我国原发性开角型青光眼患者TIGR基因突变筛选、克隆及序列分析
作者：卓业鸿 葛坚 郭彦 蓝育青 李莉
单位：中山医科大学中山眼科中心 广州，510060
关键词：青光眼；开角型；糖皮质激素诱导反应蛋白；基因；DNA突变；克隆；分子
中华眼科杂志000604 【摘要】 目的 研究我国原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)患者小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白(trabecular meshwork induced glucocorticoid response protein, TIGR)基因的突变情况。方法 (1)应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法扩增70例POAG患者、20例正常对照组的TIGR 基因3个外显子(7对引物)的各个片段，应用单链构像多态(single- stranded conformation polymorphism, SSCP)筛选可能突变的PCR产物。(2)将筛选出的样本(PCR产物)，克隆到PT-Adv载体，以Ecor I酶切鉴定重组质粒，然后用ABI-373自动测序仪行双向测序。结果 (1)用SSCP方法筛选的2例POAG患者在TIGR基因第3外显子中部(第6对引物)片段出现单链带型异常；正常对照组未见异常。(2)克隆测序的2例样品，1例在388密码子位置出现由GAT突变为AAT，氨基酸由天冬氨酸替换为天冬酰胺，即Asp388Asn；另1例碱基序列无变化。提示我国POAG患者TIGR基因突变仅为1.4%(1/70)，远较国外为低。结论 我国POAG患者的发病机制可能与TIGR基因突变有关，但突变率较国外低，提示POAG发病存在地区或种族之间的差异。
, 百拇医药
To screen, clone and sequence TIGR gene mutation in Chinese patients with primary open- angle glaucoma
ZHUO Yehong, GE Jian, GUO Yan, et al.
(Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060，China)
【Abstract】 Objective To study trabecular meshwork induced glucocorticoid response protein (TIGR) gene mutation in Chinese patients with primary open-angle glaucoma (POAG). Methods (1) From 70 patients with POAG and 20 normal controls, TIGR gene which consists of three exons (7 pairs of primer) was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The mutation of PCR amplification products was evaluated by single-stranded conformation polymorphism (SSCP). (2) After the above PCR products were cloned into the PT-Adv vectors, the construction plasmids were evaluated by Ecor I endonuclease and direct sequence was performed. Results (1) With SSCP screening, the single strand band abnormality was found in the middle fragments of the third exon (the sixth pair of primer) of TIGR gene in two patients with POAG, but the control group appeared normal. (2) The two samples using clone and sequence showed that one had a 'GAT'- to- 'AAT' transition at amino acid Asp 338 Asn mutation; the base sequence of another one had no change. These results suggested that mutation rate of TIGR gene in Chinese patients with POAG be only 1.4% (1/70), being lower than that of foreigners. Conclusion The pathogenesis of Chinese patients with POAG may be related with TIGR gene mutation, but the mutation rate is lower than that in foreigners, indicating that the mechanism of POAG in China and aboard is different and the pathogenesis of POAG has difference in regions and races.
, 百拇医药
【Key words】 Primary open-angle glaucoma； Glucocorticoid response protein, trabecular meshwork induced； Genes； DNA mutation； Cloning, molecular
青光眼的遗传倾向早已为人们所关注。近年研究表明原发性开角型青光眼(primary open- angle glaucoma，POAG)致病的相关基因位于1q21至1q 31[1]， 进一步的连锁分析将这个区域缩短在DIS3665 至DIS3664区间[2]。位于该区域的小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白(trabecular meshwork induced glucocorticoid response protein, TIGR)基因也被证实与青少年发病的POAG及部分非选择性POAG患者的发病有关，并发现多个突变点[3]。为探讨TIGR基因突变与我国POAG患者发病的关系，我们对70 例进展期POAG患者的TIGR 基因进行分析，现将结果报告如下。
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资料与方法
一、诊断标准
参照1987年全国青光眼学组推荐的诊断标准，选择确诊为POAG(包括青少年发病和成年发病)的进展期或晚期而拟行抗青光眼手术的住院患者70例作为研究对象，其中男48 例，女22例，年龄14～40岁，所有患者均无明显青光眼家族史。对照组为排除青光眼及其他眼病的正常人20例。
二、实验方法
1.提取DNA:抽取每人的外周血1或2 ml，以Qiagen血样试剂盒进行基因组DNA的提取。
2.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)：以基因DNA为模板，用PCR反应扩增TIGR基因的3个外显子片段，包含各外显子的7对引物(表1)：
, 百拇医药
表1 用PCR反应扩增TIGR基因的3个
外显子片段的7对引物 外显子
正向引物
反向引物
Ⅰ
AATCTTGCTGGCAGCGTG
AGCTGGATTCATTGGGAC
TGCAATGAGGTTCTTCTG
TCCAACTCTCTGGTTTGGG
CAGTCATCCATAACTTAC
ATATCACCTGCTGAACTC
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Ⅱ
CATAGTCAATCCTTGGGC
GGGAACAGAGAGAGAGAG
Ⅲ
GGATTAAGTGGTGCTTCG
AATACGGGAACTGTCCGTGG
AGAAGGAAATCCCTGGAG
CATAAGTGACCATGTTCAAG
ATTGACTACAACCCCCTG
GCTTGTGGTAACCATGTAAC
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在50 μl反应体系中含有100ng模板，5μl的10倍缓冲液,5μl的三磷酸脱氧核糖核苷,引物各5 pmol, 0.5 μl 的Vent聚合酶。反应条件：变性94°，30 s，退火55°，30 s，延伸72°，30 s，共35个循环。最后 72°，2 min时，以电泳检测产物。
3.突变筛选：用单链构像多态(single-stranded conformation polymorphism,SSCP)法，将以上产物用垂直胶电泳。凝胶主要成分：聚丙烯酰胺为49∶1，浓度为6%；10%过硫酸铵，TBE缓冲液；上样缓冲液为0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯氰、95%甲酰胺。在功率35W电泳10 h，银染观察结果。
4.克隆及测序：参照分子克隆实验指南中的克隆方法， 将SSCP法筛选出有带型异常的2例PCR 产物，应用T4克隆试剂盒(美国Clontech公司产品)克隆至PT-Adv载体，选择数个克隆，由内切酶EcorⅠ进行酶切鉴定，重组质粒由ABI-373 全自动测序仪进行双向测序，发现突变则用挑选的其他克隆重新测序以鉴定。
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结果
一、PCR扩增产物
所有PCR扩增产物均为特异性的DNA条带，在SSCP法电泳筛选中，POAG组除第3外显子的第2对引物所扩增产物有2例出现带型异常外(图1)，余均未见异常；正常对照组均未发现异常带型。
图1 SSCP筛选图
(箭头示筛选出的异常带型)
二、克隆的重组质粒
3 900 bp为载体
422 bp为酶切片段
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图2 重组质粒酶切图
(每例各选2个克隆)
2例克隆的重组质粒，经Ecor Ⅰ酶切鉴定，可见切出422 bp的片段，重组质粒测序结果可见其中1例在相当388氨基酸位置密码子由 GAT突变为AAT，氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺，即Asp388Asn(图2，3)，而另1例序列未测出突变。
“-”示第388密码子，由GAT突变为AAT，即由天冬氨酸替换为天冬酰胺
图3 POAG筛选有突变的ABI-373测序图
三、突变患者临床资料
患者男，27岁，偶然发现左眼视物不清1个月，于1998年3月25日来我院就诊。体检未见异常。眼部检查：右眼视力1.2；左眼光感，光定位不准确。眼压：右眼42 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，左眼52 mm Hg。双眼房角宽，全部开放，无发育异常迹象；前房深度3.0 mm。右眼底视乳头苍白，C/D为0.7，颞上方切迹明显，血管纡曲爬行；左眼视乳头弥漫萎缩、苍白，视乳头苍白>0.95。光学相干断层扫描：双眼视网膜神经纤维层明显变薄。视野检查：右眼上方偏盲，左眼不能查。术前局部滴用1%毛果芸香碱及0.5%噻吗心安眼液，全身口服醋氮酰胺。用药后右眼眼压22 mm Hg，左眼32 mm Hg,右眼行复合式小梁切除术，术后眼压控制良好。
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讨论
一、POAG的临床表现
POAG是一种常见的青光眼类型，主要表现为高眼压、视神经损害、视野缺损。国外一般分为青少年发病和成年发病两种类型。除发病年龄有区别外，其临床表现基本一致，且由于某些患者的发病年龄出现重叠，国内无标准将其严格区分。一般认为，POAG的发生与遗传因素有关。随着分子遗传学技术的成熟和发展，POAG发病机制的研究已进入分子水平，并有一定进展。
二、POAG的基因定位
1993年，Sheffield等[1]对一青少年发病的POAG家系成员的 DNA 进行全基因组搜索， 成功地运用小串联重复片段进行连锁分析，最终相关疾病基因定位于第1号染色体D1S194与D1S218之间的区域内，且显示出该疾病基因与D1S210 紧密连锁。另一庞大的POAG家系研究，又将该疾病基因更精确定位。第1号染色体上的青光眼相关疾病基因遂被命名为 GLCIA基因[1]，至今被誉为是青光眼遗传学研究历史的里程碑。随后， 这一发现又在其他10余个家系的连锁研究中多次得到证实[4,5]。
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三、TIGR基因的结构
根据酵母人工染色体序列标志目录图 (yeast artificial chromosome sequence laggedsite conlent mapping)和放射杂交图(radiation hybrid mapping )，最后确定青少年型青光眼致病的相关基因可能是TIGR[6](基因库检索号R95491，R95443，R47209和U85257)。研究表明，TIGR基因编码是1个504氨基酸的长多肽。基因由被2个大的内含子隔开的3个外显子组成(604、126、782bp)，启动子部位有糖皮质激素元件。
四、TIGR基因突变与POAG
Stone等[3]的研究表明：TIGR基因突变对部分POAG患者的发病起一定作用。据估计，约超过3%的POAG患者与TIGR基因突变有关；在美国约有10万青光眼患者因TIGR基因突变而患病[3]。基因突变为氨基酸替代突变，肯定的突变已经有数个种族的报告，包括Pro370Leu、Gln337Arg、Gly367Arg、Gln368STOP、Ile477Ser、Asn480Lys 、Ile499Phe等突变，这些突变均集中在第3外显子区域[7]，该位置相当于TIGR蛋白C末端的嗅觉介导素样区，此区域与嗅觉介导素40%同源，嗅觉介导素是嗅神经上皮的细胞外基质，与细胞结合活性有关。故有人推测该位置的突变将导致编码蛋白的改变，阻碍蛋白的吸收与代谢，造成蛋白的堆积并阻止房水流出使眼压升高，这种异常的眼压调节最后导致不可逆的青光眼性视功能损害[8,9]。
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五、我国POAG患者TIGR基因突变
鉴于我国与西方国家青光眼患者临床表现特征的差异，对我国POAG与TIGR基因关系的研究则相当重要。我们应用SSCP进行突变筛选，然后进行克隆和测序。SSCP是一种高效、方便的突变筛选方法，能检出单个碱基的变化，已广泛用于遗传突变的筛选。本实验中，检出2例患者有异常带型，其表现为轻链泳动改变。筛选出的2例样本进行克隆、测序，并经重复确认，发现其中1例碱基序列无变化；另1例在TIGR基因第3外显子第388密码子由GAT突变为AAT, 氨基酸则由天冬氨酸替换为天冬酰胺，即Asp388Asn，氨基酸的这种改变可能使TIGR的结构或结合功能受到影响，从而影响蛋白的活性，如前所述导致一系列的改变。本研究结果提示，我国POAG患者发病可能与该基因的突变有关，突变的位置与国外报道的不同，而且突变率比国外的低，仅1.4%(1/70)。因此，我们推测可能是由于种族和地区的差异而导致发病机制的不同。
尽管我们已经从POAG患者中筛选出TIGR基因地点突变，但这种单个碱基改变对相应蛋白功能的影响及其在POAG发病中的确切意义，仍需进一步研究。目前，我们正在应用一些新的分子生物学技术检测转TIGR基因对小梁细胞的影响及其对相应蛋白功能的影响，应用基因芯片技术检测POAG患者的其他基因突变，以期能加深对POAG分子发病机制的了解，为今后从基因水平阻止POAG的发生、发展提供新的理论依据。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金(39770789、39800163)、广东省青年基金(980112)、国家教委博士点基金(9856)资助项目
参考文献
1，Sheffield VC, Stone EM, Alward WLM,et al. Genetic linkage of familial open-angle glaucoma to chromosome 1q21-q31. Nat Genet, 1993,4:47-50.
2，Suden S, Alward WLM, Nichols BE, et al. Fine mapping of the autosomal dominant juvenile open-angle glaucoma ( GLC1A) region and evaluation of the candidate genes. Genome Res, 1996,6:862-869.
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3，Stone EM, Fingert JH, Alward WLM,et al. Identification of a gene that causes primary open angle glaucoma. Science, 1997,275:668-670.
4，Graff C, Urbak SF, Jerndal T, et al. Confirmation of linkage to 1q21- 31 in a Danish autosomal dominant juvenile- onset glaucoma family and evidence of genetic heterogeneity. Hum Genet, 1995,96:285-289.
5，Lichter PR, Richards JE, Boehnke M, et al. juvenile glaucoma linked to the GLC1A gene on chromosome 1q in a Panamanian family . Am J Ophthalmol, 1997, 123: 413-416.
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6，Nguyen TD, Chen P, Huang WD, et al. Gene structure and properties of TIGR, an olfactomedin-related glyocoprotein cloned from glucocorticoid-induced trabecular meshwork cells. J Biol Chem, 1998,273:6341-6350.
7，Sarfarzi M.Recent advances in molecular genetics of glaucomas. Hum Mol Genet, 1997,6:1667-1677.
8，Polansky JR, Fauss D, Chen P, et al.Cellular pharmacology and molecular biology of the trabecular meshwork inducible glucocorticoid response gene product. Ophthalmologica, 1997,211:126-139.
9，Ortego J, Escribano J, Coca-Prados M, et al. Cloning and characterization of subtracted cDNAs from a human ciliary body library encoding TIGR, a protein involved in juvenile open angle glaucoma with homology to myosin and olfactomedin. FEBS Lett, 1997,413:349-353.
(收稿日期：1999-12-30), http://www.100md.com
单位：中山医科大学中山眼科中心 广州，510060
关键词：青光眼；开角型；糖皮质激素诱导反应蛋白；基因；DNA突变；克隆；分子
中华眼科杂志000604 【摘要】 目的 研究我国原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)患者小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白(trabecular meshwork induced glucocorticoid response protein, TIGR)基因的突变情况。方法 (1)应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法扩增70例POAG患者、20例正常对照组的TIGR 基因3个外显子(7对引物)的各个片段，应用单链构像多态(single- stranded conformation polymorphism, SSCP)筛选可能突变的PCR产物。(2)将筛选出的样本(PCR产物)，克隆到PT-Adv载体，以Ecor I酶切鉴定重组质粒，然后用ABI-373自动测序仪行双向测序。结果 (1)用SSCP方法筛选的2例POAG患者在TIGR基因第3外显子中部(第6对引物)片段出现单链带型异常；正常对照组未见异常。(2)克隆测序的2例样品，1例在388密码子位置出现由GAT突变为AAT，氨基酸由天冬氨酸替换为天冬酰胺，即Asp388Asn；另1例碱基序列无变化。提示我国POAG患者TIGR基因突变仅为1.4%(1/70)，远较国外为低。结论 我国POAG患者的发病机制可能与TIGR基因突变有关，但突变率较国外低，提示POAG发病存在地区或种族之间的差异。
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To screen, clone and sequence TIGR gene mutation in Chinese patients with primary open- angle glaucoma
ZHUO Yehong, GE Jian, GUO Yan, et al.
(Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060，China)
【Abstract】 Objective To study trabecular meshwork induced glucocorticoid response protein (TIGR) gene mutation in Chinese patients with primary open-angle glaucoma (POAG). Methods (1) From 70 patients with POAG and 20 normal controls, TIGR gene which consists of three exons (7 pairs of primer) was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The mutation of PCR amplification products was evaluated by single-stranded conformation polymorphism (SSCP). (2) After the above PCR products were cloned into the PT-Adv vectors, the construction plasmids were evaluated by Ecor I endonuclease and direct sequence was performed. Results (1) With SSCP screening, the single strand band abnormality was found in the middle fragments of the third exon (the sixth pair of primer) of TIGR gene in two patients with POAG, but the control group appeared normal. (2) The two samples using clone and sequence showed that one had a 'GAT'- to- 'AAT' transition at amino acid Asp 338 Asn mutation; the base sequence of another one had no change. These results suggested that mutation rate of TIGR gene in Chinese patients with POAG be only 1.4% (1/70), being lower than that of foreigners. Conclusion The pathogenesis of Chinese patients with POAG may be related with TIGR gene mutation, but the mutation rate is lower than that in foreigners, indicating that the mechanism of POAG in China and aboard is different and the pathogenesis of POAG has difference in regions and races.
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【Key words】 Primary open-angle glaucoma； Glucocorticoid response protein, trabecular meshwork induced； Genes； DNA mutation； Cloning, molecular
青光眼的遗传倾向早已为人们所关注。近年研究表明原发性开角型青光眼(primary open- angle glaucoma，POAG)致病的相关基因位于1q21至1q 31[1]， 进一步的连锁分析将这个区域缩短在DIS3665 至DIS3664区间[2]。位于该区域的小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白(trabecular meshwork induced glucocorticoid response protein, TIGR)基因也被证实与青少年发病的POAG及部分非选择性POAG患者的发病有关，并发现多个突变点[3]。为探讨TIGR基因突变与我国POAG患者发病的关系，我们对70 例进展期POAG患者的TIGR 基因进行分析，现将结果报告如下。
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资料与方法
一、诊断标准
参照1987年全国青光眼学组推荐的诊断标准，选择确诊为POAG(包括青少年发病和成年发病)的进展期或晚期而拟行抗青光眼手术的住院患者70例作为研究对象，其中男48 例，女22例，年龄14～40岁，所有患者均无明显青光眼家族史。对照组为排除青光眼及其他眼病的正常人20例。
二、实验方法
1.提取DNA:抽取每人的外周血1或2 ml，以Qiagen血样试剂盒进行基因组DNA的提取。
2.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)：以基因DNA为模板，用PCR反应扩增TIGR基因的3个外显子片段，包含各外显子的7对引物(表1)：
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表1 用PCR反应扩增TIGR基因的3个
外显子片段的7对引物 外显子
正向引物
反向引物
Ⅰ
AATCTTGCTGGCAGCGTG
AGCTGGATTCATTGGGAC
TGCAATGAGGTTCTTCTG
TCCAACTCTCTGGTTTGGG
CAGTCATCCATAACTTAC
ATATCACCTGCTGAACTC
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Ⅱ
CATAGTCAATCCTTGGGC
GGGAACAGAGAGAGAGAG
Ⅲ
GGATTAAGTGGTGCTTCG
AATACGGGAACTGTCCGTGG
AGAAGGAAATCCCTGGAG
CATAAGTGACCATGTTCAAG
ATTGACTACAACCCCCTG
GCTTGTGGTAACCATGTAAC
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在50 μl反应体系中含有100ng模板，5μl的10倍缓冲液,5μl的三磷酸脱氧核糖核苷,引物各5 pmol, 0.5 μl 的Vent聚合酶。反应条件：变性94°，30 s，退火55°，30 s，延伸72°，30 s，共35个循环。最后 72°，2 min时，以电泳检测产物。
3.突变筛选：用单链构像多态(single-stranded conformation polymorphism,SSCP)法，将以上产物用垂直胶电泳。凝胶主要成分：聚丙烯酰胺为49∶1，浓度为6%；10%过硫酸铵，TBE缓冲液；上样缓冲液为0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯氰、95%甲酰胺。在功率35W电泳10 h，银染观察结果。
4.克隆及测序：参照分子克隆实验指南中的克隆方法， 将SSCP法筛选出有带型异常的2例PCR 产物，应用T4克隆试剂盒(美国Clontech公司产品)克隆至PT-Adv载体，选择数个克隆，由内切酶EcorⅠ进行酶切鉴定，重组质粒由ABI-373 全自动测序仪进行双向测序，发现突变则用挑选的其他克隆重新测序以鉴定。
, 百拇医药
结果
一、PCR扩增产物
所有PCR扩增产物均为特异性的DNA条带，在SSCP法电泳筛选中，POAG组除第3外显子的第2对引物所扩增产物有2例出现带型异常外(图1)，余均未见异常；正常对照组均未发现异常带型。
图1 SSCP筛选图
(箭头示筛选出的异常带型)
二、克隆的重组质粒
3 900 bp为载体
422 bp为酶切片段
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图2 重组质粒酶切图
(每例各选2个克隆)
2例克隆的重组质粒，经Ecor Ⅰ酶切鉴定，可见切出422 bp的片段，重组质粒测序结果可见其中1例在相当388氨基酸位置密码子由 GAT突变为AAT，氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺，即Asp388Asn(图2，3)，而另1例序列未测出突变。
“-”示第388密码子，由GAT突变为AAT，即由天冬氨酸替换为天冬酰胺
图3 POAG筛选有突变的ABI-373测序图
三、突变患者临床资料
患者男，27岁，偶然发现左眼视物不清1个月，于1998年3月25日来我院就诊。体检未见异常。眼部检查：右眼视力1.2；左眼光感，光定位不准确。眼压：右眼42 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，左眼52 mm Hg。双眼房角宽，全部开放，无发育异常迹象；前房深度3.0 mm。右眼底视乳头苍白，C/D为0.7，颞上方切迹明显，血管纡曲爬行；左眼视乳头弥漫萎缩、苍白，视乳头苍白>0.95。光学相干断层扫描：双眼视网膜神经纤维层明显变薄。视野检查：右眼上方偏盲，左眼不能查。术前局部滴用1%毛果芸香碱及0.5%噻吗心安眼液，全身口服醋氮酰胺。用药后右眼眼压22 mm Hg，左眼32 mm Hg,右眼行复合式小梁切除术，术后眼压控制良好。
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讨论
一、POAG的临床表现
POAG是一种常见的青光眼类型，主要表现为高眼压、视神经损害、视野缺损。国外一般分为青少年发病和成年发病两种类型。除发病年龄有区别外，其临床表现基本一致，且由于某些患者的发病年龄出现重叠，国内无标准将其严格区分。一般认为，POAG的发生与遗传因素有关。随着分子遗传学技术的成熟和发展，POAG发病机制的研究已进入分子水平，并有一定进展。
二、POAG的基因定位
1993年，Sheffield等[1]对一青少年发病的POAG家系成员的 DNA 进行全基因组搜索， 成功地运用小串联重复片段进行连锁分析，最终相关疾病基因定位于第1号染色体D1S194与D1S218之间的区域内，且显示出该疾病基因与D1S210 紧密连锁。另一庞大的POAG家系研究，又将该疾病基因更精确定位。第1号染色体上的青光眼相关疾病基因遂被命名为 GLCIA基因[1]，至今被誉为是青光眼遗传学研究历史的里程碑。随后， 这一发现又在其他10余个家系的连锁研究中多次得到证实[4,5]。
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三、TIGR基因的结构
根据酵母人工染色体序列标志目录图 (yeast artificial chromosome sequence laggedsite conlent mapping)和放射杂交图(radiation hybrid mapping )，最后确定青少年型青光眼致病的相关基因可能是TIGR[6](基因库检索号R95491，R95443，R47209和U85257)。研究表明，TIGR基因编码是1个504氨基酸的长多肽。基因由被2个大的内含子隔开的3个外显子组成(604、126、782bp)，启动子部位有糖皮质激素元件。
四、TIGR基因突变与POAG
Stone等[3]的研究表明：TIGR基因突变对部分POAG患者的发病起一定作用。据估计，约超过3%的POAG患者与TIGR基因突变有关；在美国约有10万青光眼患者因TIGR基因突变而患病[3]。基因突变为氨基酸替代突变，肯定的突变已经有数个种族的报告，包括Pro370Leu、Gln337Arg、Gly367Arg、Gln368STOP、Ile477Ser、Asn480Lys 、Ile499Phe等突变，这些突变均集中在第3外显子区域[7]，该位置相当于TIGR蛋白C末端的嗅觉介导素样区，此区域与嗅觉介导素40%同源，嗅觉介导素是嗅神经上皮的细胞外基质，与细胞结合活性有关。故有人推测该位置的突变将导致编码蛋白的改变，阻碍蛋白的吸收与代谢，造成蛋白的堆积并阻止房水流出使眼压升高，这种异常的眼压调节最后导致不可逆的青光眼性视功能损害[8,9]。
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五、我国POAG患者TIGR基因突变
鉴于我国与西方国家青光眼患者临床表现特征的差异，对我国POAG与TIGR基因关系的研究则相当重要。我们应用SSCP进行突变筛选，然后进行克隆和测序。SSCP是一种高效、方便的突变筛选方法，能检出单个碱基的变化，已广泛用于遗传突变的筛选。本实验中，检出2例患者有异常带型，其表现为轻链泳动改变。筛选出的2例样本进行克隆、测序，并经重复确认，发现其中1例碱基序列无变化；另1例在TIGR基因第3外显子第388密码子由GAT突变为AAT, 氨基酸则由天冬氨酸替换为天冬酰胺，即Asp388Asn，氨基酸的这种改变可能使TIGR的结构或结合功能受到影响，从而影响蛋白的活性，如前所述导致一系列的改变。本研究结果提示，我国POAG患者发病可能与该基因的突变有关，突变的位置与国外报道的不同，而且突变率比国外的低，仅1.4%(1/70)。因此，我们推测可能是由于种族和地区的差异而导致发病机制的不同。
尽管我们已经从POAG患者中筛选出TIGR基因地点突变，但这种单个碱基改变对相应蛋白功能的影响及其在POAG发病中的确切意义，仍需进一步研究。目前，我们正在应用一些新的分子生物学技术检测转TIGR基因对小梁细胞的影响及其对相应蛋白功能的影响，应用基因芯片技术检测POAG患者的其他基因突变，以期能加深对POAG分子发病机制的了解，为今后从基因水平阻止POAG的发生、发展提供新的理论依据。
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基金项目：国家自然科学基金(39770789、39800163)、广东省青年基金(980112)、国家教委博士点基金(9856)资助项目
参考文献
1，Sheffield VC, Stone EM, Alward WLM,et al. Genetic linkage of familial open-angle glaucoma to chromosome 1q21-q31. Nat Genet, 1993,4:47-50.
2，Suden S, Alward WLM, Nichols BE, et al. Fine mapping of the autosomal dominant juvenile open-angle glaucoma ( GLC1A) region and evaluation of the candidate genes. Genome Res, 1996,6:862-869.
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(收稿日期：1999-12-30), http://www.100md.com