喉癌中p16和CDK4表达的研究
作者：李吉平 周梁 金晓杰 谢明
单位：李吉平 周梁 金晓杰 谢明(上海第二医科大学附属仁济医院耳鼻咽喉-头颈外科 上海 200001)
关键词：喉肿瘤；基因产物，p16；基因产物，CDK4；免疫组织化学
肿瘤000618
摘要：目的 研究喉癌中p16、CDK4蛋白的表达情况及其与临床病理特点的关系。方法 以抗p16、抗CDK4抗体为标记物，采用SP(Streptavidin Peroxidase)免疫组织化学方法对28例喉癌及13例声带息肉石蜡标本进行分析。结果 p16在喉癌和声带息肉中的阳性率分别为60.71%和100%(P<0.01)；CDK4在喉癌和声带息肉中的阳性率分别为64.29 %和23.08 %(P<0.05)；p16在喉癌Ⅰ级组和Ⅱ级以上组中的阳性率分别为87.5 %和25 %(P<0.01)。CDK4在喉癌Ⅰ级组和Ⅱ级以上组中的阳性率分别为56.25 %和75 %(P>0.05)。结论 p16及CDK4蛋白在喉癌的发生中可能起重要作用，p16的表达与喉癌病理分级相关。
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中图分类号：R739.6 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0445-03
EXPRESSION OF p16 AND CDK4 IN LARYNGEAL CARCINOMA
LI Ji-ping ZHOU Liang JIN Xiao-jie
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Renji Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001
Abstract：Objective To investigate the expression of p16 and CDK4 proteins and their relationship with the clinical pathology of laryngeal carcinoma. Methods The expression of p16 and CDK4 were studied in 28 cases of laryngeal carcinoma and 13 cases of vocal cord polyps using SP (streptavidin peroxidase) immunohistochemical method. Results The percentage of p16 positive staining in laryngeal carcinoma and vocal cord polyps were 60.71% and 100% respectively (P<0.01), while those of CDK4 were 64.29% and 23.08%(P<0.05). Percentage of p16 positive stanining in laryngeal carcinoma of grade Ⅰ and those of higher grades were 87.5% and 25% respectively (P<0.01), while those of CDK4 were 56.25% and 75%(P>0.05).Conclusion Both p16 and CDK4 may be play an important role in laryngeal carcinogenesis. Expression of p16 is correlated with the clincial pathology of laryngeal carcinoma.
, 百拇医药
Key words： Laryngeal neoplasms； Gene products,p16; Gene products, CDK4; Immunohistochemistry
近年来细胞周期调控及其分子机制的阐明推动了肿瘤发生机理的研究。p16和CDK4是两种重要的细胞调控因子。本文用免疫组织化学对p16及CDK4在喉癌中的表达情况进行研究，并探讨两者与喉癌临床病理特点的相关性。
材料与方法
一、材料 收集我院病理科石蜡标本41例。其中喉鳞状细胞癌标本28例，病理分级：Ⅰ级16例，Ⅱ级以上者12例；临床分期：T1期8例，T2期5例，T3期8例，T4期3例，另4例无TNM分期记录：年龄44～80岁，平均65岁，男性25例，女性3例；声带息肉13例，年龄28～53岁，平均41岁，男性6例，女性7例。
二、方法 41例标本均采用SP(Streptavidin Peroxidase)法进行检测。第一抗分别为鼠源性p16单克隆抗体(Santa Cruz Cat#sc-1661)，稀释度1∶400；兔原性CDK4多克隆抗体(Santa Cruz Cat#sc-260),稀释度1∶200。第二、第三抗采用Anti-mouse SP试剂盒和Anti-rabbit SP试剂盒(购于福州迈星公司)。每次实验均设阳性对照、阴性对照和空白对照(PBS代一抗)。
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三、结果判断 参考文献[1]。根据p16及CDK4蛋白表达结果，分为表达阳性及表达阴性两组。41例标本分为息肉组(13例)和喉癌组(28例)；喉癌组中按病理分级分为鳞癌Ⅰ级和鳞癌Ⅱ级以上两组；按TNM分期分为T1、T2、T3、T4四组进行统计分析，其中有4例无TNM分期记录。因伴淋巴结转移者仅2例，未另外统计。各组的p16及CDK4蛋白表达差异情况采用SAS(statistical analysis system)软件进行分析。
结 果
一、p16在声带息肉和喉癌中表达的形态学观察 p16阳性反应物位于细胞核。在13例声带息肉的鳞状上皮中均可见到超过75 % 的上皮细胞核被染色深棕黄色。28例喉癌中，鳞癌细胞核部分呈阳性反应，部分呈阴性反应。阳性细胞的数目差异较大，介于5 %～95 %之间，且显色程度深浅不一。
二、p16在声带息肉和喉癌中的表达特点 13例声带息肉的鳞状上皮中均可见到p16的阳性表达，阳性率为100 %，28例喉癌中，p16阳性率为60.71 %，两者之间差别非常显著(P<0.01)。16例Ⅰ级分化的喉鳞癌中p16阳性者占87.5 %，12例Ⅱ级分化以上的喉鳞癌中p16阳性者占25 %，两者之间差别显著(P<0.01)。在8例 T1期病例中有5例阳性(62.5 %)，5 例T2期病例中有4例阳性(80 %)，8例T3期病例中有6例阳性(75 %)，3例T4期病例中有1例阳性(33.3 %)，各分期阶段p16的表达差异不显著(P>0.05)(见表1)。
, 百拇医药
表1 p16组化结果和临床参数的关系 p16蛋白
类型
病理分级
临床分期
喉癌
息肉
Ⅰ级
Ⅱ/Ⅲ
T1
T2
T3
T4
阳性
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17
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阴性
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P
<0.01
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三、CDK4在声带息肉及喉癌中表达的形态学观察 CDK4阳性表达物位于细胞浆。在13例声带息肉的鳞状上皮中CDK4阳性表达的细胞数目及显色程度不一，阳性细胞数介于20 %～95 %，染色深浅由不显色到显棕黄色。在28例喉鳞癌中阳性细胞数及显色程度不一，阳性细胞数介于30 %～95 %，染色深浅由不显色到显棕黄色。表2 CDK4组化结果和临床参数的关系 CDK4蛋白
类型
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病理分级
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喉癌
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P
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>0.05
>0.05
四、CDK4在声带息肉和喉癌中的表达特点 13例声带息肉的鳞状上皮中CDK4阳性表达占23.08 %，28例喉癌中，CDK4阳性率为64.29 %，两者之间差别显著(P<0.05)。16例Ⅰ级分化的喉鳞癌中CDK4阳性者占56.25 %，12 例Ⅱ级分化以上的喉鳞癌CDK4阳性者占75 %，(P>0.05)。在8例T1期病例中有6例阳性(75 %)，5例T2期病例中4例阳性(80 %)，8例T3期病例中5例阳性(62.5 %)，3例T4期病例中3例阳性(100 %)，各分期阶段CDK4的表达差异不显著(P>0.05)(见表2)。
讨 论
, 百拇医药 本实验结果表明，p16在声带息肉中与喉癌中的表达有非常显著差异。在喉癌中病理分级越差者其p16表达越少，即p16的表达与喉癌分级呈负相关，这些结果与Jares用SSCP法检测p16基因突变的结果相似[2]。Wu Q用p16基因转染到膀胱癌细胞证明了p16基因的抑癌作用[3]。作者认为喉癌中由于p16蛋白的缺失，其调节细胞增殖的功能丧失，从而导致细胞的病理性繁殖，在个体水平表现为肿瘤的形成，且细胞恶性增殖程度与p16的缺失程度相关。本研究表明p16表达与喉癌的临床分期无关，可能与临床分期受多种因素影响有关，如患者因症状不明显而延误就诊，导致肿瘤蔓延发展至晚期等诸多因素。
研究结果表明CDK4具有致癌转化能力。作者对喉癌与声带息肉中鳞状上皮CDK4的表达进行比较，发现喉癌CDK4的表达量明显高于声带上皮，而在不同病理级别的肿瘤中CDK4的表达量无明显差异。与Tong等对肠腺癌的研究结果一致，Tong等发现肠腺癌中可见大量CDK4阳性细胞，而在相邻的正常组织中则极少见CDK4阳性细胞。在低度不典型增生腺瘤中CDK4阳性率为68.7%～24%，在高度不典型增生腺瘤CDK4阳性率为75.9%～16.2%，两者之间没有显著差异。作者的前期研究已证实了cyclinD1在喉癌细胞中高表达[4，5]，CDK4与cyclinD1结合可加速细胞的增殖，加之p16的缺失，丧失了调节CDK4.cyclinD1复合体功能的作用，从而导致细胞无限制增殖。此三者的功能失调在喉癌的发生中扮演重要角色。对其他肿瘤的研究同样表明存在cyclinD.CDK4表达的增加及p16表达的缺失[6]。
, 百拇医药
本实验采用免疫组织化学技术对喉癌中p16和CDK4蛋白表达情况进行研究，证实了在喉癌中存在p16蛋白缺失及CDK4蛋白的过度表达。
基金项目：本研究为上海市“跨世纪百人计划”课题之一
李吉平，男，硕士，住院医师。
参考文献
[1]许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结合的判断标准〔J〕.中国癌症杂志，1996，6(4)：229
[2]Jares P, Fernandz PL, Nadal A, et al. P16MTS1/CDK4I mutations and concomitant loss of heterozygosity at 9p21-23 are frequent events in squamous cell carcinoma of the larynx〔J〕. Oncogene,1997,15(12):1445
, 百拇医药
[3]Wu Q, Possati L, Montesi M, et al. Growth arrest and suppression of tumorigenicity of bladder carcinoma cell lines induced by the p16/CDKN2 gene and other loci on human chromosome 9〔J〕. Int J Cancer, 1996,65(6):840
[4]陈洁，金西铭，周梁.细胞周期蛋白D1基因的表达与喉鳞癌相关性研究〔J〕.临床耳鼻咽喉科杂志，1999，13(6)：268
[5]陈洁，金西铭，周梁.Cyclin D1蛋白的过度表达与喉鳞癌患者的预后〔J〕.耳鼻咽喉头颈外科，1999，6(3)：157
[6]Jun Yao, Raphael E Pellock, Aiqing Lang, et al. Infrequent mutation of the p16/MTS1 gene and overexpression of cyclin-dependent kinase 4 in human primary soft-tissue sarcoma〔J〕. Clin Cancer Res,1998,4:1065
(收稿日期：1999-12-09；修回日期：2000-03-25), http://www.100md.com
单位：李吉平 周梁 金晓杰 谢明(上海第二医科大学附属仁济医院耳鼻咽喉-头颈外科 上海 200001)
关键词：喉肿瘤；基因产物，p16；基因产物，CDK4；免疫组织化学
肿瘤000618
摘要：目的 研究喉癌中p16、CDK4蛋白的表达情况及其与临床病理特点的关系。方法 以抗p16、抗CDK4抗体为标记物，采用SP(Streptavidin Peroxidase)免疫组织化学方法对28例喉癌及13例声带息肉石蜡标本进行分析。结果 p16在喉癌和声带息肉中的阳性率分别为60.71%和100%(P<0.01)；CDK4在喉癌和声带息肉中的阳性率分别为64.29 %和23.08 %(P<0.05)；p16在喉癌Ⅰ级组和Ⅱ级以上组中的阳性率分别为87.5 %和25 %(P<0.01)。CDK4在喉癌Ⅰ级组和Ⅱ级以上组中的阳性率分别为56.25 %和75 %(P>0.05)。结论 p16及CDK4蛋白在喉癌的发生中可能起重要作用，p16的表达与喉癌病理分级相关。
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中图分类号：R739.6 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0445-03
EXPRESSION OF p16 AND CDK4 IN LARYNGEAL CARCINOMA
LI Ji-ping ZHOU Liang JIN Xiao-jie
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Renji Hospital of Shanghai Second Medical University, Shanghai 200001
Abstract：Objective To investigate the expression of p16 and CDK4 proteins and their relationship with the clinical pathology of laryngeal carcinoma. Methods The expression of p16 and CDK4 were studied in 28 cases of laryngeal carcinoma and 13 cases of vocal cord polyps using SP (streptavidin peroxidase) immunohistochemical method. Results The percentage of p16 positive staining in laryngeal carcinoma and vocal cord polyps were 60.71% and 100% respectively (P<0.01), while those of CDK4 were 64.29% and 23.08%(P<0.05). Percentage of p16 positive stanining in laryngeal carcinoma of grade Ⅰ and those of higher grades were 87.5% and 25% respectively (P<0.01), while those of CDK4 were 56.25% and 75%(P>0.05).Conclusion Both p16 and CDK4 may be play an important role in laryngeal carcinogenesis. Expression of p16 is correlated with the clincial pathology of laryngeal carcinoma.
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Key words： Laryngeal neoplasms； Gene products,p16; Gene products, CDK4; Immunohistochemistry
近年来细胞周期调控及其分子机制的阐明推动了肿瘤发生机理的研究。p16和CDK4是两种重要的细胞调控因子。本文用免疫组织化学对p16及CDK4在喉癌中的表达情况进行研究，并探讨两者与喉癌临床病理特点的相关性。
材料与方法
一、材料 收集我院病理科石蜡标本41例。其中喉鳞状细胞癌标本28例，病理分级：Ⅰ级16例，Ⅱ级以上者12例；临床分期：T1期8例，T2期5例，T3期8例，T4期3例，另4例无TNM分期记录：年龄44～80岁，平均65岁，男性25例，女性3例；声带息肉13例，年龄28～53岁，平均41岁，男性6例，女性7例。
二、方法 41例标本均采用SP(Streptavidin Peroxidase)法进行检测。第一抗分别为鼠源性p16单克隆抗体(Santa Cruz Cat#sc-1661)，稀释度1∶400；兔原性CDK4多克隆抗体(Santa Cruz Cat#sc-260),稀释度1∶200。第二、第三抗采用Anti-mouse SP试剂盒和Anti-rabbit SP试剂盒(购于福州迈星公司)。每次实验均设阳性对照、阴性对照和空白对照(PBS代一抗)。
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三、结果判断 参考文献[1]。根据p16及CDK4蛋白表达结果，分为表达阳性及表达阴性两组。41例标本分为息肉组(13例)和喉癌组(28例)；喉癌组中按病理分级分为鳞癌Ⅰ级和鳞癌Ⅱ级以上两组；按TNM分期分为T1、T2、T3、T4四组进行统计分析，其中有4例无TNM分期记录。因伴淋巴结转移者仅2例，未另外统计。各组的p16及CDK4蛋白表达差异情况采用SAS(statistical analysis system)软件进行分析。
结 果
一、p16在声带息肉和喉癌中表达的形态学观察 p16阳性反应物位于细胞核。在13例声带息肉的鳞状上皮中均可见到超过75 % 的上皮细胞核被染色深棕黄色。28例喉癌中，鳞癌细胞核部分呈阳性反应，部分呈阴性反应。阳性细胞的数目差异较大，介于5 %～95 %之间，且显色程度深浅不一。
二、p16在声带息肉和喉癌中的表达特点 13例声带息肉的鳞状上皮中均可见到p16的阳性表达，阳性率为100 %，28例喉癌中，p16阳性率为60.71 %，两者之间差别非常显著(P<0.01)。16例Ⅰ级分化的喉鳞癌中p16阳性者占87.5 %，12例Ⅱ级分化以上的喉鳞癌中p16阳性者占25 %，两者之间差别显著(P<0.01)。在8例 T1期病例中有5例阳性(62.5 %)，5 例T2期病例中有4例阳性(80 %)，8例T3期病例中有6例阳性(75 %)，3例T4期病例中有1例阳性(33.3 %)，各分期阶段p16的表达差异不显著(P>0.05)(见表1)。
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表1 p16组化结果和临床参数的关系 p16蛋白
类型
病理分级
临床分期
喉癌
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三、CDK4在声带息肉及喉癌中表达的形态学观察 CDK4阳性表达物位于细胞浆。在13例声带息肉的鳞状上皮中CDK4阳性表达的细胞数目及显色程度不一，阳性细胞数介于20 %～95 %，染色深浅由不显色到显棕黄色。在28例喉鳞癌中阳性细胞数及显色程度不一，阳性细胞数介于30 %～95 %，染色深浅由不显色到显棕黄色。表2 CDK4组化结果和临床参数的关系 CDK4蛋白
类型
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病理分级
临床分期
喉癌
息肉
Ⅰ级
Ⅱ/Ⅲ
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四、CDK4在声带息肉和喉癌中的表达特点 13例声带息肉的鳞状上皮中CDK4阳性表达占23.08 %，28例喉癌中，CDK4阳性率为64.29 %，两者之间差别显著(P<0.05)。16例Ⅰ级分化的喉鳞癌中CDK4阳性者占56.25 %，12 例Ⅱ级分化以上的喉鳞癌CDK4阳性者占75 %，(P>0.05)。在8例T1期病例中有6例阳性(75 %)，5例T2期病例中4例阳性(80 %)，8例T3期病例中5例阳性(62.5 %)，3例T4期病例中3例阳性(100 %)，各分期阶段CDK4的表达差异不显著(P>0.05)(见表2)。
讨 论
, 百拇医药 本实验结果表明，p16在声带息肉中与喉癌中的表达有非常显著差异。在喉癌中病理分级越差者其p16表达越少，即p16的表达与喉癌分级呈负相关，这些结果与Jares用SSCP法检测p16基因突变的结果相似[2]。Wu Q用p16基因转染到膀胱癌细胞证明了p16基因的抑癌作用[3]。作者认为喉癌中由于p16蛋白的缺失，其调节细胞增殖的功能丧失，从而导致细胞的病理性繁殖，在个体水平表现为肿瘤的形成，且细胞恶性增殖程度与p16的缺失程度相关。本研究表明p16表达与喉癌的临床分期无关，可能与临床分期受多种因素影响有关，如患者因症状不明显而延误就诊，导致肿瘤蔓延发展至晚期等诸多因素。
研究结果表明CDK4具有致癌转化能力。作者对喉癌与声带息肉中鳞状上皮CDK4的表达进行比较，发现喉癌CDK4的表达量明显高于声带上皮，而在不同病理级别的肿瘤中CDK4的表达量无明显差异。与Tong等对肠腺癌的研究结果一致，Tong等发现肠腺癌中可见大量CDK4阳性细胞，而在相邻的正常组织中则极少见CDK4阳性细胞。在低度不典型增生腺瘤中CDK4阳性率为68.7%～24%，在高度不典型增生腺瘤CDK4阳性率为75.9%～16.2%，两者之间没有显著差异。作者的前期研究已证实了cyclinD1在喉癌细胞中高表达[4，5]，CDK4与cyclinD1结合可加速细胞的增殖，加之p16的缺失，丧失了调节CDK4.cyclinD1复合体功能的作用，从而导致细胞无限制增殖。此三者的功能失调在喉癌的发生中扮演重要角色。对其他肿瘤的研究同样表明存在cyclinD.CDK4表达的增加及p16表达的缺失[6]。
, 百拇医药
本实验采用免疫组织化学技术对喉癌中p16和CDK4蛋白表达情况进行研究，证实了在喉癌中存在p16蛋白缺失及CDK4蛋白的过度表达。
基金项目：本研究为上海市“跨世纪百人计划”课题之一
李吉平，男，硕士，住院医师。
参考文献
[1]许良中，杨文涛.免疫组织化学反应结合的判断标准〔J〕.中国癌症杂志，1996，6(4)：229
[2]Jares P, Fernandz PL, Nadal A, et al. P16MTS1/CDK4I mutations and concomitant loss of heterozygosity at 9p21-23 are frequent events in squamous cell carcinoma of the larynx〔J〕. Oncogene,1997,15(12):1445
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[3]Wu Q, Possati L, Montesi M, et al. Growth arrest and suppression of tumorigenicity of bladder carcinoma cell lines induced by the p16/CDKN2 gene and other loci on human chromosome 9〔J〕. Int J Cancer, 1996,65(6):840
[4]陈洁，金西铭，周梁.细胞周期蛋白D1基因的表达与喉鳞癌相关性研究〔J〕.临床耳鼻咽喉科杂志，1999，13(6)：268
[5]陈洁，金西铭，周梁.Cyclin D1蛋白的过度表达与喉鳞癌患者的预后〔J〕.耳鼻咽喉头颈外科，1999，6(3)：157
[6]Jun Yao, Raphael E Pellock, Aiqing Lang, et al. Infrequent mutation of the p16/MTS1 gene and overexpression of cyclin-dependent kinase 4 in human primary soft-tissue sarcoma〔J〕. Clin Cancer Res,1998,4:1065
(收稿日期：1999-12-09；修回日期：2000-03-25), http://www.100md.com