医科大学药学系，学士
康九红，男，1969年9月生，博士。1995年9月起攻读自由基生物学方向博士学位，研究自由基清除剂药物、自由基与疾病，尤其是与癌的关系。1998年6月获博士学位
, 百拇医药
参考文献
1，Ammon HPT,Wahl MA.Pharmacology of curcuma longa.Planta Med,1991,57(1)∶1.
2，郑荣梁.自由基生物学.北京：高等教育出版社，1992∶107～124，131～135，248～249.
3，Dreher D,Junod AF.Role of oxygen free radicals in cancer development.Eur J Cancer,1996,32A(1)∶30.
4，Kang JH,Shi YM,Zheng RL.Effects of ascorbic acid on human hepatoma cells proliferation and redifferentiation.Acta Pharmacol Sin,1999∶1019.
, http://www.100md.com
5，王建舜，容维祺，康九红.姜黄素对超氧阴离子的清除作用.西北国防医学杂志，1999，20(3)∶213.
6，康九红，张岫兰，王沁，等.肝胆宁对氧自由基及红细胞氧化性溶血的影响.中国现代应用药学原现代应用药学，1997，14(1)∶8.
7，Wang PF,Kang JH,Zheng RL,et al.Scavenging effects of phenylpropanoid glycosides from Pedicularis on superoxide anion and hydroxyl radical by the spin trapping method.Biochem Pharmacol,1996,51∶687.
8，Kang Jiuhong,Shi Yimin,Zheng Rongliang.Effects of ascorbic acid and DL-α-tocopherol on human hepatoma cells proliferation and redifferentiation.Acta Pharmacol Sin,1999,20(in press).
收稿日期：1999-06-18, 百拇医药
单位：康九红(兰州大学生物系 兰州 730000)；王建舜 容维祺(甘肃省武威地区人民医院 武威 733000)
关键词：姜黄素；羟自由基；红细胞溶血
中国现代应用药学000617 摘要 目的：探讨姜黄素(Curcumin,Cur)清除羟自由基及防御脂质过氧化的能力。方法：利用Fenton反应生成羟自由基(OH)，由AAPH诱发红细胞氧化性溶血。结果：姜黄素对羟自由基有较强的清除作用(SC50为58.8μmol/L),其作用超过OH的特异性清除剂甘露醇(SC50为21.3μmol/L);姜黄素(120μmol/L)能有效地抑制由AAPH诱发的红细胞氧化性溶血(抑制2h以上)，显示了较强的防御脂质过氧化的能力。结论：姜黄素对癌症及炎症等的治疗作用可能与其清除自由基及防御脂质过氧化的能力有关。
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Effects of curcumin on hydroxyl free radical and the oxidative hemolysis in erythrocytes
Wang Jianshun(Wang JS),Rong Weiqi(Rong WQ),Kang Jiuhong(Kang JH)
(People′s Hospital of Wuwei Prefecture of Gansu Province,733000)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the effect of curcumin(Cur) on hydroxyl free radical(OH) and oxidative hemolysis in mouse erythrocytes.METHODS:To produce the OH by fenton reaction and induce the oxidative hemolysis in mouse erythrocytes by AAPH.RESULTS:Cur was found to significantly scavenge the OH(SC50=58.8μmol/L),and the scavenging effect of Cur was obviously stronger than that of mannitol,a specific OH scavenger(SC50=21.3μmol/L).Cur(120μmol/L) was also shown to have strong inhibitory effect on erythrocytes oxidative hemolysis(the hemolysis was inhibited for more than 2h).CONCLUSION:It suggested that the anticancer and antiinflammation activity of Cur,may be related to its scavenging effects on oxygen free radicals and the inhibitory effect on lipid peroxidation.
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KEY WORDS curcumin,hydroxyl free radical,erythrocytes hemolysis
姜黄素(curcumin,Cur)是从姜科植物姜黄中提取的一种酚类物质，具有抗癌变、抗炎症等广泛的药理作用[1]。超氧阴离子(superoxide anion,O-2)是人体内正常代谢和病理条件下由氧衍生出来的第一个氧自由基，羟自由基(hydroxyl free radicals,OH)是人体内反应性最强的氧自由基，它们以及由它们介导的脂质过氧化与体内许多重要生理和病理过程密切相关。研究表明，在癌变、炎症发生等病理过程中氧自由基及由它引起的脂质过氧化发挥极其重要的作用，并发现有些氧自由基清除剂对上述过程有明显改善作用[2～4]。我们发现Cur对O-2具有良好的清除效能[5],本文研究Cur对Fenton反应产生的OH的清除效能，以及对由2-偶氮(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)诱发的红细胞氧化性溶血的抑制作用，为进一步阐明该药抗癌变、抗炎症等的作用机制提供理论依据。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料 姜黄素(curcumin,Cur)、2-脱氧-D-核糖、黄嘌呤氧化酶、硫代巴比妥酸(TBA)为美国Sigma公司产品，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 OH的产生及清除率测定[6] 利用Fenton反应产生OH。OH可使2-脱氧-D-核糖降解，其降解产物可与TBA反应，反应产物在532nm处有最大吸收，该吸收值(A)可以代表OH生成的相对量。2ml反应体系中含:170μl 2-脱氧-D-核糖(30mmol/L),40μl乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)(5mmol/L),40μl FeSO4(2mmol/L),200μl次黄嘌呤(2mmol/L),1.5ml不同浓度的被测药物及磷酸缓冲液(PBS,0.15mol/L,pH 7.4),空白组不加药物。反应开始加入40μl黄嘌呤氧化酶(0.4U/ml),该体系混匀后,35℃反应15min。取上述培养液1ml,加入TBA(1% w/v,溶于0.05mol/L NaOH)1ml,沸水浴30min,迅速冷却，在532nm处测A。OH清除率可按下式计算：
, http://www.100md.com
A空、A药分别为空白组、药物组在532nm处A值。
1.3 对红细胞氧化性溶血的抑制[6] 小鼠眼球取血盛于有抗凝剂的离心管中，1000r/min×10min离心，所得红细胞用150mmol/L NaCl洗3次后，用PBS(10mmol/L,pH 7.4,含125mmol/L NaCl)将红细胞制成10%细胞悬液，同时加入药物。37℃恒温，加入等体积的2-偶氮(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH,100mmol/L)溶液，振摇，计时。每30min从相应体系中吸取两份一定量反应液，一份用20倍体积NaCl溶液稀释(A)，另一份用20倍体积蒸馏水稀释(B)。离心，在540nm处测光吸收值。溶血率以A/B×100%表示。
2 结果
2.1 表1中结果提示，甘露醇和Cur对OH均有明显的清除效应，利用线性回归法求得它们的半清除浓度SC50分别为21.3mmol/L和58.8μmol/L(表1)。Cur对OH的清除作用远强于甘露醇，其SC50约为甘露醇的360倍。
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2.2 对由AAPH诱发的小鼠红细胞氧化性溶血抑制作用的研究表明，随着浓度的增加,Cur对氧化性溶血的抑制作用也加强，当浓度为120μmol/L时,Cur的抑制力达到稳定的高水平，此后趋于平稳(图1)。在浓度为120μmol/L时,Cur能够使红细胞氧化性溶血被抑制2h(图2)。以上结果从量效和时效两个方面说明Cur具有强的抗脂质过氧化能力。
表1 姜黄素对羟自由基(OH)的清除作用/x±s,n=3 药物
浓度
吸光度/A532
清除率/%
对照组
0.649±0.012
甘露醇/mmol.L-1
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5
0.513±0.031*1
21.03
10
0.485±0.037*1
25.30
20
0.345±0.026*2
46.90
40
0.150±0.009*2
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76.96
姜黄素/μmol.L-1
20
0.381±0.016*2
41.29
40
0.361±0.013*2
44.38
60
0.342±0.015*2
47.30
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80
0.311±0.018*2
52.08
100
0.216±0.012*2
66.72
图1 姜黄素(150min)抑制小鼠红细胞氧化性溶血的量效关系/n=3，x±s
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图2 姜黄素(120μmol/L)抑制小鼠红细胞氧化性溶血的时效关系/n=3，x±s
1-AAPH组；2-AAPH+姜黄素(120μmol/L)组；3-对照组(无AAPH，无姜黄素)
3 讨 论
机体在代谢过程中可以产生O-2，OH，过氧化氢(H2O2),单线态氧(1O2),它们统称为活性氧自由基。在正常生理状态下，这些活性氧的产生和清除处于生理性低水平的平衡状态，对人体是必需的、有利的[2];但在某些病理情况下，无论何种原因使这些活性氧代谢失衡，活性氧含量就升高，脂类过氧化水平也升高。这种不平衡就会对机体造成损伤，引发多种疾病，包括癌症和炎症等[2～4]。因此，人们常常想到利用外源性能清除活性氧自由基或防御脂质过氧化的药物来治疗这些与活性氧及脂质过氧化密切有关的疾病[4,7,8]。
, 百拇医药
Cur具有抗癌变、抗炎症等广泛的药理作用[1]。O-2是人体内由氧衍生出来的第一个氧自由基，OH是人体内反应性最强的氧自由基，它们以及由它们介导的脂类过氧化与体内许多重要生理和病理过程密切相关，如癌变、炎症发生等，有研究表明某些氧自由基清除剂对上述过程有明显改善作用[2～4,8]。因此研究药物对O-2、OH及由它们介导的脂质过氧化的抑制作用就十分有意义。我们已经发现并报道了Cur对O-2具有良好的清除效能[5],本文又报道Cur对Fenton反应产生的OH亦具有良好的清除效能，同时对由AAPH诱发的红细胞氧化性溶血具有强的抑制作用。这为进一步阐明该药抗癌变、抗炎症等的作用机制提供重要理论依据。
王建舜，男，1964年生，西安医科大学药学系，学士
康九红，男，1969年9月生，博士。1995年9月起攻读自由基生物学方向博士学位，研究自由基清除剂药物、自由基与疾病，尤其是与癌的关系。1998年6月获博士学位
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参考文献
1，Ammon HPT,Wahl MA.Pharmacology of curcuma longa.Planta Med,1991,57(1)∶1.
2，郑荣梁.自由基生物学.北京：高等教育出版社，1992∶107～124，131～135，248～249.
3，Dreher D,Junod AF.Role of oxygen free radicals in cancer development.Eur J Cancer,1996,32A(1)∶30.
4，Kang JH,Shi YM,Zheng RL.Effects of ascorbic acid on human hepatoma cells proliferation and redifferentiation.Acta Pharmacol Sin,1999∶1019.
, http://www.100md.com
5，王建舜，容维祺，康九红.姜黄素对超氧阴离子的清除作用.西北国防医学杂志，1999，20(3)∶213.
6，康九红，张岫兰，王沁，等.肝胆宁对氧自由基及红细胞氧化性溶血的影响.中国现代应用药学原现代应用药学，1997，14(1)∶8.
7，Wang PF,Kang JH,Zheng RL,et al.Scavenging effects of phenylpropanoid glycosides from Pedicularis on superoxide anion and hydroxyl radical by the spin trapping method.Biochem Pharmacol,1996,51∶687.
8，Kang Jiuhong,Shi Yimin,Zheng Rongliang.Effects of ascorbic acid and DL-α-tocopherol on human hepatoma cells proliferation and redifferentiation.Acta Pharmacol Sin,1999,20(in press).
收稿日期：1999-06-18, 百拇医药