腺样囊性癌两个细胞系体外侵袭能力比较
作者：毛立民 于世凤 侯艳蓉
单位：毛立民 侯艳蓉(哈尔滨医科大学第一临床医学院 哈尔滨 150001)；于世凤(北京医科大学口腔医学院)于世凤(北京医科大学口腔医学院)；毛立民 侯艳蓉(哈尔滨医科大学第一临床医学院 哈尔滨 150001)
关键词：腺样囊性癌；肿瘤侵袭；粘附性；运动性；胶原酶
肿瘤000609
摘要：目的 研究转移潜能不同的两个腺样囊性癌细胞系体外侵袭能力的差异。方法 选用肺低转移细胞系Acc-2和从中筛选出的肺高转移细胞系Acc-M，利用MTT法检测与几种基底膜成分的粘附能力；划痕法检测运动能力；PAGE底物酶谱法检测分泌Ⅳ型胶原酶的能力； 改良勃顿小室法观察对重组基底膜的侵袭能力。结果 ①1小时后Acc-2细胞系对3种细胞外基质的粘附率分别是纤维粘连蛋白(FN)61.8 %、层粘连蛋白(LN)42.9 %和基底膜胶(Matrigel)60.4 %，Acc-M细胞系的粘附率分别是FN 79.4%、LN 71.1%、Matrigel 69.8%。②12小时终止实验时，测定Acc-2细胞系和Acc-M细胞系的运动速度分别是1.15 μm/h和2.26 μm/h。③Acc-M细胞系的培养上清中可以检测到Ⅳ型胶原酶活性，而Acc-2细胞系的培养上清中检测不到Ⅳ型胶原酶活性。④8小时终止实验时Acc-2细胞系和Acc-M细胞系对重组基底膜的侵袭率分别是68.0±4.35和103.2±5.63。结论 两个腺样囊性癌细胞系的异质型粘附能力、运动能力、分泌Ⅳ型胶原酶的能力及侵袭重组基底膜能力明显不同，并与其转移潜能的强弱相一致。
, 百拇医药
中图分类号：R73-34 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0419-04
COMPARATIVE STUDY OF INVASION POTENTIALS IN VITRO WITH TWO HUMAN SALIVARY ADENOID CYSTIC CARCINOMA CELL LINES
MAO Li-min YU Shi-feng
School of Stomatology,Beijing Medical University, Beijing 100081,P.R.China
HOU Yan-rong
School of Stomatology,Haerbin Medical University, Haerbin 15001,P.R.China
, http://www.100md.com
Abstract：Objective To investigate the invasion ability in vitro of two human salivary adenoid cystic carcinoma cell lines with different metastatic potentials.Methods The Acc-2 cell line with low lung metastatic potential and the Acc-M cell line (selected from the Acc-2 cell line) with high lung metastatic potential were used. The adhesive ability to various basement membrance components of the two cell lines was measured by MTT assay, the cell locomotive ability by wound assay, the type Ⅳ collagenase was assessed by PAGE substrate zymography, and the invasion ability by modified Boyden chamber.Results ①The adhesive rates of Acc-2 cell line after 1 h were FN 61.8%、LN 42.9%、MG 60.4 %，and that of Acc-M cell line were FN 79.4%、LN 71.1%、MG 69.8% respectively.②In the wound assay, after 12 hr the locomotive rates of Acc-2 and Acc-M were 1.15 μm/h and 2.26 μm/h.③The type Ⅳ collagenase activity was detected in serum-free supernatant of Acc-M cell line, whereas the Acc-2 cell line was lack of type Ⅳ collagenase activity.④Eight hours after the invasion of the basement membrance matrix, the number of invading cells in high power field of Acc-2 and Acc-M were 68.0±4.35 and 103.2±5.63. Conclusion The results showed that the invasion of Acc-2 and Acc-M was progressive in nature and the heterogeneous adhesive ability,motility,type Ⅳ collagenase activity and invasive capability of these two variants were significantly different and correlative with their metastatic potential.
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Key words： Adenoid cystic carcinoma; Neoplasm invasion; Adhesive ability; Locomotive ability, collagenase
侵袭性和转移性是癌细胞最主要的生物学特性，也是恶性肿瘤的重要标志。根据肿瘤异质性理论[1]，在一个原发性恶性肿瘤细胞群中，存在着转移潜能不同的细胞亚系。阐明不同亚系的侵袭性与转移潜能的关系，不但有利于对侵袭、转移机制的了解，还可用于制定合理的肿瘤治疗方案及筛选有效的抗肿瘤侵袭、转移药物。腺样囊性癌是涎腺常见的恶性肿瘤，其特征之一就是易侵犯邻近组织和向远隔脏器转移。本研究利用腺样囊性癌Acc-2细胞系和从中筛选出的肺高转移性Acc-M细胞系，对其体外的异质型粘附能力、运动能力、分泌Ⅳ型胶原酶能力及侵袭重组基底膜能力进行了定量分析，探讨了两者体外侵袭能力与其转移潜能的相关性。
材料与方法
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一、细胞株 腺样囊性癌Acc-2和Acc-M细胞系由上海第二医科大学口腔医学院建立，Acc-2细胞系裸鼠尾静脉二次注射后肺转移率为18 %，Acc-M细胞系裸鼠尾静脉一次注射后肺转移率为96%[2]。
二、试剂及仪器 纤维粘连蛋白(fibronectin FN)、层粘连蛋白(laminin LN)由北京医科大学细胞生物学教研室提供；人工基底膜胶(Matrigel)为Collaborative Biomedical产品；牛血清白蛋白(BSA)由北京军区兽医防治中心生物工程研究室提供；二甲基亚砜(DMSO)为北京化工厂产品；四氮唑盐(MTT)为Fluka产品；无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯(PVPF)滤膜，孔径12.0 μm，为Nucleopore产品；24孔Transwell细胞培养小室(Transwell cell culture chamber)为Costar产品；酶标仪(日本产，BID-RAD 550型)。
三、MTT法检测与细胞处基质的粘附能力 于96孔板每孔中分别加入含有FN、LN和Matrigel 2 μg的RPMI 1640培养液50 μl，室温干燥后，再加入20 μl含3%BSA的RPMI 1640培养液重层封闭，放入37 ℃细胞培养箱中1 h，用PBS冲洗后，将每ml含有8×105个细胞的0.1% BSA-RPMI 1640细胞悬液每孔加入100 μl，再次放入培养箱中1 h，用翻板法去掉培养基，每孔加入200 μl PBS，置平板摇床60 r/min振摇10 min，去除PBS和未粘附的细胞，每孔加MTT 40 μg，培养箱中放置4 h后，去除MTT，用纸巾吸尽残留液，每孔加入200 μl DMSO，用酶标仪在570 nm处测定，打印吸光度值。
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四、划痕法(wound assay)细胞运动性测定[3，4] 取无菌24孔板，先将底面外侧用细记号笔每孔做三条纵行测量标记线，再将FN用灭菌PBS按10 μg/ml稀释，每孔加入300 μl，室温放置1 h后用PBS轻洗2次。细胞消化离心后，用培养液按2.5 ×105/ml稀释，每孔加入细胞悬液400 μl，轻轻晃动培养板使细胞分布均匀。放入培养箱中5 h细胞贴壁后，用细胞刮子于孔内侧底面的中部划一条宽度相等的横行细胞刮除带。吸掉含有刮除的游离细胞的培养液，每孔加入新的培养液400 μl，于倒置显微镜下在刮除细胞带与标记线相交处拍照。然后放入培养箱中培育，每隔3 h观察1次，待细胞运动至即将汇合时用戊二醛固定，龙胆紫染色。划痕后当时每孔测定3处距离a、b、c，细胞运动后于同一位置测定的距离为a′、b′、c′，按以下公式计算出移动距离，并计算出运动速度。
五、PAGE明胶底物法测定Ⅳ型胶原酶活性[5] 24孔培养板中加入5×104个待测细胞，以无血清的RPMI 1640培养液200 μl培养2天后收集上清，2500 r/min离心10 min，沉淀细胞碎片。计数孔中的细胞数，按105个细胞量折算培养上清的电泳上样量。冰浴下电泳6～8 h后，分离胶以2.5 % Trition X-100洗脱SDS，用胶原酶缓冲液于37 ℃温育16 h，凝胶用考马斯亮蓝R250染色液染色，脱色液褪色至合适，测定时以人纤维肉瘤细胞HT-1080作为阳性对照，最后用激光光密度计在633 nm处测定电泳条带的积分吸光度值。
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六、改良勃顿小室法(modified boyden chamber)侵袭重组基底膜实验[6，7] 将PVPF滤膜光泽面向上贴于Transwell细胞培养小室底面，风干：在膜的外表面涂趋化剂FN 5 μg (10 μl)，待全干燥后再于膜的内表面涂Matrigel 5 μg (10 μl)，再次干燥后，将处于对数增殖期的Acc-2和Acc-M 细胞用EDTA消化、离心后，悬浮于含0.1 % BSA的RPMI 1640培养液中，最终浓度为2×106/ml，于每个Transwell上室内加入100 μl；再将整个Transwell放入含0.1% BSA的RPMI 1640培养液600 μl的24孔板内，置37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，分别于4、6、8 h取出，将滤膜用甲醇固定，HE染色，用棉签仔细擦掉位于膜内表面的未穿过膜的细胞后封片，于400 倍光学显微镜下每膜计数5个视野的侵袭细胞数，计算出每视野侵袭细胞的平均值。
结 果
, 百拇医药
一、与细胞外基质的粘附能力
两个细胞系对FN、LN、Matrigel的粘附性各不相同，Acc-M细胞系对三种细胞外基质的粘附能力均强于Acc-2细胞系，经统计学检查FN粘附能力对差别有显著性，对LN有高度显著性(见表1)。
表1 两个腺样囊性细胞系对三种细胞外基质的粘附能力 细胞外基质
吸光度值
粘附率%
Acc-2
Acc-M
Acc-2
Acc-M
FN
, 百拇医药
0.966±0.072
1.249±0.122
61.8
79.4
LN
0.768±0.055
1.100±0.022**
49.2
71.1
MG
0.943±0.057
1.089±0.088
, 百拇医药
60.4
69.8
注：用未经震荡冲洗条件下Acc-2粘附细胞的吸光度值1.564±0.075和Acc-M粘附细胞的吸光度值1.648±0.050作为对照计算粘附率，P<0.05，**P<0.01。
二、细胞株的运动能力
Acc-M细胞株运动能力强于Acc-2细胞株，于划痕后12 h终止实验时，Acc-M细胞株运动距离为27.12±3.85 μm；Acc-2细胞株运动距离为13.8±2.71 μm；其运动速度分别为2.26 μm/h和1.15 μm/h。
三、细胞培养上清中Ⅳ型胶原酶活性测定
结果显示，低转移的Acc-2细胞系不能产生Ⅳ型胶原酶，而高转移的Acc-M细胞株可产生92 kD和72 kD的两种Ⅳ型胶原酶，其中72 kD的Ⅳ型胶原酶活性较高。Acc-M细胞系分泌的Ⅳ型胶原酶仅略低于作为阳性对照的人纤维肉瘤HT-1080细胞系(见表2)。表2 Acc-M细胞系培养上清中Ⅳ型胶原酶活性(与HT-1080细胞比较) 细胞系
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Ⅳ型胶原酶
类型
积分吸光度值
体积
高度
面积
Acc-M
92kD
50146
15
789
72kD
76691
, 百拇医药
29
1151
HT-1080
902kD
77652
86
773
72kD
107779
177
1020
四、侵袭重组基底膜的能力
两个细胞系均具有侵袭重组基层膜的能力，但经侵袭后4、6、8 h三次计数侵袭细胞数，显示出转移潜能较高的Acc-M细胞系，其侵袭重组基底膜的能力也较强，其差异有高度显著性(见表3)。表3 两个腺样囊性癌细胞系侵袭重组基底膜能力 侵袭时间
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侵袭细胞数(个/视野)
t值
P值
Acc-2
Acc-M
4 h
26.4±3.20
39.8±3.42
5.713
<0.01**
6 h
53.2±3.70
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82.4±5.85
8.429
<0.01**
8 h
68.0±4.35
103.2±5.63
9.887
<0.01**
注：**差异有高度显著性
讨 论
肿瘤细胞的移位运动是指从瘤体组织表面脱离下来后，通过伪足活动牵引整个细胞移位。在肿瘤转移过程中，瘤细胞侵入基底膜和邻近组织、进入血循环、穿出血管壁进入继发部位等阶段，其运动性都是必不可少的生物学性能，因而，在克隆细胞株相互对照研究中，检测肿瘤细胞主动移行的能力，对研究肿瘤细胞侵袭和转移机制有重要作用。本研究表明，高转移的Acc-M细胞株的运动能力强于低转移的Acc-2细胞株，这与史宏男等[9]应用自制的改良Boyden小室法观察到的结果相似，说明肿瘤细胞运动性强弱也与其转移潜能成正相关。
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从原位的增殖性肿瘤到侵袭转移癌的演进过程中，肿瘤细胞还必须具备降解细胞外基质的能力。Ⅳ型胶原是细胞外基质的重要组成部分，而Ⅳ型胶原酶是一种能够降解Ⅳ型胶原的特异的蛋白水解酶，其活性是影响肿瘤侵袭和转移的重要因素之一。李红梅等[10]应用明胶酶谱法分析了不同转移潜能的人肿瘤细胞系金属蛋白酶活性，发现转移能力相对较高的细胞系产生金属蛋白酶的能力强于转移能力相对较低者。本实验结果显示，低转移的Acc-2细胞系不能产生Ⅳ型胶原酶，而高转移的Acc-M细胞系则分泌较高水平的Ⅳ型胶原酶，由此说明，肿瘤细胞侵袭转移的潜能与其产生Ⅳ型胶原酶的能力密切相关。
本实验应用的肿瘤侵袭重组基底膜模型中使用的基底膜胶(Matrigel)是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成份，含有LN、Ⅳ型胶原，接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在PVPF滤膜上，能在细胞培养基中重建形成膜结构，这种结构与天然基底膜结构极为相似，滤膜膜孔均被基底膜胶复盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，变形运动才能从一侧侵袭到另一侧，这与体内情况较为相似。Albini[6]等观察到正常细胞不能穿过这种重组基底膜，而肿瘤细胞穿过重组基底膜的能力与它体内侵袭能力表现出较好的相关性，并可用于体外观察药物对肿瘤细胞侵袭能力的影响。Liotta[11]对肿瘤侵袭通过基底膜过程提出了三步骤理论，第一步骤是癌细胞粘附到基质，该过程可被特殊的粘附因素所调节，第二步骤是癌细胞运动至基底膜表面，其运动方向受趋化因素的影响；第三步骤是癌细胞通过分泌水解酶降解基底膜。这说明癌侵袭是一个综合性过程，它必须以粘附为前提，以运动功能为动力，以分泌降解酶打开通路。
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侵袭和转移是恶性肿瘤行为中的两种表型，两者有密切联系，但又有各自的特点。侵袭和转移是一个过程中的两个阶段，侵袭是转移的前奏，转移是侵袭的后果。本文应用低转移腺样囊性癌细胞系和从中筛选出的高转移细胞系的体外侵袭实验结果显示，转移潜能高的克隆细胞系其异质性粘附能力、运动能力、分泌Ⅳ型胶原酶能力和侵袭重组基底膜能力均高于转移潜能低者，显示出体外侵袭性与转移潜能呈正相关，这对于了解腺样囊性癌的侵袭转移机制和选择有效的抗侵袭、抗转移的治疗方法具有重要意义。
毛立民，男，医学博士，副教授。
参考文献
[1]Heppher GH. Tumor heterogeneity〔J〕. Cancer Res,1984,44:2259
[2]关晓峰，邱蔚六，何荣根，等.肺高转移性涎腺腺样囊性癌细胞株的筛选〔J〕.中华口腔医学杂志，1996，31：74
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[3]Filippo G, Erkki R. Elevated levels of the α5β1 fibronectin receptor suppress the transformed phenotype of Chinese hamsteer ovary cells〔J〕. Cell,1990,60:849
[4]室园美映子，入村达郎.伤つけアツセイによる运动性の测定法〔J〕.见：入村达郎主编.がんの浸润.转移研究マニユアル.第一版.京都：金芳堂株式会社，1994；120
[5]Zuker S, Mancuso P, Dimassimo B, et al. Comparison of techniques for measurement of gelatinases/type Ⅳ collagenases;enzyme-linked immunoassays versus substrate degradation〔J〕. Clin Exp Metastasis,1994,12:13
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[6]Albini A, Iwamoto Y, Kleinman HK, et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells〔J〕. Cancer Res,1987,47:3239
[7]Saiki I, Murata J, Watanabe K, et al. Inhibition of tumor cell invasion by Ubenimex(bestatin) in vitro〔J〕. Jap J Cancer Res,1989,80:873
[8]Aznavoorian S, Murphy AN, Stetler-Stevenson WG, et al. Molecular aspects of tumor cell invasion and metastasis〔J〕. Cancer 1993,71:1368
, 百拇医药
[9]史宏男，何荣根，周晓健.涎腺腺样囊性癌高转移细胞克隆株Acc-M体外移动性和粘附性的试验观察〔J〕.口腔颌面外科杂志，1996，3：176
[10]李红梅，方伟岗，郑杰.不同转移潜能的人肿瘤细胞系金属蛋白酶活性分析〔J〕.中华病理学杂志，1998，10：341
[11]Liotta LA. Tumor invasion and metastases-role of the extracellular matrix〔J〕. Cancer Res,1986,46:1
(收稿日期：1999-11-09；修回日期：2000-04-05), http://www.100md.com
单位：毛立民 侯艳蓉(哈尔滨医科大学第一临床医学院 哈尔滨 150001)；于世凤(北京医科大学口腔医学院)于世凤(北京医科大学口腔医学院)；毛立民 侯艳蓉(哈尔滨医科大学第一临床医学院 哈尔滨 150001)
关键词：腺样囊性癌；肿瘤侵袭；粘附性；运动性；胶原酶
肿瘤000609
摘要：目的 研究转移潜能不同的两个腺样囊性癌细胞系体外侵袭能力的差异。方法 选用肺低转移细胞系Acc-2和从中筛选出的肺高转移细胞系Acc-M，利用MTT法检测与几种基底膜成分的粘附能力；划痕法检测运动能力；PAGE底物酶谱法检测分泌Ⅳ型胶原酶的能力； 改良勃顿小室法观察对重组基底膜的侵袭能力。结果 ①1小时后Acc-2细胞系对3种细胞外基质的粘附率分别是纤维粘连蛋白(FN)61.8 %、层粘连蛋白(LN)42.9 %和基底膜胶(Matrigel)60.4 %，Acc-M细胞系的粘附率分别是FN 79.4%、LN 71.1%、Matrigel 69.8%。②12小时终止实验时，测定Acc-2细胞系和Acc-M细胞系的运动速度分别是1.15 μm/h和2.26 μm/h。③Acc-M细胞系的培养上清中可以检测到Ⅳ型胶原酶活性，而Acc-2细胞系的培养上清中检测不到Ⅳ型胶原酶活性。④8小时终止实验时Acc-2细胞系和Acc-M细胞系对重组基底膜的侵袭率分别是68.0±4.35和103.2±5.63。结论 两个腺样囊性癌细胞系的异质型粘附能力、运动能力、分泌Ⅳ型胶原酶的能力及侵袭重组基底膜能力明显不同，并与其转移潜能的强弱相一致。
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中图分类号：R73-34 文献标识码：A 文章编号：1000-7431(2000)06-0419-04
COMPARATIVE STUDY OF INVASION POTENTIALS IN VITRO WITH TWO HUMAN SALIVARY ADENOID CYSTIC CARCINOMA CELL LINES
MAO Li-min YU Shi-feng
School of Stomatology,Beijing Medical University, Beijing 100081,P.R.China
HOU Yan-rong
School of Stomatology,Haerbin Medical University, Haerbin 15001,P.R.China
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Abstract：Objective To investigate the invasion ability in vitro of two human salivary adenoid cystic carcinoma cell lines with different metastatic potentials.Methods The Acc-2 cell line with low lung metastatic potential and the Acc-M cell line (selected from the Acc-2 cell line) with high lung metastatic potential were used. The adhesive ability to various basement membrance components of the two cell lines was measured by MTT assay, the cell locomotive ability by wound assay, the type Ⅳ collagenase was assessed by PAGE substrate zymography, and the invasion ability by modified Boyden chamber.Results ①The adhesive rates of Acc-2 cell line after 1 h were FN 61.8%、LN 42.9%、MG 60.4 %，and that of Acc-M cell line were FN 79.4%、LN 71.1%、MG 69.8% respectively.②In the wound assay, after 12 hr the locomotive rates of Acc-2 and Acc-M were 1.15 μm/h and 2.26 μm/h.③The type Ⅳ collagenase activity was detected in serum-free supernatant of Acc-M cell line, whereas the Acc-2 cell line was lack of type Ⅳ collagenase activity.④Eight hours after the invasion of the basement membrance matrix, the number of invading cells in high power field of Acc-2 and Acc-M were 68.0±4.35 and 103.2±5.63. Conclusion The results showed that the invasion of Acc-2 and Acc-M was progressive in nature and the heterogeneous adhesive ability,motility,type Ⅳ collagenase activity and invasive capability of these two variants were significantly different and correlative with their metastatic potential.
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Key words： Adenoid cystic carcinoma; Neoplasm invasion; Adhesive ability; Locomotive ability, collagenase
侵袭性和转移性是癌细胞最主要的生物学特性，也是恶性肿瘤的重要标志。根据肿瘤异质性理论[1]，在一个原发性恶性肿瘤细胞群中，存在着转移潜能不同的细胞亚系。阐明不同亚系的侵袭性与转移潜能的关系，不但有利于对侵袭、转移机制的了解，还可用于制定合理的肿瘤治疗方案及筛选有效的抗肿瘤侵袭、转移药物。腺样囊性癌是涎腺常见的恶性肿瘤，其特征之一就是易侵犯邻近组织和向远隔脏器转移。本研究利用腺样囊性癌Acc-2细胞系和从中筛选出的肺高转移性Acc-M细胞系，对其体外的异质型粘附能力、运动能力、分泌Ⅳ型胶原酶能力及侵袭重组基底膜能力进行了定量分析，探讨了两者体外侵袭能力与其转移潜能的相关性。
材料与方法
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一、细胞株 腺样囊性癌Acc-2和Acc-M细胞系由上海第二医科大学口腔医学院建立，Acc-2细胞系裸鼠尾静脉二次注射后肺转移率为18 %，Acc-M细胞系裸鼠尾静脉一次注射后肺转移率为96%[2]。
二、试剂及仪器 纤维粘连蛋白(fibronectin FN)、层粘连蛋白(laminin LN)由北京医科大学细胞生物学教研室提供；人工基底膜胶(Matrigel)为Collaborative Biomedical产品；牛血清白蛋白(BSA)由北京军区兽医防治中心生物工程研究室提供；二甲基亚砜(DMSO)为北京化工厂产品；四氮唑盐(MTT)为Fluka产品；无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯(PVPF)滤膜，孔径12.0 μm，为Nucleopore产品；24孔Transwell细胞培养小室(Transwell cell culture chamber)为Costar产品；酶标仪(日本产，BID-RAD 550型)。
三、MTT法检测与细胞处基质的粘附能力 于96孔板每孔中分别加入含有FN、LN和Matrigel 2 μg的RPMI 1640培养液50 μl，室温干燥后，再加入20 μl含3%BSA的RPMI 1640培养液重层封闭，放入37 ℃细胞培养箱中1 h，用PBS冲洗后，将每ml含有8×105个细胞的0.1% BSA-RPMI 1640细胞悬液每孔加入100 μl，再次放入培养箱中1 h，用翻板法去掉培养基，每孔加入200 μl PBS，置平板摇床60 r/min振摇10 min，去除PBS和未粘附的细胞，每孔加MTT 40 μg，培养箱中放置4 h后，去除MTT，用纸巾吸尽残留液，每孔加入200 μl DMSO，用酶标仪在570 nm处测定，打印吸光度值。
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四、划痕法(wound assay)细胞运动性测定[3，4] 取无菌24孔板，先将底面外侧用细记号笔每孔做三条纵行测量标记线，再将FN用灭菌PBS按10 μg/ml稀释，每孔加入300 μl，室温放置1 h后用PBS轻洗2次。细胞消化离心后，用培养液按2.5 ×105/ml稀释，每孔加入细胞悬液400 μl，轻轻晃动培养板使细胞分布均匀。放入培养箱中5 h细胞贴壁后，用细胞刮子于孔内侧底面的中部划一条宽度相等的横行细胞刮除带。吸掉含有刮除的游离细胞的培养液，每孔加入新的培养液400 μl，于倒置显微镜下在刮除细胞带与标记线相交处拍照。然后放入培养箱中培育，每隔3 h观察1次，待细胞运动至即将汇合时用戊二醛固定，龙胆紫染色。划痕后当时每孔测定3处距离a、b、c，细胞运动后于同一位置测定的距离为a′、b′、c′，按以下公式计算出移动距离，并计算出运动速度。
五、PAGE明胶底物法测定Ⅳ型胶原酶活性[5] 24孔培养板中加入5×104个待测细胞，以无血清的RPMI 1640培养液200 μl培养2天后收集上清，2500 r/min离心10 min，沉淀细胞碎片。计数孔中的细胞数，按105个细胞量折算培养上清的电泳上样量。冰浴下电泳6～8 h后，分离胶以2.5 % Trition X-100洗脱SDS，用胶原酶缓冲液于37 ℃温育16 h，凝胶用考马斯亮蓝R250染色液染色，脱色液褪色至合适，测定时以人纤维肉瘤细胞HT-1080作为阳性对照，最后用激光光密度计在633 nm处测定电泳条带的积分吸光度值。
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六、改良勃顿小室法(modified boyden chamber)侵袭重组基底膜实验[6，7] 将PVPF滤膜光泽面向上贴于Transwell细胞培养小室底面，风干：在膜的外表面涂趋化剂FN 5 μg (10 μl)，待全干燥后再于膜的内表面涂Matrigel 5 μg (10 μl)，再次干燥后，将处于对数增殖期的Acc-2和Acc-M 细胞用EDTA消化、离心后，悬浮于含0.1 % BSA的RPMI 1640培养液中，最终浓度为2×106/ml，于每个Transwell上室内加入100 μl；再将整个Transwell放入含0.1% BSA的RPMI 1640培养液600 μl的24孔板内，置37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，分别于4、6、8 h取出，将滤膜用甲醇固定，HE染色，用棉签仔细擦掉位于膜内表面的未穿过膜的细胞后封片，于400 倍光学显微镜下每膜计数5个视野的侵袭细胞数，计算出每视野侵袭细胞的平均值。
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一、与细胞外基质的粘附能力
两个细胞系对FN、LN、Matrigel的粘附性各不相同，Acc-M细胞系对三种细胞外基质的粘附能力均强于Acc-2细胞系，经统计学检查FN粘附能力对差别有显著性，对LN有高度显著性(见表1)。
表1 两个腺样囊性细胞系对三种细胞外基质的粘附能力 细胞外基质
吸光度值
粘附率%
Acc-2
Acc-M
Acc-2
Acc-M
FN
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0.966±0.072
1.249±0.122
61.8
79.4
LN
0.768±0.055
1.100±0.022**
49.2
71.1
MG
0.943±0.057
1.089±0.088
, 百拇医药
60.4
69.8
注：用未经震荡冲洗条件下Acc-2粘附细胞的吸光度值1.564±0.075和Acc-M粘附细胞的吸光度值1.648±0.050作为对照计算粘附率，P<0.05，**P<0.01。
二、细胞株的运动能力
Acc-M细胞株运动能力强于Acc-2细胞株，于划痕后12 h终止实验时，Acc-M细胞株运动距离为27.12±3.85 μm；Acc-2细胞株运动距离为13.8±2.71 μm；其运动速度分别为2.26 μm/h和1.15 μm/h。
三、细胞培养上清中Ⅳ型胶原酶活性测定
结果显示，低转移的Acc-2细胞系不能产生Ⅳ型胶原酶，而高转移的Acc-M细胞株可产生92 kD和72 kD的两种Ⅳ型胶原酶，其中72 kD的Ⅳ型胶原酶活性较高。Acc-M细胞系分泌的Ⅳ型胶原酶仅略低于作为阳性对照的人纤维肉瘤HT-1080细胞系(见表2)。表2 Acc-M细胞系培养上清中Ⅳ型胶原酶活性(与HT-1080细胞比较) 细胞系
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Ⅳ型胶原酶
类型
积分吸光度值
体积
高度
面积
Acc-M
92kD
50146
15
789
72kD
76691
, 百拇医药
29
1151
HT-1080
902kD
77652
86
773
72kD
107779
177
1020
四、侵袭重组基底膜的能力
两个细胞系均具有侵袭重组基层膜的能力，但经侵袭后4、6、8 h三次计数侵袭细胞数，显示出转移潜能较高的Acc-M细胞系，其侵袭重组基底膜的能力也较强，其差异有高度显著性(见表3)。表3 两个腺样囊性癌细胞系侵袭重组基底膜能力 侵袭时间
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侵袭细胞数(个/视野)
t值
P值
Acc-2
Acc-M
4 h
26.4±3.20
39.8±3.42
5.713
<0.01**
6 h
53.2±3.70
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82.4±5.85
8.429
<0.01**
8 h
68.0±4.35
103.2±5.63
9.887
<0.01**
注：**差异有高度显著性
讨 论
肿瘤细胞的移位运动是指从瘤体组织表面脱离下来后，通过伪足活动牵引整个细胞移位。在肿瘤转移过程中，瘤细胞侵入基底膜和邻近组织、进入血循环、穿出血管壁进入继发部位等阶段，其运动性都是必不可少的生物学性能，因而，在克隆细胞株相互对照研究中，检测肿瘤细胞主动移行的能力，对研究肿瘤细胞侵袭和转移机制有重要作用。本研究表明，高转移的Acc-M细胞株的运动能力强于低转移的Acc-2细胞株，这与史宏男等[9]应用自制的改良Boyden小室法观察到的结果相似，说明肿瘤细胞运动性强弱也与其转移潜能成正相关。
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从原位的增殖性肿瘤到侵袭转移癌的演进过程中，肿瘤细胞还必须具备降解细胞外基质的能力。Ⅳ型胶原是细胞外基质的重要组成部分，而Ⅳ型胶原酶是一种能够降解Ⅳ型胶原的特异的蛋白水解酶，其活性是影响肿瘤侵袭和转移的重要因素之一。李红梅等[10]应用明胶酶谱法分析了不同转移潜能的人肿瘤细胞系金属蛋白酶活性，发现转移能力相对较高的细胞系产生金属蛋白酶的能力强于转移能力相对较低者。本实验结果显示，低转移的Acc-2细胞系不能产生Ⅳ型胶原酶，而高转移的Acc-M细胞系则分泌较高水平的Ⅳ型胶原酶，由此说明，肿瘤细胞侵袭转移的潜能与其产生Ⅳ型胶原酶的能力密切相关。
本实验应用的肿瘤侵袭重组基底膜模型中使用的基底膜胶(Matrigel)是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成份，含有LN、Ⅳ型胶原，接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在PVPF滤膜上，能在细胞培养基中重建形成膜结构，这种结构与天然基底膜结构极为相似，滤膜膜孔均被基底膜胶复盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，变形运动才能从一侧侵袭到另一侧，这与体内情况较为相似。Albini[6]等观察到正常细胞不能穿过这种重组基底膜，而肿瘤细胞穿过重组基底膜的能力与它体内侵袭能力表现出较好的相关性，并可用于体外观察药物对肿瘤细胞侵袭能力的影响。Liotta[11]对肿瘤侵袭通过基底膜过程提出了三步骤理论，第一步骤是癌细胞粘附到基质，该过程可被特殊的粘附因素所调节，第二步骤是癌细胞运动至基底膜表面，其运动方向受趋化因素的影响；第三步骤是癌细胞通过分泌水解酶降解基底膜。这说明癌侵袭是一个综合性过程，它必须以粘附为前提，以运动功能为动力，以分泌降解酶打开通路。
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侵袭和转移是恶性肿瘤行为中的两种表型，两者有密切联系，但又有各自的特点。侵袭和转移是一个过程中的两个阶段，侵袭是转移的前奏，转移是侵袭的后果。本文应用低转移腺样囊性癌细胞系和从中筛选出的高转移细胞系的体外侵袭实验结果显示，转移潜能高的克隆细胞系其异质性粘附能力、运动能力、分泌Ⅳ型胶原酶能力和侵袭重组基底膜能力均高于转移潜能低者，显示出体外侵袭性与转移潜能呈正相关，这对于了解腺样囊性癌的侵袭转移机制和选择有效的抗侵袭、抗转移的治疗方法具有重要意义。
毛立民，男，医学博士，副教授。
参考文献
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[9]史宏男，何荣根，周晓健.涎腺腺样囊性癌高转移细胞克隆株Acc-M体外移动性和粘附性的试验观察〔J〕.口腔颌面外科杂志，1996，3：176
[10]李红梅，方伟岗，郑杰.不同转移潜能的人肿瘤细胞系金属蛋白酶活性分析〔J〕.中华病理学杂志，1998，10：341
[11]Liotta LA. Tumor invasion and metastases-role of the extracellular matrix〔J〕. Cancer Res,1986,46:1
(收稿日期：1999-11-09；修回日期：2000-04-05), http://www.100md.com